CN105524898B

CN105524898B - 一种克隆酶供体片段及其制备方法

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Publication number: CN105524898B
Application number: CN201610045629.7A
Authority: CN
Inventors: 邹炳德; 邹继华; 汪屹; 贾江花
Original assignee: Meikang Biological Polytron Technologies Inc
Current assignee: Meikang Biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2016-01-22
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2019-01-11
Anticipated expiration: 2036-01-22
Also published as: CN105524898A

Abstract

本发明公开一种克隆酶供体片段及其制备方法，该供体片段具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。该序列蛋白经凝血酶酶切后可以获得具有生物学活性的克隆酶供体片段单体。该克隆酶供体片段具有互补效率高、稳定性好、易于偶联小分子化合物、抑制效果好等特点，且可大规模获得，纯化方便。能应用于小分子化物的检测。

Description

一种克隆酶供体片段及其制备方法

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，具体说是属于均相酶免技术领域的克隆酶供体片段，及其基因。

背景技术

利用重组DNA技术制备β-半糖苷酶的两个片段：大片段称为酶受体(enzymeacceptor， EA)，小片段称为酶供体(enzyme donor，ED)。两个片段本身均不具酶活性，但在合适的条件下结合在一起就具有酶活性。利用这两相片段的特性建立的均相酶免疫测定称为克隆酶供体免疫测定(cloned enzyme donor immune assay,CEDIA)。

CEDIA的反应模式为竞争法，测定原理为：标本中的抗原和ED标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不再能与EA结合。反应平衡后，剩余的ED标记抗原与EA结合，形成具有活性的酶。加入底物测定酶活力，酶活力的大小与标本中抗原含量成正比。CEDIA主要用于药物和小分子物质的测定。

但是该技术存在以下几个技术难点，导致该技术未能大范围应用，大大限制了其应用领域。

其一，偶联小分子问题，一般来说，蛋白分子中可以用于交联的活性基团有游离氨基(如赖氨酸的ε-氨基或者末端氨基)、酚基(酪氨酸)、巯基(半胱氨酸)、羟基(丝氨酸或苏氨酸)。野生的ED(CNBr2)与EA(M15或M112)具有较高的互补活性(非-专利文件1:Welply JK,Fowler A V,Zabin I,.beta-Galactosidase alpha-complementation.Overlappingsequences.[J]. Journal of Biological Chemistry,1981,256(13):6804-6810.)，但是其上的位点并不适合于偶联小分子物质，例如专利US4708929指出通过该片段上的氨基，羧基，巯基，与小分子化合物偶联后，其所得的产物与EA片段的互补效率大大降低，因此若不对该ED片段进行合适的改造，恐怕不能用于直接地偶联小分子。

其二，由于ED片段的分子量较小，约有90个氨基酸组成，其分子量只有10KDa左右，因此，如果直接用于表达，很容易在表达的过程中就进行降解，使得难以得到完整的ED片段。为此有以下两种不同的策略去改进，其一是利用多肽合成的方法进行获得ED片段，例如专利US7135325B2，利用多肽合成的方法合成了一系列小的ED片段，这些ED片段具有一定的互补活性。但是利用多肽合成的方法对于小分子多肽的合成上具有一定的优势(小于 50个氨基酸)，正如该专利所合成的那样(30～50aa)，但随着多肽分子量的增加，其合成难度以及成本均急剧上升。而较好的ED片段所含的氨基酸数目为应该是60～100个为宜，因为如果ED片段过于的小，其互补效率也会下降，且该片段的稳定性也会受到影响。另一种方法是在表达方式上进行改善，例如专利US4708929就是通过ED与EA共表达的方式获得EA，有学者则是通过ED与Trx蛋白融合表达的方式获得(非-专利文件2:李黄金,陈伟,赵林, 等.β-半乳糖苷酶供体片段定点突变、表达、纯化与活性分析[J].广东药学院学报, 2010(04):412-415.)，也有学者则是通过胞外表达的方式获得ED(非-专利文件3:许淑芬,刘磊,孙牧男,等.大肠杆菌β-半乳糖苷酶ED和EA的克隆、表达及活性测定[J].吉林大学学报：医学版,2010,36(1):40-44.)。但是无论用现有的哪种表达方式，其所获得的ED表达量均很低，很难满足产业化的要求。

