CN107663505A - 一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌及其应用 - Google Patents

一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌，所述酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体转化到毕赤酵母而获得：所述外源DNA为恶臭假单胞杆菌肌酐酶的DNA编码序列，所述恶臭假单胞杆菌肌酐酶的氨基酸序列如Seq No.2所示。本发明还提供了该酵母工程菌的构建方法以及采用本发明的酵母工程菌发酵获得的重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶在肌酐检测中的应用。本发明的酵母工程菌培养快速简单，诱导条件容易控制，生产成本低，具有工业化生产的潜力；同时由其发酵制备的重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶具有良好的肌酐酶活性，并表现出优良的温度稳定性、耐热能力和pH稳定性。

Description

一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌及其应用。
背景技术
肌酐酶(creatininase；EC 3.5.2.10)是一种水解酶，属于脲酶相关的酰胺水解酶家族，分布于少数几种细菌中。肌酐酶的活性中心含有锌离子，肌酐酶的催化水解合成反应即催化环酰胺肌酐可逆的水解为肌酸。
血清中和尿液中肌酐测定可为临床评价肾小球滤过功能提供客观指标，因而是临床上常做的生化检验项目，传统的肌酐测定化学法由于反应特异性差，容易受到样品中的非特异性物质的干扰，正在逐步被酶学方法所取代。肌酐酶作用的底物具有特异性，底物只能是肌酐或者是肌酸，酶法检测肌酐有着反应特异性强，操作简单的优点，而作为其中的一个关键酶，肌酐酶在医学检测上有重要的应用价值。
在自然环境中，恶臭假单胞菌、脲节杆菌和烟草节杆菌等微生物的代谢物中都有发现肌酐酶。目前研究比较多的肌酐酶大多是野生菌中的肌酐酶，但野生菌培养困难，肌酐酶产量低，比酶活低，提纯存在困难。随着酶法检测肌酐试剂盒的开发，对于肌酐酶的需求越来越大，利用野生菌进行肌酐酶的生产难以实现工业化放大而且生产往往成本过高。
因此，构建出高表达具有良好性质的肌酐酶的工程菌，实现肌酐酶在工业中的生产，将可以大幅度降低生产成本。
发明内容
有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于克服现有技术中不足，提供了一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌及其构建方法。
本发明所解决的技术问题还在于提供了一种重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶，利用本发明的酵母工程菌进行发酵而获得。
本发明所解决的技术问题还在于提供了一种重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶在肌酐检测中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌，所述酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体转化到毕赤酵母而获得：
所述外源DNA为恶臭假单胞杆菌肌酐酶的DNA编码序列，所述恶臭假单胞杆菌肌酐酶的氨基酸序列如Seq No.2所示。
优选地，所述外源DNA序列如Seq No.1所示。
优选地，所述表达载体为将所述外源DNA克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pHKFA1，得到的表达载体pHKFA1-cre。
优选地，所述酵母工程菌是所述表达载体pHKFA1-cre线性化后转化到巴斯德毕赤酵母而得。
相应地，本发明还提供一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：
步骤一、编码基因的获取：以恶臭假单胞杆菌肌酐酶的氨基酸序列为基础，对序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到密码子优化的对应编码序列；恶臭假单胞杆菌肌酐酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤二、表达载体的构建：将步骤一获取的编码基因克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pHKFA1，得到的表达载体pHKFA1-cre；
步骤三、表达载体转化及酵母工程菌获取：将表达载体pHKFA1-cre经Kpn2I单酶切线性化并纯化后电转化毕赤酵母工程菌GS115感受态细胞，培养后筛选阳性转化子，并对筛选的阳性转化子进行鉴定，鉴定正确的转化子即为毕赤酵母工程菌GS115/pHKFA1-cre。
优选地，阳性转化子的筛选是在MD平板进行。
优选地，对阳性转化子进行的鉴定以cre-F和cre-R为引物进行PCR鉴定，其中cre-F的序列如Seq No.3所示，cre-R的序列如Seq No.4所示。
另外，本发明还提供了一种重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶，其特征在于：该重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶是由上述方案中揭示的酵母工程菌进行发酵而获得。
优选地，其发酵方法为如下：挑取重组毕赤酵母工程菌接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养至OD600接近6.0，于6000rpm,4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇；发酵六天后在6000rpm，4℃离心5min回收发酵上清液；用亲和层析方法对发酵上清液的重组肌酐酶进行纯化即可；所述BMMY培养基中含有0.1mM CuSO4。
再则，本发明还提供了一种本发明的重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶在肌酐检测中的应用。
与现有技术相比，本发明优点在于：
