CN109942700A - 一种重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体以及胰蛋白酶亲和材料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂BTI突变体，命名为e‑BTI，其特征在于，根据BTI的基因序列，设计突变引物，对BTI的S41T以及P44T位点进行突变得到。本发明制得的e‑BTI热稳定性明显高于BTI，而且显示出优异的和胰蛋白酶的特异亲和性。可以采用所述e‑BTI制备胰蛋白酶亲和材料用于分离、提纯和鉴定胰蛋白酶。本发明采用简单的方法制得重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体e‑BTI，并且采用其突变体得到的胰蛋白酶亲和材料对胰蛋白酶的选择性吸附高、非选择性吸附低，利用不同洗脱液对胰蛋白酶吸附和分离，经过一步纯化便可得到高纯度的目的胰蛋白酶，最终纯化得到的胰蛋白酶具有高的催化活性。

Description

一种重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体以及胰蛋白酶亲和 材料

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种胰蛋白酶抑制剂突变体以及胰蛋白酶亲和材料。

背景技术

胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca²⁺的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶作为蛋白酶的一种，不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶，在测定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。此外胰蛋白酶还有抗炎症作用，临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。还可用于治疗毒蛇咬伤，也常用于动物细胞培养前对组织的处理。

在动物胰脏中含有大量的胰蛋白酶，大多数以酶原非活性的形式存在，经胰蛋白酶激活后形成具有活性的酶，此外在动物胰脏中大部分的酶为丝氨酸蛋白酶家族，特别是糜蛋白酶原与胰蛋白酶原的理化性质相近，难以将二者分离。目前国际上通用的动物组织提取药用蛋白工艺是基于传统的盐析、沉淀等方式，这种工艺提取特异性差，操作过程目标产品损失大，产品活性低。目前市场上的通用纯化介质和纯化技术，如超滤、分子筛凝胶层析、离子交换凝胶层析、疏水凝胶层析等技术，由于这些纯化介质和方法的纯化效率低、往往需要多介质与多个步骤组合才能达到产品质量要求，难以形成产业化。目前虽然有牛和猪来源的胰蛋白酶已经商业化，然而，胰蛋白酶在自然界很多物种中普遍存在，其性质不尽相同，可用于不同领域。如哺乳动物来源的胰蛋白酶最适作用温度多为50℃左右，在低温(如低于20℃)时活性较低，而某些深海生物来源的胰酶最适作用温度为20℃左右。在某些技术领域，如食品或药品加工制造领域，需要低温催化，可减少热能消耗、更多地保留热敏营养成分或减少副产物的生成等。因此若能制备胰蛋白酶亲和材料，可有效分离得到许多未知酶类，开拓新型酶的研究与应用，具有巨大的科研意义和市场前景。

亲和层析是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术，如酶和酶抑制剂之间有一种特殊的亲和力，在一定条件下，它们能紧密地结合成复合物。如果将复合物的一方固定在不溶性载体上，则可从溶液中专一地分离和提纯另一方。与其他纯化方法相比，亲和层析能产生相当高的纯化作用。另外，此法的优点是迅速，有时仅一步即可达到纯化的目的。将酶抑制剂固定做成亲和层析材料特异吸附纯化对应的酶是一种有效可行的方法。然而，亲和层析支持物需满足非特异性吸附低，纯度高，亲和作用力强，稳定性好等特点，寻找合适的抑制剂是制备酶亲和材料首要关键问题。

专利文献CN201810669013.6公开了一种胰蛋白酶抑制剂及其制备方法，其是以太子参为原料，经过粗提、分级沉淀和柱层析制备得到。但一方面太子参作为原料价格昂贵，不适于工业化的生产，而且温度对其蛋白抑制活性影响较大，80℃以上时，残留抑制率就有较大程度的下降。专利201410440706.X公开了一种应用毕赤酵母分泌表达牛胰蛋白酶的方法，该方法避免了形成包涵体，省去变性和复性过程，可直接从培养基中获得酶原，通过肠激酶酶切，再经纯化等步骤得到了高活力的牛胰蛋白酶，但由于牛胰蛋白酶原分子量较大，分泌量有限，故最终获得酶含量较低。专利文献CN 201610973326.1公开了一种重组牛胰蛋白酶抑制剂突变体及其制备方法，但是其制备方法繁复，而且重复性不好，其作为胰蛋白亲和材料的前景不被看好。

