CN113930402B

CN113930402B - 提高漆酶催化活性的方法及突变体Lcc9-M2、基因和应用

Info

Publication number: CN113930402B
Application number: CN202111569213.2A
Authority: CN
Inventors: 罗会颖; 张亨; 秦星; 黄火清; 王亚茹; 柏映国; 王苑; 涂涛; 苏小运; 张�杰; 王晓璐; 张红莲; 于会民; 杨浩萌; 姚斌
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2021-12-21
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2041-12-21
Also published as: CN113930402A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及提高漆酶催化活性的方法及突变体Lcc9‑M2、基因和应用。野生型漆酶Lcc9经定点突变后得到催化活性提高的突变体。本发明的漆酶突变体具有良好的酶学性质，可以应用于饲料、食品、污水处理、医药等行业。

Description

提高漆酶催化活性的方法及突变体Lcc9-M2、基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及提高漆酶的催化活性的方法及突变体Lcc9-M2、基因和应用。

背景技术

漆酶（EC 1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于高等植物、真菌、细菌、昆虫和地衣中。其中，真菌来源的漆酶分布最为广泛，并且拥有氧化还原电势最高，底物谱广，分离纯化、鉴定简单的特点。漆酶在工业生物催化中具有相当可观的应用前景，目前已知催化底物达200多种，主要包括酚类(主要是邻苯二酚、对苯二酚等多元酚及其衍生物)、芳胺类及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾体激素、生物色素、二茂铁类化合物及其衍生物等6类。在氧化还原介质存在的情况下，漆酶还可以进一步催化更多的非酚类底物，如多环芳烃、多氯联苯、偶氮染料及有机磷农药及木质素类大分子化合物。目前，漆酶在环境修复、生物监测、食品加工、纤维改造、防止染色、制药和有机合成等绿色化学中有重要应用。

催化活性作为衡量酶工业化应用价值的重要指标，一直以来被广泛关注。除了通过大量筛选获得具有高催化活性的天然酶外，利用蛋白质工程手段对酶分子进行改良也是目前酶工程领域的研究热点。

发明内容

为了进一步优化来源于Coprinopsis cinerea的漆酶Lcc9的酶学特性，提出并完成了本发明。

本发明的目的是提供提高漆酶催化活性的方法。

本发明的再一目的是提供催化活性提高的漆酶突变体。

本发明的再一目的是提供上述漆酶突变体的编码基因。

本发明的再一目的是提供包含上述漆酶突变体编码基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述漆酶突变体编码基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备催化活性提高的漆酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述漆酶突变体的应用。

本发明对野生型漆酶Lcc9进行突变，得到催化活性提高的漆酶突变体，其中，母本野生型漆酶Lcc9的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

去除信号肽后成熟的野生型漆酶Lcc9的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

根据本发明的具体实施方式，将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型漆酶Lcc9的第285位氨基酸由Asn突变为Asp、第475位氨基酸由Phe突变为Trp，得到漆酶突变体Lcc9-M2。

根据本发明的具体实施方式，所述漆酶突变体Lcc9-M2的氨基酸序列SEQ ID NO:3所示。

去除信号肽后成熟的漆酶突变体Lcc9-M2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明提供了编码上述漆酶突变体Lcc9-M2的基因。

根据本发明的具体实施方式，野生型漆酶Lcc9的基因序列如SEQ ID NO：5所示。

去除信号肽后成熟的野生型漆酶Lcc9的基因序列如SEQ ID NO:6所示。

根据本发明的具体实施方式，漆酶突变体Lcc9-M2的编码基因序列如SEQ ID NO:7所示。

去除信号肽后成熟的漆酶突变体Lcc9-M2的编码基因序列如SEQ ID NO:8所示。

根据本发明的提高漆酶的催化活性的方法包括以下步骤：

将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示野生型漆酶Lcc9的第285位氨基酸由Asn突变为Asp、第475位氨基酸由Phe突变为Trp，或者将氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的野生型漆酶Lcc9的第265位氨基酸由Asn突变为Asp、第455位氨基酸由Phe突变为Trp。

本发明提供了包含上述漆酶突变体Lcc9-M2的编码基因的重组载体。

本发明还提供了包含上述漆酶突变体Lcc9-M2的编码基因的重组菌株，优选的菌株为毕赤酵母GS115，含漆酶突变体基因的重组菌株为重组赤酵母GS115/ Lcc9-M2。