首先，本发明的的重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶酵母工程菌培养快速简单，诱导条件容易控制，生产成本低，具有工业化生产的潜力。更为重要的是由本发明的重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶酵母工程菌发酵而获得的重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶具有肌酐酶活性。同时还对获得的重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶进行最适作用pH、pH稳定性、最适作用温度及温度稳定性分析。结果显示该重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶的温度稳定性和pH稳定性非常好，表明该重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶具有良好的耐热能力。
下面结合附图和具体实施方式进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。
附图说明
图1为纯化肌酐酶的(a)SDS-PAGE分析及图；SDS-PAGE图谱，其中M：标准蛋白质分子量；1：加热变性的纯化重组肌酐酶。
图2为纯化重组肌酐酶的(a)最适pH曲线和(b)pH稳定性曲线。
图3为纯化重组肌酐酶的最适温度曲线和温度稳定性曲线。
具体实施方式
下面结合具体制备实施例和应用实施例，对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
新型肌酐酶基因的合成
以美国国立生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的genbank GI:34810367基因序列为基础，对该序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到新型肌酐酶基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，通过生物技术公司(上海捷瑞生物工程有限公司)全基因合成，合成的基因克隆在pGH质粒(购自捷瑞生物工程有限公司)上，得到质粒pGH-cre。
实施例2
含新型肌酐酶基因的重组质粒pHKFA1-cre及携带该质粒的菌株E.coliTop10/pHKFA1-cre的构建
根据新型肌酐酶基因的核苷酸序列设计PCR引物：正向引物cre-F：5'-CGGGAATTCATGCATCATCATCATCATCATTCTAAGTCTGT
TTTT-3'(下划线为EcoRI酶切位点，同时含有6×His标签)和反向引物cre-R：5'-GATGCGGCCGCTTAAGTTGGTGGGAAC-3'(下划线为NotI酶切位点，同时含有终止密码子)。
以实施例1中的质粒pGH-cre为模板，cre-F和cre-R为引物进行PCR扩增。将胶回收纯化后的PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，与同样经过EcoRI和NotI双酶切的质粒pHKFA1用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物化学转化E.coliTop10(购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司)，经卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取质粒经EcoRI和NotI双酶切鉴定正确后，得到重组质粒pHKFA1-cre。含有正确重组质粒pHKFA1-cre的克隆菌株E.coliTop10/pHKFA1-cre加15％甘油于-80℃保存。
实施例3
新型肌酐酶生产菌株PichiapastorisGS115/pHKFA1-cre的构建及重组肌酐酶表达
将重组质粒pHKFA1-cre经Kpn2I单酶切线性化并纯化后电转化PichiapastorisGS115(购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司)感受态细胞，并在MD平板进行阳性转化子筛选。以MD平板筛选得到的转化子为模板，以cre-F和cre-R为引物进行PCR鉴定，PCR鉴定正确的转化子初步鉴定为新型肌酐酶生产菌株PichiapastorisGS115/pHKFA1-cre。
挑取3个PCR鉴定正确的转化子接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养至OD600接近6.0，于6000rpm,4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇。发酵三天后在6000rpm，4℃离心5min回收发酵上清液。用亲和层析方法对发酵上清液的重组肌酐酶进行纯化。纯化方法参照HisTrapTMFF crude 5mL(GE Healthcare,Sweden)操作指南。经纯化的重组肌酐酶在4℃保存。
实施例4
纯化的重组肌酐酶cre的酶学性质
肌酐酶活的测定方法：
以肌酸为底物，取0.9ml 0.1mol/L肌酸溶液(0.05M PBS溶解，PH8.0)至试管中，37℃放置5分钟；加入0.lm1酶液，混匀，在37℃反应10分钟；迅速移取0.1ml反应液至l.9mlNaOH中；加入l.0ml苦味酸，在25℃放置20分钟；520nm处测定吸光度。
肌酐酶酶活力定义：在上述条件下，产生1μmol/min苦味酸肌酐复合物为1个酶活单位(U)。
肌酐酶活力计算公式：酶活(U/L)＝A×Vt×10×df/(ε520×1.0×t×Vs)；
n:酶液稀释倍数；A：吸光度的变化值；Vt：酶反应液的总体积；Vs:酶反应液中酶液体积；ε520：苦味酸肌酐复合物毫摩尔吸光系数为4.65。
最适pH和pH稳定性：以0.1M肌酸为底物，在37℃下测定cre在在pH3.0-10.0(Britton–Robinson缓冲液)之间酶活的变化。将cre置于pH3.0-11.0的Britton–Robinson缓冲液中,25℃下处理24h后取出，在pH8.0，37℃条件下测定被处理后的cre的酶活力，同时以等量未经处理的酶液作为正对照，活力设为100％。以肌酸为底物，测定cre在pH3.0-11.0的最适pH是8.0(图2a)，而且，cre在pH7.0-9.0环境下非常稳定，在经过24h处理后酶活力仍然可以保持84％以上(图2b)，显示出cre在中性偏碱条件下具有良好的耐受性。