因此，开发一种具有特异性结合、热稳定性良好的胰蛋白酶抑制剂，并以此为基础的胰蛋白亲和材料具有重要的实际意义和商业价值。

发明内容

针对上述现有技术的缺陷，本发明的目的之一是提供一种胰蛋白酶抑制剂突变体，其是荞麦胰蛋白酶抑制剂为基础，设计突变引物。荞麦胰蛋白酶抑制剂通过与胰蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合，使酶的活力下降甚至消失，可专一性抑制胰蛋白酶的活性。目前，通过基因工程手段已获得了重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂(buckwheat trypsininhibitor,BTI)。BTI由69个氨基酸组成，分子量小，在结构分析及重组表达等方面具有独特优势。另外，BTI具有较好的稳定性,是研究蛋白质构效关系的理想材料。在此基础上，通过定点突变等手段，获得稳定性好、亲和力强的新型抑制剂，可用于制备纯化胰蛋白酶的亲和材料。

所述BTI具有如下的氨基酸序列SEQ.2：

具体而言，本发明提供一种重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂BTI的突变体，命名为e-BTI，所述突变体的氨基酸序列包含以下至少一个突变：41和44位突变，并且与重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂BTI的氨基酸序列SEQ.1具有80％以上的同源性。

进一步的，所述突变体e-BTI至少包括以下突变中的一种：S41T和P44T，并且与氨基酸序列SEQ.1具有90％以上的同源性；更为优选的，与SEQ.1具有95％以上的同源性。

更进一步的，所述突变体e-BTI具有如下的氨基酸序列SEQ.1：

本发明还提供了编码上述突变体e-BTI的核苷酸序列。

具体而言，所述突变体e-BTI的核苷酸序列优选为SEQ.3：

ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCCTGCGTCAGTGCTCCGGTAAACAAGAATGGCCAGAGCTCGTTGGAGAGAGAGGGTCCAAGGCTGCCAAGATCATCGAAAACGAGAACGAAGACGTGCGAGCTATCGTCTTGCCTGAGGGTACCGCGGTGACTAGAGACCTCCGATGTGACCGTGTGTGGGTTTTCGTAGACGAGCGAGGAGTTGTTGTTGATACTCCTGTTGTTATGTGATAA。

进一步的，本发明还提供了一种包含上述突变体e-BTI的核苷酸序列的载体和工程菌。

所述载体没有特别的限定，只要能携带目的基因在工程菌中表达即可，在本发明优选实施方案中，选择pET或pQE作为载体质粒，优选为pQE30或pQE31。所述工程菌没有特别限定，只要能表达构象正确的目的蛋白的宿主即可，优选大肠杆菌，更优选为BL21(DE3)菌株或者M15菌株。

本发明还提供了所述重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体e-BTI的制备方法，包括以下步骤：

(1)、通过上述包含突变体e-BTI的核苷酸序列的载体构建BTI工程菌；

(2)、培养上述工程菌；

(3)、诱导胰蛋白酶抑制剂突变体e-BTI的表达；

(4)、e-BTI的纯化：收集菌体、破碎菌体、将上层清液纯化，冷冻干燥后得到所述重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体e-BTI。

优选的，步骤(1)中将前述表达载体转化大肠杆菌的转化方法在本领域是公知的，例如电穿孔法、CaCl₂转化法等。

优选的，步骤(2)中所述培养工程菌是用LB培养基振荡培养至对数生长期，振荡培养的条件是35-40℃，140-200r/min。进一步优选的，LB培养基中包含20-30μg/mL Kan和40-60μg/mL Amp。

优选的，步骤(3)中所述诱导宿主胰蛋白酶抑制剂突变体e-BTI表达蛋白的方法可采用本领域技术人员所公知的技术。在本发明优选的实施方式中，在诱导表达过程中，使用浓度为0.1μM至1μM的诱导剂IPTG，可以在10-17℃下进行低温诱导，使得目的蛋白更高效的表达，也可以在30-37℃进行诱导，使BTI的表达量最高。

