发明内容
本发明的目的在于提供一种能够显著提高目的蛋白产量的制备重组纤溶酶原的发酵工艺。
本发明提供了一种制备重组纤溶酶原的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)种子活化与扩增:将表达重组纤溶酶原的毕赤酵母工程菌活化,扩增,得到种子液;
(2)发酵:将步骤(1)的种子液接种至发酵培养基,进行发酵培养,当发酵液中细胞湿重大于等于180g/L,同时溶解氧大于等于100%时,加入诱导剂进行诱导,同时加入由质量比为1:(1~4)的酵母粉和蛋白胨组成的氮源,诱导表达35~75小时,终止发酵;
(3)收集发酵上清,分离提纯得到重组纤溶酶原。
进一步地,所述重组纤溶酶原为重组人奥克纤溶酶原,所述重组人奥克纤溶酶原具有如SEQ ID NO:1所示的N端氨基酸序列。
进一步地,步骤(1)中,所述种子液OD600值为5.0~15.0。
进一步地,步骤(2)中,所述诱导剂为甲醇,甲醇的加入量为发酵培养基体积的40-74%;所述氮源由质量比为1:2的酵母粉和蛋白胨组成;所述氮源的加入量为发酵培养基体积的2.5-4.25%;所述诱导表达的时间为52~54小时。
进一步地,步骤(2)中,在加入诱导剂的同时还加入了终浓度为0.01~0.2mol/L的赖氨酸类似物。
进一步地,所述赖氨酸类似物的终浓度为0.1mol/L,赖氨酸类似物为氨甲环酸。
进一步地,步骤(2)中,所述种子液与发酵培养基的体积比为(1~15):100,发酵培养的温度为28~32℃,pH=2.5~5.5,溶解氧≥8%;优选的,所述种子液与发酵培养基的体积比为(3~10):100,发酵培养的温度为30.0±1.0℃,pH=5.0±0.5,溶解氧≥10%。
进一步地,当发酵液中溶解氧大于等于100%时补加碳源,待发酵液中细胞湿重大于等于180g/L时,停止补加碳源,继续发酵直至发酵液中的溶解氧再次大于等于100%。
进一步地,所述细胞湿重为180~220g/L;
所述补加的碳源为甘油,优选为50%甘油,所述甘油的加入量为发酵培养基体积的3%-8.3%。
本发明还提供了一种制备重组纤溶酶的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)按照上述的方法制备重组纤溶酶原;
(ii)利用纤溶酶原激活剂对步骤(i)得到的重组纤溶酶原进行酶切,得到重组纤溶酶。
进一步地,所述纤溶酶原激活剂为链激酶、葡激酶、尿激酶中的一种或多种。
本发明中,如无特别说明,所述的溶液中的溶剂为水。
与现有技术相比,本发明的发酵工艺取得了以下有益效果:
1、本发明的发酵工艺能够显著提高重组人奥克纤溶酶原的表达量,有效提高目的蛋白的产量。
2、本发明的发酵工艺还能减少发酵上清中重组人奥克纤溶酶原的降解,进一步增加目的蛋白的产量。氨甲环酸作为一种结构与赖氨酸高度相似的赖氨酸类似物,能够与蛋白水解酶上的赖氨酸结合位点结合,竞争性地抑制发酵上清中纤溶酶原的降解,在一定程度上提高发酵上清中目的蛋白的产量。
3、本发明的发酵工艺缩短了诱导时间,降低了生产成本,该工艺操作简单,适合工业化生产。
4、按照本领域公知的方法进一步利用纤溶酶原激活剂对本发明制得的重组人奥克纤溶酶原进行酶切反应,纯化即可得到活化的重组人奥克纤溶酶。因此,本发明的方法还能够有效提高重组人奥克纤溶酶的产量。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品,通过购买市售产品所得。
本发明实施例采用的工程菌是表达重组人奥克纤溶酶原的工程菌,该工程菌是按照基因工程领域常规方法构建的,构建方法如下:采用基因工程技术,将合成的编码基因片段克隆入表达载体pPICZαA中构建形成重组表达载体;然后将重组表达载体转化到大肠杆菌DH5α中扩增培养,采用试剂盒提取重组表达载体;重组表达载体经过线性化,进一步纯化后,采用电击转化入感受态酵母宿主Pichia Pastoris X33中,得到目的基因整合到酵母基因组中的重组工程菌;经筛选得到稳定、高表达的工程菌。
本发明采用的YPD、BMGY及BSM培养基为市售培养基,
YPD:酵母浸出粉胨葡萄糖培养基。
YP溶液的组成为:酵母粉50g/L,蛋白胨100g/L。