发明内容

本发明针对现有技术的克隆酶供体片段存在表达量低，稳定性差，偶联易失活等缺点，提供一种稳定性好，偶联方便，表达量高的克隆酶供体片段。

即，本发明是对氨基酸序列进行了一定的突变筛选，找到了一种稳定性好，易于偶联的 ED，并在表达的方式上进行了一定的改进，能够很方便地获得大量ED片段。

具体地说，本发明是将三个ED片段，通过凝血酶酶切位点串联起来，获得具有SEQID NO:1所示序列的片段，并进行表达所获得的。

本发明SEQ ID NO:1所示的该序列具有如下特征：

(1)SEQ ID NO:1序列具有三段相同的序列通过凝血酶酶切位点连接起来；

(2)该片段的分子量约为30KDa；

(3)每一个重复片段的分子量约为10KDa；

(4)每一个重复片段的N端含有6*His Tag标签，可用于亲和纯化；

(5)每一个重复片段均含有一个半胱氨酸残基，可利用该巯基偶联小分子化合物；

(6)每一个重复片段均含有一个赖氨酸残基，可利用该侧链的氨基偶联小分子化合物；

(7)用于偶联的半胱氨酸和赖氨酸均位于片段的N端，与ED的互补核心序列(非-专利文件4:Douglas H.Juers,Raymond H.JacobsonDale Wigley,et al.High resolutionrefinement of beta-galactosidase in a new crystal form reveals multiplemetal-binding sites and provides a structural basis for alpha-complementation.[J].Protein Science A Publication of the Protein Society,2000,9(9):1685–1699.)具有一定距离，进而不会明显影响到ED与EA的互补效率。

SEQ ID NO:1所示的该序列如下所示：

HHHHHHKTMITDCLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLELVPRGSHHHHHHKTMITDCLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLELVPRGSHHHHHHKTMITDCLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLE

由于该片段的分子量由原先的10KDa变成了30KDa，其在表达时不容易被降解，更加容易获得具有完整ED片段的酶。

本发明还提供一种编码上述克隆酶供体片段的基因。本发明上述的SEQ ID NO:1序列为蛋白质序列，那么可以根据密码子的组成规律，很容易获得能够编码该蛋白质序列的DNA 序列，对于一个要想在特定物种中进行表达，则该DNA序列可以进行相应的优化，尽量避免利用稀有密码子，这样可以提高其表达量，例如若要是在大肠杆菌中进行表达，则可以针对大肠杆菌中使用密码子的频率来选择合适的DNA序列。本发明所使用的DNA片段可以利用全基因化学合成的方式获得，也可以利用PCR的方式将三个DNA片段拼接起来。

进一步的，本发明还提供一种含有上述基因的载体。对于所使用的载体，则可以选择pET 系列载体，如pET22b(大肠杆菌表达载体)，则相应的启动子为T7启动子，后期则要选择含有DE3溶源菌的菌株，例如BL21(DE3)，表达时则可以利用IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)进行诱导。也可以选择含有Ara诱导的启动子的质粒，例如pGro7，则后期可以选择JM109 等菌种，同时需要利用阿拉伯糖进行诱导。

更进一步的，本发明还提供一种用上述的载体所转化的细胞。

本发明还提供一种制备克隆酶供体片段的方法，包括：(1)培养上述的细胞；(2)利用合适的诱导剂进行诱导表达蛋白；(3)收集菌体并破碎离心；(4)利用亲和纯化的方法进行纯化；(5)利用凝血酶将蛋白酶切成单个片段。

对于菌体的培养，则可以利用常规的培养方式。例如，小规模地可以利用摇床培养，大规模地可以利用发酵罐培养，所使用的培养基为LB或其它，待其生长至一定的浓度后，利用相应的诱导剂，如IPTG进行诱导，同时可以适当降低温度，如20℃进行表达。