优选的，步骤(4)中所述破碎菌体的方法包括高压匀浆、渗透压冲击、冻融、超声波破碎等；所述纯化步骤是采用Ni²⁺亲和层析柱，并通过梯度为20mM至300mM的咪唑溶液洗脱，最终得到所述重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体e-BTI。

本发明的再一个目的是提供一种胰蛋白酶亲和材料，包括上述突变体e-BTI和填料。

所述填料没有特别限定，只要是能和底物酶偶联结合的高分子生物填料即可，比如纤维素、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚酯或凝胶树脂；优选为琼脂糖凝胶FF，更优选溴化氰活化的琼脂糖凝胶。

一种上述胰蛋白酶亲和材料的制备方法包括以下步骤：

(1)、将e-BTI样品溶解于缓冲液中得e-BTI溶液；

(2)、吸取CNBr活化琼脂糖凝胶FF；

(3)、用上述缓冲液浸泡、洗涤、在摇床上振荡，e-BTI和填料进行偶联；

(4)、加入Tris-HCl用于封闭剩余的基团，得到偶联了e-BTI的填料即为所述胰蛋白酶亲和材料。

优选的，所述步骤(1)碳酸钠缓冲溶液为0.2-0.4M，pH为8-10，e-BTI样品和碳酸钠缓冲液的体积比为6-10:1；步骤(3)偶联反应的条件是20-30℃偶联6-10小时；步骤(4)中Tris-HCl的浓度为0.05-0.2M，反应时间为4-8小时。

本发明还提供了一种利用上述胰蛋白酶亲和材料分离胰蛋白酶的方法，包括以下步骤：

(1)、将上述胰蛋白酶亲和材料装于层析柱中，洗涤后连接于蛋白纯化系统，用缓冲液1平衡层析柱；

(2)、将含有胰蛋白酶的混合物上样于胰蛋白酶亲和材料的层析柱，收集未结合蛋白穿透峰组分；

(3)、充分洗脱未结合蛋白后，更换缓冲液2为洗脱液，收集洗脱峰组分即为胰蛋白酶；

其中缓冲液1能够使胰蛋白酶与亲和材料特异性结合，其pH为7.0-7.4；缓冲液2能够使胰蛋白酶从亲和材料解离下来，其pH为3.3-3.6。

在上述分离胰蛋白酶方法中，本发明优选的技术方案是步骤(1)中缓冲液1为TrisHCl和NaCl的混合溶液，pH为7.0-7.4，pH优选为7.1-7.3，混合溶液中Tris HCl浓度为15-30mM，优选为20-25mM，NaCl溶液浓度为40-70mM，优选为50-60mM；步骤(3)中缓冲液2为0.02-0.1M HAc-NaAc，pH3.3-3.6，优选为0.04-0.07M HAc-NaAc，pH3.4-3.5。

由于亲和材料和胰蛋白酶亲和作用的特异性，给蛋白的分离纯化提供了便利，经过一步纯化便可得到高纯度的目的蛋白。然而，由于配体与受体间较强的亲和力，如何选择合适的洗脱液是需要解决的问题，如果找不到可用的洗脱液，被分离对象不能从亲和材料上解离，就无法实现亲和材料的重复使用。即使可以洗脱目的分子，若洗脱条件太剧烈，破坏了分离对象的活性，这种方法也是不可取的。因此，在得到亲和材料的基础上，也需要对洗脱液的成分、pH进行筛选工作，选择出最合适的洗脱条件。

本发明人付出了大量创造性的劳动，相对于现有技术，取得了以下有益效果：

一、发明人经过大量实验，意料不到地发现，对BTI特定位点，即S41T以及P44T位点进行突变得到的重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体e-BTI，相比于BTI具有更好的热稳定性和对胰蛋白酶的亲和力，且非特异性吸附低，纯度高，适合作为胰蛋白酶亲和材料完成对胰蛋白酶的分离、提纯和鉴定。

二、本发明所得重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体e-BTI，仅对原氨基酸序列的两个位点进行突变，与原序列同源性在95％以上，很好的保证了底物和酶的特异性结合，试验重复性非常好。

三、在利用胰蛋白酶亲和材料对胰蛋白酶的分离、提纯中，经过大量实验筛选出适合的缓冲液作为平衡液和洗脱液，实现了胰蛋白酶亲和材料和胰蛋白酶的吸附和分离，经过一步纯化便可得到高纯度的目的胰蛋白酶，最终纯化得到的胰蛋白酶具有高的催化活性。