50%甘油指体积浓度为50%的甘油水溶液。
底物显色法检测目的蛋白活性的方法如下:尿激酶(Urokinase,UK)是一种纤溶酶原激活剂,它能将纤溶酶原激活为纤溶酶,纤溶酶对赖氨酸具有高度的亲和性能并能裂解Lys-X位点,发色底物S-2403被纤溶酶水解后释放出游离的对硝基苯胺(pNA),pNA在415nm处有较高吸收峰。本发明通过检测pNA在415nm处的吸收峰来判断纤溶酶原的活性。
SDS-PAGE电泳检测方法如下:取1ml发酵上清液放入离心管中离心,然后取40ul离心上清放入1.5ml离心管,另加入20ul还原或非还原loading Buffer,100℃加热5分钟,取20ul样品进行电泳胶点样,150V电泳60分钟,对电泳胶进行染色脱色照胶。
实施例1:发酵重组人奥克纤溶酶原的工艺
本实施例的工艺步骤如下:
1、种子液制备
取工程菌甘油种子解冻,接种到BMGY培养基摇瓶中振荡培养后扩增,得到OD600值在5.0~15.0的种子液。
2、发酵罐发酵培养(32F171104批)
将上述制备得到的种子液接种到BSM基础培养基发酵(接种的种子液体积为BSM基础培养基体积的10%),培养温度30.0±1.0℃,控制发酵液pH在5.0±0.5,维持溶解氧(D.O)在10%以上。培养待发酵液中初始甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧上升至100%),补充初始发酵液体积3%的50%甘油,当发酵液中细胞湿重达到192g/L时,停止补加甘油。待发酵液中补加的甘油耗尽,加入甲醇进行诱导,甲醇的加入量为初始发酵液体积的40%,诱导的同时补加氨甲环酸至终浓度为0.1mol/L,并补加初始发酵液体积的2.5%的YP溶液,诱导52小时结束发酵。
上述“初始发酵液体积”即初始BSM基础培养基体积。
4、分离提纯
收集发酵上清,分离提纯得到重组人奥克纤溶酶原(样品编号为JZB32FE20170608批)。
上述分离提纯的方法为:将发酵上清在12000~15000g,2-8℃的条件下离心15~30min,然后将离心后的上清液过0.45μm孔径滤器进行过滤,将滤液进行混合模式层析:以MMC Mustang为层析填料作为层析填料,上样样品满足:pH=6.0,电导不高于16mS/cm,保留时间2min。上样后,依次以18%B(180mmol/L NaCl)淋洗3-9CV,35%B(350mmol/L NaCl)洗脱,收集目的蛋白。
所得重组人奥克纤溶酶原的N端氨基酸序列为:APSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQ(SEQ ID NO:1)。
实施例2:发酵重组人奥克纤溶酶原的工艺
本实施例的工艺步骤如下:
1、种子液制备
取工程菌甘油种子解冻,接种到BMGY培养基摇瓶中振荡培养后扩增,得到OD600值在5.0~15.0的种子液。
2、发酵罐发酵培养(32F171105)
将上述制备得到的种子液接种到BSM培养基发酵(接种的种子液体积为BSM基础培养基体积的10%),培养温度30.0±1.0℃,控制发酵液pH在5.0±0.5,维持D.O在10%以上。培养待发酵液中初始甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧上升至100%),补充初始发酵液体积6.25%的50%甘油,当发酵液中细胞湿重达到180g/L时,停止补加甘油。待发酵液中补加的甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧再次上升至100%),加入甲醇进行诱导,甲醇的加入量为初始发酵液体积的62.5%,诱导的同时补加氨甲环酸使之终浓度为0.1mol/L,同时补初始发酵液体积的4.25%的YP溶液。诱导53小时结束发酵。
上述“初始发酵液体积”即初始BSM基础培养基体积。
3、分离提纯
收集发酵上清,分离提纯得到重组人奥克纤溶酶原。分离提纯方法同实施例1。
实施例3:发酵重组人奥克纤溶酶原的工艺
1、种子液制备
取工程菌甘油种子解冻,接种到BMGY培养基摇瓶中振荡培养后扩增,得到OD600值在5.0~15.0的种子液。