根据本发明的具体实施方式，制备催化活性提高的漆酶的方法如下所述：

(1)用含有漆酶突变体Lcc9-M2的编码基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导漆酶表达；

(3)回收并纯化所表达的漆酶。

本发明的有益效果：

本发明对野生型漆酶Lcc9进行突变，漆酶突变体Lcc9-M2比活力比野生型的比活力提高了220%，确认了本发明提供的漆酶突变体催化活性更高，对于研究材料Lcc9的催化活性改良提供了重要的线索。漆酶突变体Lcc9-M2催化活性大幅提升，并且具有良好的酶学性质，可应用于饲料、食品、污水处理、医药等行业中，有广阔的应用前景。

附图说明

图1显示在毕赤酵母中表达的重组漆酶突变体和野生型的SDS-PAGE分析结果；

图2显示催化活性提高的漆酶突变体与野生型的最适pH；

图3显示催化活性提高的漆酶突变体与野生型的最适温度；

图4显示催化活性提高的漆酶突变体与野生型的比活比较图。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：表达宿主Pichiapastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r为本实验室保存。

2、生化试剂：限制性内切酶购自NEB公司，连接酶购自Promaga公司，点突变试剂盒购自全式金公司，酪蛋白购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

（1）LB培养基：0.5% 酵母提取物，1% 蛋白胨，1% NaCl， pH 7.0。

（2）YPD培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖。

（3）MD固体培养基：2% 葡萄糖，1.5% 琼脂糖，1.34% YNB，0.00004% Biotin

（4）BMGY培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1% 甘油(V/V)，1.34% YNB，0.00004%Biotin。

（5）BMMY培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1.34%YNB，0.00004% Biotin，0.5%甲醇(V/V)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J．萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1催化活性提高的漆酶突变体重组载体pPIC9r-Lcc9-M2的制备

将漆酶野生型（突变前）序列片段（去除信号肽）克隆到表达载体pPIC-9r上，重组载体命名pPIC9r-Lcc9；以重组载体pPIC9r-Lcc9为模板，通过携带突变位点的引物对其进行扩增，获得携带突变体序列的重组载体，命名为pPIC9r-Lcc9-M2。

催化活性提高的漆酶突变体Lcc9-M2特异性引物包括:Lcc9-N285D-F (SEQ IDNO:9); Lcc9-N285D-R (SEQ ID NO:10); Lcc9-F475W-F (SEQ ID NO:11); Lcc9-F475W-R(SEQ ID NO:12)。

实施例2 催化活性提高的漆酶突变体的制备。

（1）催化活性提高的漆酶突变体Lcc9-M2在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

将获得的含有催化活性提高的突变体基因Lcc9-M2的重组质粒pPIC9r-Lcc9-M2以及含有野生型漆酶基因的重组质粒pPIC9r-Lcc9转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/Lcc9-M2和GS115/Lcc9。取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300 mL BMGY培养基的1 L三角瓶中，置于30°C，220 rpm摇床培养48 h；后将培养液3000 g离心5 min，弃上清，沉淀用200 mL含有0.5%甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30°C，220 rpm条件下诱导培养。每隔12 h补加0.5 mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5%，同时取上清用于酶活性检测。以同样的方法构建包含信号肽的突变体序列的重组载体，转化毕赤酵母GS115获得重组菌株。

（2）重组漆酶的纯化

收集摇瓶表达的重组蛋白酶上清液，通过10kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组漆酶Lcc9-M2和漆酶Lcc9，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取漆酶Lcc9及突变体Lcc9-M2浓缩液5.0 mL经预先用10 mmol/L 磷酸缓冲液 (pH 6.0)平衡过的HiTrap Q Sepharose XL阴离子柱，然后用1 mol/L 的NaCl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。对纯化后的蛋白进行蛋白电泳，利用考马斯亮蓝染色液进行染色，结果表明重组漆酶及重组漆酶突变体在毕赤酵母中得到了表达，且经纯化之后达电泳纯(图1)。

实施例3 重组催化活性提高的漆酶突变体和野生型的活性分析

采用ABTS为底物对本发明的漆酶进行活性分析。具体方法如下：漆酶酶活通过测定漆酶在50 mM Tris-NaOH缓冲液（pH 2.5）中对1mM ABTS(ε₄₂₀=36000 M^-1.cm^-1)的氧化速度确定。反应于30℃下反应3 min，检测波长420 nm。漆酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟生成l μmol氧化产物所需的酶量。