附图说明

图1是实施例2制备获得的e-BTI的SDS-PAGE电泳图谱。

图2是实施例2制备获得的e-BTI与未突变的BTI热稳定性对比。

图3是效果例2中胰蛋白酶亲和材料层析柱的紫外吸收曲线。

图4是胰蛋白酶活性分析，其中1：效果例2的穿透峰，2:0.2mg mL^-1胰蛋白酶，3：效果例2的洗脱峰。

图5是效果例2的SDS-PAGE电泳图谱，其中，Mr为Marker，泳道1为效果例2的穿透峰，泳道2为效果例2的洗脱峰。

图6是对比效果例1中替换了缓冲液1后的SDS-PAGE电泳图谱。

图7是对比效果例2的胰蛋白酶亲和材料层析柱的紫外吸收曲线。

图8是对比效果例2的SDS-PAGE电泳图谱。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中试剂和方法若无特殊说明，均为常规试剂和方法。

SDS-PAGE电泳图谱用15％分离胶，4％浓缩胶进行，考马斯亮蓝R-250染色，分析各洗脱峰的蛋白组成。

荞麦胰蛋白酶抑制剂BTI是从荞麦里面提取得到，克隆了基因，进行了原核表达及纯化。具体方法可以参考发明人在前的专利文献CN200510012385.4记载的方法制得。

琼脂糖凝胶FF购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

实施例1重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体工程菌的构建

按照TaKaRa Mutan BEST Kit说明书进行操作，以pQE30-BTI质粒为模板进行突变后，将突变产物转化至E.coilM15，进行测序验证，保存正确菌株，即为E.coli pQE30-e-BTI工程菌，具体步骤如下：

设计突变引物1(5’-TACCGCGGTGACTAGAGACCTC,SEQ 4.)及突变引物2(5’-CCCTCAGGCAAGACGATA,SEQ 5.),以pQE30-BTI质粒为模板,使用高保真DNA聚合酶ProbestDNA Polymerase，94℃热变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸5min,进行PCR扩增30个循环。对PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，对目的DNA片段进行切胶回收。取一定量DNA片段加入钝化缓冲液和钝化酶，37℃反应10min,将DNA片段5’末端磷酸化后，70℃水浴10min,灭活酶。加入连接缓冲液及DNA Ligase,16℃反应1h后，将反应液转化入M15感受态细胞中，用含Kan(25μg/mL)和Amp(50μg/mL)的双抗板筛选阳性克隆菌。挑选4管菌，测序，保存正确菌株。引物合成及测序由上海生工基因部完成。

实施例2重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体e-BTI的制备

取10μL实施例1中构建好的E.coli pQE30-e-BTI工程菌，加入到5mL LB培养基(含25μg/mL Kan和50μg/mL Amp)中，37℃振荡培养过夜后转接到50mL液体LB培养基(含25μg/mL Kan和50μg/mL Amp)中，37℃,180r/min振荡培养至对数生长期，再次将培养液转接到1LLB液体培养基(含25μg/mL Kan和50μg/mL Amp)中，37℃180r/min振荡培养至对数生长期，加入诱导剂IPTG(终浓度为0.4μM)，继续培养4h后，离心收集菌体。用20mmol/L pH 7.5的Tris HCl缓冲液洗涤菌体3次后，用100mL相同缓冲液将菌体重悬，冰浴条件下，用细胞破碎仪将大肠杆菌超声破碎，直至菌体悬浮液由黏稠变为透亮。将破碎后的菌液在80℃加热30min，12000r/min离心30min，收集上清。用Ni²⁺亲和层析柱纯化BTI。用缓冲液(20mM TrisHCl,500mM NaCl,20mM咪唑，pH7.5)平衡5个柱体积，将上清缓慢上样于Ni²⁺亲和层析柱，未结合蛋白流出形成穿透峰，待充分洗脱未结合蛋白后，更换缓冲液，提高咪唑浓度至80mM,继续洗脱杂蛋白，最后用300mM咪唑洗脱得到产品重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体e-BTI。用SDS-PAGE鉴定纯度，结果见图1，说明实施例1制得e-BTI达到电泳纯。