2、发酵罐发酵培养(32F171106)
发酵基础培养基为BSM培养基,培养温度30.0±1.0℃,控制发酵液pH在5.0±0.5,维持D.O在10%以上。培养待发酵液中初始甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧上升至100%),补充初始发酵液体积8.3%的50%甘油,当发酵液中细胞湿重达到185g/L时,停止补加甘油。待发酵液中补加的甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧再次上升至100%),加入甲醇进行诱导,甲醇的加入量为初始发酵液体积的74%,诱导的同时补加氨甲环酸使之终浓度为0.1mol/L,同时补初始发酵液体积的3.8%的YP溶液。诱导54小时结束发酵。
上述“初始发酵液体积”即初始BSM基础培养基体积。
3、分离提纯
收集发酵上清,分离提纯得到重组人奥克纤溶酶原。分离提纯方法同实施例1。
以下为对实施例1-3发酵工艺的测试结果。结果见表1、图1、图2、图3及图4。表1中,32F171104、32F171105、32F171106批开始诱导时对应的培养时间分别为24.5小时、24小时、25小时。
表1:实施例1-3发酵过程OD600值和活性检测数据
由上表1数据及图1、图2、图3及图4结果可知,本发明发酵培养工艺多批生产目均能得到目的蛋白,且目的蛋白的表达量稳定,检测发酵液最终活性均大于200μg/mL(即3480IU/mL),其中32F171106批次的终点活性达320ug/mL(即5568IU/mL)。
实施例4:制备重组人奥克纤溶酶的工艺
发酵表达的目的蛋白为重组人奥克纤溶酶原,经葡激酶(SAK酶)在酶原Arg(19)-Val(20)处进行特异性的酶切,使酶原变为有活性的重组人奥克纤溶酶。以实施例1制得的重组人奥克纤溶酶原溶液为原料,用葡激酶进行酶切反应,纯化得到活化的重组人奥克纤溶酶。步骤如下:
(1)将重组人奥克纤溶酶原溶液通过阳离子层析柱,得含有重组人奥克纤溶酶原的洗脱液;
(2)将氨甲环酸加入所述洗脱液,并加入葡激酶进行酶切反应,得初级酶切液;
(3)将所述初级酶切液通过疏水层析柱,得到纯化后的重组人奥克纤溶酶溶液。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1:发酵诱导过程中添加氨甲环酸对目的蛋白活性的影响
1、实验方法
(1)对比例1发酵工艺:
取238冻存菌液以YPD培养基活化过夜,得种子液,OD600值为1.597。接种1.56mL种子液至25mLBSM培养基,摇床培养,培养18h后,将菌液离心取沉淀以25mL BSM培养基重悬,并添加0.5%甲醇培养,培养75h时结束培养,取样检测活性分析。
(2)JZB32FE20170104批发酵工艺:
取工程菌甘油种子解冻,接种到BMGY培养基摇瓶中振荡培养后扩增,得到OD600值在5.0~15.0的种子液,接种至BSM培养基发酵,培养控制为30.0±1.0℃,控制发酵液pH在5.0±0.5,D.O在10%以上,培养待发酵液中初始甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧上升至100%),补充初始发酵液体积的3.3%的50%甘油,当发酵液中细胞湿重达到185g/L时,停止补加甘油。待发酵液中补加的甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧再次上升至100%),开始流加甲醇进行诱导,甲醇的加入量为初始发酵液体积的50%,诱导的同时补加氨甲环酸使之终浓度为0.1mol/L,待细胞湿重达300~450g/L结束发酵,发酵过程检测活性数据和SDS-PAGE电泳衡量目的蛋白的表达。
2、实验结果
表2:JZB32FE20170104批发酵过程OD600值和活性检测数据
结果如表2、图5、图6和图7所示。实验结果显示:对比例1发酵工艺的发酵液上清酶活为2400IU/mL(即139.8μg/mL);JZB32FE20170104批发酵工艺在在对比例1的基础上,在诱导发酵过程中添加了氨甲环酸,其在发酵至74.3小时时,发酵液上清酶活达3676IU/mL,明显高于对比例1的发酵工艺。可见,在诱导过程中添加氨甲环酸能提高目的蛋白的活性。