收集表达后的菌体，利用超声破碎将菌体破碎，离心，取上清，利用常规亲和纯化的方法进行纯化。

为了获取具有生物学活性的ED片段单体，可以利用凝血酶，将上述纯化得到的ED串联表达产物进行酶切，在常规条件下酶切即可轻松获得酶切后的单体片段。而反应液中的凝血酶则可以通过再次亲和纯化的方式进行去除，所得的ED片段单体可以作为偶联小分子物质用，例如：生物素、固醇类激素、小分子药物等，进而开发相应的试剂盒。

本发明的优点和有益效果：亲和素对本发明ED的小分子偶联物的抑制效率可以到达80％以上，具有良好的抑制效率。因此，该ED有非常大的潜力应用于偶联其它小分子物质，并获得较好的抑制率。因此本发明所述的ED在得率，纯化方法，互补效率，稳定性，偶联小分子，偶联后抑制率等方面具有较好的性能，将来可以用于各种小分子物质的检测。

附图说明

图1电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但并不限于下述实施例。

实施例1

表达载体的构建

1、基因合成

根据蛋白质的序列SEQ ID NO:1反推出其中一种DNA序列，如SEQ ID NO:2所示。利用全基因合成的方法，获得该基因(如上海吉尔生物公司合成)。

2、PCR克隆

并PCR克隆至pET22b载体的NdeI，XhoI位点上。所得质粒命名为ED-pET22b。

实施例2

ED的表达，纯化及酶切

1、表达

将质粒ED-pET22b转化BL21(DE3)，并且接种于200ml LB培养基中，氨苄抗性，37℃培养，待菌生长至OD600约0.8左右时，利用IPTG进行诱导，终浓度为0.4mM，并将温度降至20℃诱导过夜。

2、纯化

次日，离心收集菌体，并重新悬浮于20ml Binding buffer(50mM PB，300mM NaCl，10mM 咪唑，pH7.2)中，利用超声破碎进行破碎。离心，收集上清。上清上样于5ml的预装柱HisTrap FF，并用washing buffer(50mM PB，300mM NaCl，50mM咪唑，pH7.2)洗脱杂质，再用eluting buffer(50mM PB，300mM NaCl，400mM咪唑，pH7.2)洗脱目的蛋白。最后透析至50mM PB，pH7.2缓冲液。所得蛋白进行SDS-PAGE鉴定，条带单一，具有较高纯度(>90％)。最终纯化所得约有10mg蛋白，即摇瓶表达量约为100mg/L，产量可观，若结合高密度发酵技术，则可以达到更高产量，完全可以满足产业化所需的用量。

3、酶切

将上述纯化到的串联ED片段，用凝血酶进行酶切。反应体系如下：

表1酶切体系

名称	体积(ml)
		串联ED(1mg/ml)	5
50mM PB,pH 7.0	5
		Thrombin	1U
总体积	10

于4℃反应过夜。

由电泳图1可知，酶切前目的条带大小约为30KDa，酶切后大小约为10KDa，且条带单一，无明显杂带，说明酶切完全，且用该方法表达容易获得完整的ED片段。

实施例3

ED与生物素偶联

上述步骤中所得到的ED，用2mM TCEP处理30min，并利用脱盐柱处理，更换成50mMPB，pH7.5，所得ED立即用于下列偶联步骤。

1、利用巯基与生物素偶联

利用巯基能够与马来酰亚胺反应的性质，选取被马来酰亚胺修饰过的生物素，即本实验选用EZ-Link BMCC-Biotin(Thermo 21900)为偶联小分子，具体反应条件如下：

表2 ED偶联BMCC-Biotin反应体系

名称	体积(ul)
		ED(0.5mg/ml)	300
200mM PB,pH7.5	500
		BMCC-Biotin(2mg/ml in DMSO)	100
水	100
		总共	1000

室温反应60min。并于4℃下透析过夜，透析缓冲液为50mM PB，pH7.5。

2、利用氨基与生物素偶联

利用氨基能够与羟基琥珀酰亚胺反应的性质，选取被羟基琥珀酰亚胺修饰过的生物素，即本实验选用Sulfo-NHS-Biotin(Thermo 21217)为偶联小分子，具体反应条件如下：