最适温度和温度稳定性：在将cre在pH8.0条件下，以0.1M肌酸为底物，测定其在30℃-80℃范围内的酶活力变化。将cre分别在50℃-70℃处理，每隔1h取样，取样至4h，取出后冰浴，并在pH8.0，37℃条件下测定被处理后的cre的酶活力，同时以等量未经处理的酶液作为正对照，活力设为100％。结果显示，以肌酸为底物时cre的最适温度高达70℃(图3a)，而且在高温60℃处理4h可以保持60％以上的酶活力(图3b)。而且cre有较高的热稳定性，即使在70℃处理4h，仍然可以保持45％以上的酶活力。实验结果充分表明重组肌酐酶具有耐高温的优点。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌及其应用
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
atgtctaagt ctgtttttgt tggtgagttg acatggaagg aatacgaagc tagagtcgcc 60
gctggtgatt gtgtcttgat gttgcctgtt ggagctttgg aacaacatgg acatcatatg 120
tgtatgaacg ttgatgtctt gttgccaact gctgtctgtc aaagagttgc agaaagaatc 180
ggtgctttgg tcttgccagg tttgcaatac ggttacaagt ctcagcaaaa gtctggtggt 240
ggtaaccatt ttccaggtac tacttctttg gatggagcaa ctttgactgg tactgtccag 300
gacattatca gagaattggc tagacatggt gttagaagat tggttttgat gaacggacac 360
tatgagaact ctatgtttat tgttgaggga attgacttgg cattgagaga gttgagatat 420
gctggtattc atgattttaa ggttgttgtt ttgtcttatt gggattttgt taaggaccca 480
gctgttattc agagattgta tcctgaaggt ttcttgggtt gggatattga acacggaggt 540
gttttcgaga catctttgat gttggctttg tacccagatt tggttgattt ggaaagagtc 600
gttgatcacc cacctgctac ttttccacca tacgatgttt tcccagtcga cccagctaga 660
acaccagctc caggaacctt gtcttctgct aagactgctt ctagagaaaa gggtgaattg 720
attttggaag tttgtgtcca aggtattgct gatgcaattg gtcaagagtt cccaccaact 780
<210> 2
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
Met Ser Lys Ser Val Phe Val Gly Glu Leu Thr Trp Lys Glu Tyr Glu
1 5 10 15
Ala Arg Val Ala Ala Gly Asp Cys Val Leu Met Leu Pro Val Gly Ala
20 25 30
Leu Glu Gln His Gly His His Met Cys Met Asn Val Asp Val Leu Leu
35 40 45
Pro Thr Ala Val Cys Gln Arg Val Ala Glu Arg Ile Gly Ala Leu Val
50 55 60
Leu Pro Gly Leu Gln Tyr Gly Tyr Lys Ser Gln Gln Lys Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Asn His Phe Pro Gly Thr Thr Ser Leu Asp Gly Ala Thr Leu Thr
85 90 95
Gly Thr Val Gln Asp Leu Leu Arg Glu Leu Ala Arg His Gly Val Arg
100 105 110
Arg Leu Val Leu Met Asn Gly His Tyr Glu Asn Ser Met Phe Ile Val
115 120 125
Glu Gly Ile Asp Leu Ala Leu Arg Glu Leu Arg Tyr Ala Gly Ile His
130 135 140
Asp Phe Lys Val Val Val Leu Ser Tyr Trp Asp Phe Val Lys Asp Pro
145 150 155 160
Ala Val Ile Glu Arg Leu Tyr Pro Glu Gly Phe Leu Gly Trp Asp Ile
165 170 175
Glu His Gly Gly Val Phe Glu Thr Ser Leu Met Leu Ala Leu Tyr Trp
180 185 190
Asp Leu Val Asp Leu Glu Arg Val Val Asp His Pro Pro Ala Thr Phe
195 200 205
Pro Pro Tyr Asp Val Phe Pro Val Asp Pro Ala Arg Thr Pro Ala Pro
210 215 220
Gly Thr Leu Ser Ser Ala Lys Thr Ala Ser Arg Glu Lys Gly Glu Leu
225 230 235 240
Ile Leu Glu Val Cys Val Gln Gly Ile Ala Asp Ala Ile Gly Gln Glu
245 250 255
Phe Pro Trp Thr
260
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
cgggaattca tgcatcatca tcatcatcat tctaagtctg ttttt 45
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
gatgcggccg cttaagttgg tgggaac 27