（1）最适pH分析比较

经纯化的实施例2表达的漆酶Lcc9及突变体Lcc9-M2在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 2.0～4.0的Tris-氢氧化钠缓冲体系。纯化的漆酶Lcc9及突变体Lcc9-M2在不同pH的缓冲体系、30°C下测定的最适pH结果（图2）表明Lcc9及突变体Lcc9-M2的最适pH均为2.5。

（2）最适温度分析比较

纯化的漆酶在各自最适pH条件下，测定不同温度（30-70℃）下的酶活性，分析实验结果（图3）表明，Lcc9及突变体Lcc9-M2最适温度均为60℃，两者的整体变化趋势也相近。

（3）比活分析比较

纯化后（实施例2）的野生型漆酶Lcc9，与突变体Lcc9-M2在pH 2.5 60℃件下进行酶促反应以测定其酶活性。

比活测定结果如图4所示，野生型Lcc9的比活为315 U/mg，突变体Lcc9-M2的比活为695 U/mg，较野生型提高了约220%。

以上为本申请的具体实施方式，并不限定本申请的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 提高漆酶催化活性的方法及突变体Lcc9-M2、基因和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 525

<212> PRT

<213> 灰拟鬼伞(Coprinopsiscinerea)

<400> 1

Met Ser Arg Lys Leu Phe Ser Leu Ala Tyr Leu Ala Val Val Leu Val

1 5 10 15

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<211> 505

<212> PRT

<213> 灰拟鬼伞(Coprinopsiscinerea)

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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gatggagtta cacaatgtcc tatcgcacag aatggcgaat catttgaata tagatttaac 360

gcaggaaacg aagcaggaac attctggtac cattcacatt tcggcacgca atattgtgat 420

ggacttagag ggccattggt catttacgat cctaacgatc ctcatagaaa cctttatgat 480

gttgataacg cagatacagt tatcacactt gttgattggt atcatcttca agcaccttca 540

atcgaaggac ctgcactttc agatgcaaca cttatcaacg gaaagggtcg cagacctgga 600

ggacctgaaa cagatatcgc aatcgttaac gttcaaagaa acagaagata tagatttaga 660

cttgtttcaa tgtcatgtga tcctaactat aaattctcga ttgatggaca taaacttaca 720

gttatcgaag cagatggaca acttacagaa cctcttatgg ttgatgaaat ccaaatcttc 780

gccggccaga ggtactcatt tgttctttca gcaaatcggc cagtaggtaa ttattggatc 840

agagcaatcc ctaacgttgg atcaaacaac cttcctaact tcagtagcgg aggaatcaac 900

tcagcaatcc ttagatatgc aggagcacct aacgcaaacc cgacgtctac gcctgtcacg 960

aaccctgttg cacttcatga atcaaacctt catgcacttc ttaaccctgg agcacctgga 1020

ggatcaggac ctgcagatga gaatatagtt cttcaaatgg gacttggacc tgcaggattt 1080

gaaatcaacg gagttacatg ggcaaaccct gattcacctg ttatggttca aatcatgaac 1140

ggagttcctc ctgcagatat cgttccttca ggagcaatcc atacacttcc tagaaacaga 1200

gttgttgaag tttcaatccc tggatttgaa cttgcaggac ctcatccttt ccacctgcat 1260

ggacatgcat tcagcgtggt tagatcagca ggatcatcaa catataacta tgagaatccc 1320

gttagaagag atgttgttga tgttggagga gcatcagata acgttacaat cagatttaca 1380

acagataacc ctggaccttg gttcttccac tgccatatcg aatttcatct tgttcttgga 1440

cttgcaatgg tattcatgga ggcaccttca gatatccctt caacatcacc tcctcctcct 1500

tcatggtcag aactttgtcc taaatttgaa tcacttcctg catcagcaac atcaatccaa 1560

atcgttccta caccttgatg a 1581

<210> 6

<211> 1521

<212> DNA

<213> 灰拟鬼伞(Coprinopsiscinerea)

<400> 6

cagatactag gaccaaccag caccatgact gtttcaaaca tcgatgcatc acctgatgga 60

tttaatcgtc cagtagtcgc tgttaacgga caacatcctg gcccactagt acgtgcgaac 120

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gttagaagag atgttgttga tgttggagga gcatcagata acgttacaat cagatttaca 1320