实施例3胰蛋白酶亲和材料的制备

(1)、将15mg e-BTI样品溶解于2mL 0.25M碳酸钠缓冲液中，pH9.0；

(2)、吸取1mL CNBr活化琼脂糖凝胶FF，用超纯水洗涤表面的溶剂，用上述缓冲液浸泡并洗涤；

(3)、将填料与e-BTI溶液在摇床上振荡，25℃偶联6-10小时；

(4)、加0.1M Tris-HCl,pH8.3,再反应6个小时封闭剩余的基团；

(5)、将偶联了e-BTI的填料装于柱中，然后分别用1M NaCl溶液和超纯水洗10个柱床体积，得到所述胰蛋白酶亲和材料。

效果例1 e-BTI和BTI的热稳定性测试

将纯化后的e-BTI和BTI分别在沸水浴中加热不同时间后，迅速冰浴5min后测定剩余胰蛋白酶抑制活性，进行热稳定性分析。结果如图2所示，e-BTI和BTI均有较好的热稳定性，在沸水浴中加热60min后，仍保持80％以上的胰蛋白酶抑制活力。e-BTI较BTI的稳定性明显提高，在煮沸100分钟时，BTI的剩余抑制活性为70.1％，而e-BTI仍保持81.7％的胰蛋白酶抑制活性。

效果例2亲和材料用于分离胰蛋白酶

将层析柱连接于蛋白纯化系统，用缓冲液1(Tris HCl 20mM，NaCl 50mM,pH 7.2)平衡层析柱至少5个柱体积，分别取0.5mL的牛血清白蛋白溶液(5mg/mL，溶剂为TrisHCl20mM，NaCl 50mM,pH 7.2)和0.1mL胰蛋白酶溶液(30mg/mL，溶剂为Tris-HCl 20mM，NaCl50mM,pH 7.2)，混合后迅速上样于亲和层析柱。控制流速为1mL min^-1,检测A280，收集未结合蛋白穿透峰组分。充分洗脱未结合蛋白后，更换缓冲液为洗脱缓冲液2(0.05M HAc-NaAc，pH3.5),收集洗脱峰组分。用SDS-PAGE进行鉴定，表明纯化后的胰蛋白酶表观纯度95％以上，达到了电泳纯。

图3是效果例2胰蛋白酶亲和材料层析柱的紫外吸收曲线，可以看出，在两种缓冲液洗脱时，均出现了蛋白峰，表明有一种蛋白在pH 7.2缓冲液的条件下未与亲和柱结合，另一种蛋白在此条件与亲和柱结合，但在pH 3.5缓冲液条件与柱解离，被洗脱出来。

效果例3胰蛋白酶活性测定

向3.2mL测活缓冲液(0.1M Tris-HCl,0.001M CaCl₂)中加入0.5mL待测样品，待测样品分别为1：效果例2中得到的穿透峰组分；2:0.2mg mL^-1胰蛋白酶；3：效果例2中得到的洗脱峰组分。37℃水浴加热5min后，加入胰蛋白酶底物N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺BApNA(0.15M，溶剂为二甲基亚砜)，37℃水浴继续保温10min后，加入0.5mL体积分数为33％的醋酸终止反应。以0.5mL洗脱缓冲液代替酶液调零，以0.2mg mL^-1胰蛋白酶为阳性对照组，测定各样品管410nm处的吸光度值(A410)，结果如图4及表1所示。

表1胰蛋白酶活性测定

胰蛋白酶催化底物反应，生成产物对硝基苯胺为黄色，产物越多，颜色越深。由图4中各管颜色变化可以看出，0.2mg mL^-1胰蛋白酶催化组溶液为淡黄色，穿透峰管无色，而经e-BTI亲和柱吸附后洗脱峰管为黄色，而且颜色明显深于0.2mg·mL^-1胰蛋白酶管。表明穿透峰中无胰蛋白酶活性，而0.2mg·mL^-1胰蛋白酶与洗脱峰组催化底物反应生成了对硝基苯胺，洗脱峰管颜色明显更深进一步说明洗脱峰里胰蛋白酶浓度高于0.2mg·mL^-1。表1的测定结果也表明，穿透峰中没有检测到胰蛋白酶活性，洗脱峰可以催化BApNA反应生成对硝基苯胺PNA，酶活力是0.2mg·mL^-1胰蛋白酶组的3.5倍以上。