实验例2:发酵诱导过程中氮源的选择对目的蛋白的表达和活性的影响
通过实验例1中JZB32FE20170104批目的蛋白活性和电泳图可知,目标蛋白在发酵后期出现降解,在此基础上,本发明进行以下实验,探索发酵诱导过程中氮源的选择对目的蛋白的表达和活性的影响。
1、实验方法
发酵基础培养基为BSM培养基,发酵罐发酵2批(分别编号为JZB32FE20170608、JZB32FE20170615),培养温度30.0±1.0℃,种子液OD600值在5.0~15.0,控制发酵液pH在5.0±0.5,维持D.O在10%以上。培养待发酵液中初始甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧上升至100%),开始流加50%甘油,甘油加入量为初始发酵液体积的3.3%,当发酵液中细胞湿重达到180~220g/L时,停止补加甘油。待发酵液中补加的甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧再次上升至100%),开始流加甲醇进行诱导,甲醇的加入量为初始发酵液体积的50%,诱导时添加氨甲环酸至终浓度0.1mol/L,并分别在JZB32FE20170608批次中流加YP溶液,JZB32FE20170615批次流加硫酸铵,YP溶液或硫酸铵加入量为初始发酵液体积的3.5%,待细胞湿重达300~450g/L结束发酵,收集发酵上清,以检测的目的蛋白的活性数据和SDS-PAGE电泳衡量来衡量目的蛋白的表达。
2、实验结果
实验结果见表3、图8、图9及图10。表3:添加硫酸铵或YP发酵过程OD600值和活性检测数据
可以看出,与实验例1的JZB32FE20170104批数据相比,JZB32FE20170608(添加YP)批在诱导发酵过程中添加YP溶液能够有效提高目的蛋白活性。
另外,与发酵诱导过程中添加硫酸铵(JZB32FE20170615批)相比,与发酵诱导过程中添加YP(JZB32FE20170608批)的发酵OD600值和目的蛋白的活性有显著的提高(活性高达6507IU/mL),目标蛋白表达量也有显著的提高。
上述实验结果表明,发酵诱导过程中添加YP比硫酸铵能更有效的提高目的蛋白的表达和活性。
实验例3:发酵pH对目的蛋白活性的影响
1、实验方法
参照实施例1的发酵工艺,区别仅在于将发酵液pH从发酵液pH在调整为7.0或3.0。分别检测不同pH条件下目的蛋白的表达和活性。
2、实验结果
结果显示,发酵液pH为7.0时,目的蛋白的活性较低,最大不超过500IU/mL;发酵液pH为3.0时,目的蛋白的活性最大不超过2000IU/mL,且在发酵诱导后期活性大幅度下降。
上述实验结果表明,在pH为5.0±0.5时发酵培养能够有效提高目的蛋白的表达和活性。
实验例4:接种OD600对目的菌种生长及蛋白活性表达的影响
参照实施例1的发酵工艺,改变接枝种子液的OD600值,观察菌种生长情况。结果显示,接种OD600值太小会导致菌种生长不起来,种子液OD600值在5.0~15.0有利于后续菌种的生长和目的蛋白的表达。
综上,本发明提供了一种制备重组人奥克纤溶酶原的方法。实验结果表明,本发明的发酵工艺不仅能够显著提高发酵上清中重组人奥克纤溶酶原的表达量,还能减少发酵上清中重组人奥克纤溶酶原的降解,有效提高目的蛋白的产量。本发明的发酵工艺操作简单,成本较低,适合工业化生产。
SEQUENCE LISTING
<110> 景泽生物医药(合肥)有限公司
上海景泽生物技术有限公司
成都景泽生物制药有限公司
<120> 一种制备重组人奥克纤溶酶原的制备方法
<130> GYKH1285-2021P0114027CC
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys
1 5 10 15
Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro
20 25 30
Trp Gln