Claims (10)

1.一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体转化到毕赤酵母而获得：
所述外源DNA为恶臭假单胞杆菌肌酐酶的DNA编码序列，所述恶臭假单胞杆菌肌酐酶的氨基酸序列如Seq No.2所示。
2.如权利要求1所述的用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌，其特征在于：所述外源DNA序列如Seq No.1所示。
3.如权利要求2所述的用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌，其特征在于：所述表达载体为将所述外源DNA克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pHKFA1，得到的表达载体pHKFA1-cre。
4.如权利要求3所述的用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌，其特征在于：所述酵母工程菌是所述表达载体pHKFA1-cre线性化后转化到巴斯德毕赤酵母而得。
5.一种用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、编码基因的获取：以恶臭假单胞杆菌肌酐酶的氨基酸序列为基础，对序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到密码子优化的对应编码序列；恶臭假单胞杆菌肌酐酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤二、表达载体的构建：将步骤一获取的编码基因克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pHKFA1，得到表达载体pHKFA1-cre；
步骤三、表达载体转化及酵母工程菌获取：将表达载体pHKFA1-cre经Kpn2I单酶切线性化并纯化后电转化毕赤酵母工程菌GS115感受态细胞，培养后筛选阳性转化子，并对筛选的阳性转化子进行鉴定，鉴定正确的转化子即为毕赤酵母工程菌GS115/pHKFA1-cre。
6.如权利要求5所述的用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌的构建方法，其特征在于：阳性转化子的筛选是在MD平板进行。
7.如权利要求5所述的用于表达恶臭假单胞杆菌肌酐酶的酵母工程菌的构建方法，其特征在于：对阳性转化子进行的鉴定以cre-F和cre-R为引物进行PCR鉴定，其中cre-F的序列如Seq No.3所示，cre-R的序列如Seq No.4所示。
8.一种重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶，其特征在于：该重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶是由权利要求1-4中任意一项所述的酵母工程菌进行发酵而获得。
9.如权利要求8所述的重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶，其特征在于，其发酵方法为如下：挑取重组毕赤酵母工程菌接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养至OD600接近6.0，于6000rpm,4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇；发酵六天后在6000rpm，4℃离心5min回收发酵上清液；用亲和层析方法对发酵上清液的重组肌酐酶进行纯化即可；所述BMMY培养基中含有0.1mM CuSO4。
10.一种如权利要求8或9所述的重组恶臭假单胞杆菌肌酐酶在肌酐检测中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111676180A (zh) * 2020-03-12 2020-09-18 北京达成生物科技有限公司 一种用于表达施式假单胞杆菌肌酐酶的大肠杆菌工程菌

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CN111676180A (zh) * 2020-03-12 2020-09-18 北京达成生物科技有限公司 一种用于表达施式假单胞杆菌肌酐酶的大肠杆菌工程菌

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