效果例4胰蛋白酶SDS-PAGE鉴定

对效果例2的各组分进行SDS-PAGE的测试，结果如图5所示，其中Mr为Marker，泳道1为效果例2中穿透峰组分，泳道2为效果例2中洗脱峰组分。泳道1中只出现了牛血清白蛋白一条带，说明牛血清白蛋白未能与亲和材料结合，穿透峰中未见胰蛋白酶条带，说明在此条件下，即缓冲液为Tris HCl 20mM，NaCl 50mM,pH 7.2时，胰蛋白酶与亲和材料特异性结合。在泳道2只出现了胰蛋白酶的条带，未见牛血清白蛋白的条带，进一步表明亲和材料与胰蛋白酶是高度特异结合的。而且在此条件下，即缓冲液0.05M HAc-NaAc，pH3.5可以改变胰蛋白酶的构象，使得胰蛋白酶与e-BTI形成的复合物解离开来，从而胰蛋白酶可以从亲和柱上洗脱，实现亲和柱的反复多次使用。对洗脱的胰蛋白酶活性测定实验表明，在此条件下，胰蛋白酶并未失活，得到的是有活力的胰蛋白酶。

对比效果例1

亲和材料用于分离胰蛋白酶的方法与效果例2相同，区别在于缓冲液1为Tris-HCl20mM，NaCl 50mM,pH 5.0。

图6是对比效果例1的SDS-PAGE电泳图谱，图中泳道1为更换缓冲液pH为5.0后的穿透峰样品，在22.0k上方出现了一条较淡的蛋白条带，为胰蛋白酶，表明在此条件下胰蛋白酶与亲和材料的结合效果不好，部分胰蛋白酶未能与亲和柱结合。

另外，还进行了胰蛋白酶的活性测定，向3.2mL测活缓冲液(0.1M Tris-HCl,0.001M CaCl₂)中加入0.5mL待测样品，待测样品分别为对比效果例1中得到的穿透峰组分和0.2mg·mL^-1胰蛋白酶。测试方法是37℃水浴加热5min后，加入胰蛋白酶底物N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺BApNA(0.15M，溶剂为二甲基亚砜)，37℃水浴继续保温10min后，加入0.5mL体积分数为33％的醋酸终止反应。以0.5mL洗脱缓冲液代替酶液调零，以0.2mg·mL^-1胰蛋白酶为阳性对照组，测定各样品管410nm处的吸光度值(A410)，结果如下表2所示：

表2胰蛋白酶活性测定

对比效果例2

亲和材料用于分离胰蛋白酶的方法与效果例2相同，区别在于缓冲液2为0.05MHAc-NaAc，pH4.5。

图7为对比效果例2的胰蛋白酶亲和材料层析柱的紫外吸收曲线，在改变缓冲液2为pH4.5时，紫外吸收曲线只是出现了抖动，变化很小。收集此部分液体进行酶活测定及SDS-PAGE鉴定。酶活测定方法同对比效果例1，结果如下表3所示，显示该洗脱液有较低的胰蛋白酶活性，表明在此条件下少量胰蛋白酶被洗脱下来。图8为SDS-PAGE电泳图谱，其中泳道1为穿透峰，泳道2为缓冲液2(pH4.5)洗脱液，并未出现蛋白条带，表明洗脱液中胰蛋白酶浓度很低。综合酶活测定以及SDS-PAGE的结果,表明在缓冲液2为pH4.5时，只有少量胰蛋白酶被洗脱下来。

表3胰蛋白酶活性测定

综上，说明在本发明胰蛋白酶亲和材料用于分离胰蛋白酶时，其缓冲液的选择对于其分离效果有着重要的影响，只有选择合适的缓冲液pH范围，才能得到满意的分离效果。

以上具体实施方式只是对本发明内容的示意性说明，不代表本发明内容的限制。本领域技术人员可以想到的是本发明中具体结构可以有其它的变化形式。

序列表

<110> 山西大学

<120> 一种重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂突变体以及胰蛋白酶亲和材料

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Arg Gln Cys Ser Gly Lys Gln Glu Trp Pro Glu Leu Val Gly Glu