表3 ED偶联NHS-Biotin反应体系

名称	体积(ul)
		ED(0.5mg/ml)	300
200mM PB,pH8.0	500
		Sulfo-NHS-Biotin(2mg/ml in DMSO)	100
水	100
		总共	1000

室温反应60min。并于4℃下透析过夜，透析缓冲液为50mM PB，pH8.0。

实施例4

ED与EA互补效率及稳定性研究

1、测活方法：

向96孔板中加入50ul EA(200ug/ml，M15)，再加入50ul ED(1ug/ml),混匀，于室温孵育60min，然后加入100ul反应液(100mM PB，1mg/ml ONPG,1mM MgCl₂，0.1％巯基乙醇,pH7.4),并于37℃孵育30min，加入50ul 1M Na₂CO₃终止反应，记录吸光度A₄₁₀。

2、测活反应

按照上述方法，将酶切后ED，ED-BMCC-Biotin，ED-NHS-Biotin，以及对照CNBr2片段与EA的互补酶活进行测定。另外，将上述ED分别于40℃保温60min后，再按照上述方法进行互补测活，见下表：

表4 ED测活结果

名称	吸光度A410	吸光度A410(加热后)
			ED(酶切后)	0.432	0.391
ED-BMCC-Biotin	0.401	0.355
			ED-NHS-Biotin	0.386	0.327
CNBr2	0.465	0.428
			水	0.091	0.091

由此可知ED及其偶联物均具有较好的稳定性，后期可通过再往缓冲液中添加一定的保护剂进一步提高其稳定性，有利于在试剂盒里的应用。

实施例5

偶联后的抑制效率研究

1、抑制率实验方法

按照上述测活方法，进行适当调整，加入亲和素进行抑制率实验。具体方法如下：向96 孔板中加入50ul EA(200ug/ml，M15)，再加入5ul亲和素(1mg/ml)，然后再加入50ulED (1ug/ml),混匀，于室温孵育60min，然后加入100ul反应液(100mM PB，1mg/ml ONPG,1mMMgCl₂，0.1％巯基乙醇,pH 7.4),并于37℃孵育30min，加入50ul 1M Na₂CO₃终止反应，记录吸光度A₄₁₀。

按照该方法，进行抑制率实验，所得结果如下：

表5 ED抑制率实验结果

名称	不加亲和素(5ul水)	加入亲和素	抑制效率
				ED(酶切后)	0.427	0.425	0.6％
ED-BMCC-Biotin	0.400	0.142	83.5％
				ED-NHS-Biotin	0.383	0.122	85.9％
水	0.091	0.091	0％

由上表可知，亲和素对ED的小分子偶联物的抑制效率可以到达80％以上，具有良好的抑制效率。因此，该ED有非常大的潜力应用于偶联其它小分子物质，并获得较好的抑制率。

因此本发明所述的ED在得率，纯化方法，互补效率，稳定性，偶联小分子，偶联后抑制率等方面具有较好的性能，有望将来用于各种小分子物质的检测。

Claims

1.一种克隆酶供体片段，其特征在于：该片段具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，该序列具有如下特征：

（1）SEQ ID NO:1序列具有三段相同的序列通过凝血酶酶切位点连接起来；

（2）该片段的分子量约为30KDa；

（3）每一个重复片段的分子量约为10KDa；

（4）每一个重复片段的N端含有6*His Tag标签，可用于亲和纯化；

（5）每一个重复片段均含有一个半胱氨酸残基，可利用该巯基偶联小分子化合物；

（6）每一个重复片段均含有一个赖氨酸残基，可利用该侧链的氨基偶联小分子化合物；

（7）用于偶联的半胱氨酸和赖氨酸均位于片段的N端，与ED的互补核心序列具有一定距离，进而不会明显影响到ED与EA的互补效率。

2.一种编码权利要求1所述的克隆酶供体片段的基因。

3.含有权利要求2所述的基因的载体。

4.用权利要求3的载体所转化的细胞。

5.一种克隆酶供体片段的制备方法，包括：（1）培养权利要求4所述的细胞；（2）利用诱导剂进行诱导表达蛋白；（3）收集菌体并破碎离心；（4）利用亲和纯化的方法进行纯化；（5）利用凝血酶将蛋白酶切成单个片段。