1 5 10 15

Arg Gly Ser Lys Ala Ala Lys Ile Ile Glu Asn Glu Asn Glu Asp Val

20 25 30

Arg Ala Ile Val Leu Pro Glu Gly Thr Ala Val Thr Arg Asp Leu Arg

35 40 45

Cys Asp Arg Val Trp Val Phe Val Asp Glu Arg Gly Val Val Val Asp

50 55 60

Thr Pro Val Val Met

65

<210> 2

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Arg Gln Cys Ser Gly Lys Gln Glu Trp Pro Glu Leu Val Gly Glu

1 5 10 15

Arg Gly Ser Lys Ala Ala Lys Ile Ile Glu Asn Glu Asn Glu Asp Val

20 25 30

Arg Ala Ile Val Leu Pro Glu Gly Ser Ala Val Pro Arg Asp Leu Arg

35 40 45

Cys Asp Arg Val Trp Val Phe Val Asp Glu Arg Gly Val Val Val Asp

50 55 60

Thr Pro Val Val Met

65

<210> 3

<211> 249

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatccctgc gtcagtgctc cggtaaacaa 60

gaatggccag agctcgttgg agagagaggg tccaaggctg ccaagatcat cgaaaacgag 120

aacgaagacg tgcgagctat cgtcttgcct gagggtaccg cggtgactag agacctccga 180

tgtgaccgtg tgtgggtttt cgtagacgag cgaggagttg ttgttgatac tcctgttgtt 240

atgtgataa 249

<210> 4

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taccgcggtg actagagacc tc 22

<210> 5

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccctcaggca agacgata 18

Claims (10)

1.一种重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂BTI的突变体，命名为e-BTI，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包含以下至少一个突变：41和44位突变，并且与BTI氨基酸序列SEQ.1具有80％以上的同源性。

2.如权利要求1所述的突变体e-BTI，其特征在于，所述突变至少包括以下突变中的一种：S41T和P44T，并且与SEQ.1具有90％以上的同源性。

3.如权利要求1所述的突变体e-BTI，其特征在于，具有如下的氨基酸序列SEQ.1

LRQCSGKQEW PELVGERGSK AAKIIENENE DVRAIVLPEG TAVTRDLRCD 50

RVWVFVDERG VVVDTPVVM 69。

4.编码权利要求1-3任一项所述突变体的核苷酸序列。

5.一种包含权利要求4所述核苷酸序列的载体或工程菌。

6.权利要求1-3任一项所述突变体e-BTI的制备方法，包括以下步骤：

(1)、通过权利要求5所述载体构建BTI工程菌；

(2)、培养上述工程菌；

(3)、诱导胰蛋白酶抑制剂突变体e-BTI的表达；

(4)、突变体e-BTI的纯化：收集菌体、破碎菌体、将上层清液纯化，冷冻干燥后得到所述突变体e-BTI。

7.一种胰蛋白酶亲和材料，包括权利要求1-3任一项所述突变体e-BTI和填料。

8.权利要求7所述亲和材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)、将e-BTI样品溶解于缓冲液中得e-BTI溶液；

(2)、吸取CNBr活化琼脂糖凝胶FF；

(3)、用上述缓冲液浸泡、洗涤、在摇床上振荡，e-BTI和填料进行偶联；

(4)、加入Tris-HCl用于封闭剩余的基团，得到偶联了e-BTI的填料即为所述胰蛋白酶亲和材料。

9.权利要求7所述胰蛋白酶亲和材料在分离提纯胰蛋白酶的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，分离提纯胰蛋白酶包括以下步骤：

(1)、将权利要求7所述胰蛋白酶亲和材料装于层析柱中，洗涤后连接于蛋白纯化系统，用缓冲液1平衡层析柱；

(2)、将含有胰蛋白酶的混合物上样于装有胰蛋白酶亲和材料的层析柱，收集未结合蛋白穿透峰组分；

(3)、充分洗脱未结合蛋白后，更换缓冲液2为洗脱液，洗脱收集洗脱峰组分即为胰蛋白酶；

所述缓冲液1能够使胰蛋白酶与亲和材料特异性结合，其pH为6.0-7.5，优选为7.1-7.3；所述缓冲液2能够使胰蛋白酶从亲和材料解离下来，其pH为3.3-3.6，优选为3.4-3.5。