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cttgcaatgg tattcatgga ggcaccttca gatatccctt caacatcacc tcctcctcct 1440

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atcgttccta caccttgatg a 1521

<210> 7

<211> 1581

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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caaacatcag ttcattggca tggagtgttc cagcacggaa cagcatgggc agatggacct 300

gatggagtta cacaatgtcc tatcgcacag aatggcgaat catttgaata tagatttaac 360

gcaggaaacg aagcaggaac attctggtac cattcacatt tcggcacgca atattgtgat 420

ggacttagag ggccattggt catttacgat cctaacgatc ctcatagaaa cctttatgat 480

gttgataacg cagatacagt tatcacactt gttgattggt atcatcttca agcaccttca 540

atcgaaggac ctgcactttc agatgcaaca cttatcaacg gaaagggtcg cagacctgga 600

ggacctgaaa cagatatcgc aatcgttaac gttcaaagaa acagaagata tagatttaga 660

cttgtttcaa tgtcatgtga tcctaactat aaattctcga ttgatggaca taaacttaca 720

gttatcgaag cagatggaca acttacagaa cctcttatgg ttgatgaaat ccaaatcttc 780

gccggccaga ggtactcatt tgttctttca gcaaatcggc cagtaggtaa ttattggatc 840

agagcaatcc ctgatgttgg atcaaacaac cttcctaact tcagtagcgg aggaatcaac 900

tcagcaatcc ttagatatgc aggagcacct aacgcaaacc cgacgtctac gcctgtcacg 960

aaccctgttg cacttcatga atcaaacctt catgcacttc ttaaccctgg agcacctgga 1020

ggatcaggac ctgcagatga gaatatagtt cttcaaatgg gacttggacc tgcaggattt 1080

gaaatcaacg gagttacatg ggcaaaccct gattcacctg ttatggttca aatcatgaac 1140

ggagttcctc ctgcagatat cgttccttca ggagcaatcc atacacttcc tagaaacaga 1200

gttgttgaag tttcaatccc tggatttgaa cttgcaggac ctcatccttt ccacctgcat 1260

ggacatgcat tcagcgtggt tagatcagca ggatcatcaa catataacta tgagaatccc 1320

gttagaagag atgttgttga tgttggagga gcatcagata acgttacaat cagatttaca 1380

acagataacc ctggaccttg gttcttccac tgccatatcg aatggcatct tgttcttgga 1440

cttgcaatgg tattcatgga ggcaccttca gatatccctt caacatcacc tcctcctcct 1500

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atcgttccta caccttgatg a 1581

<210> 8

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagatactag gaccaaccag caccatgact gtttcaaaca tcgatgcatc acctgatgga 60

tttaatcgtc cagtagtcgc tgttaacgga caacatcctg gcccactagt acgtgcgaac 120

aaaggagata actttagaat caacgttgtt aacgatctta acgatcctac aatgcttaga 180

caaacatcag ttcattggca tggagtgttc cagcacggaa cagcatgggc agatggacct 240

gatggagtta cacaatgtcc tatcgcacag aatggcgaat catttgaata tagatttaac 300

gcaggaaacg aagcaggaac attctggtac cattcacatt tcggcacgca atattgtgat 360

ggacttagag ggccattggt catttacgat cctaacgatc ctcatagaaa cctttatgat 420

gttgataacg cagatacagt tatcacactt gttgattggt atcatcttca agcaccttca 480

atcgaaggac ctgcactttc agatgcaaca cttatcaacg gaaagggtcg cagacctgga 540

ggacctgaaa cagatatcgc aatcgttaac gttcaaagaa acagaagata tagatttaga 600

cttgtttcaa tgtcatgtga tcctaactat aaattctcga ttgatggaca taaacttaca 660

gttatcgaag cagatggaca acttacagaa cctcttatgg ttgatgaaat ccaaatcttc 720

gccggccaga ggtactcatt tgttctttca gcaaatcggc cagtaggtaa ttattggatc 780

agagcaatcc ctgatgttgg atcaaacaac cttcctaact tcagtagcgg aggaatcaac 840

tcagcaatcc ttagatatgc aggagcacct aacgcaaacc cgacgtctac gcctgtcacg 900

aaccctgttg cacttcatga atcaaacctt catgcacttc ttaaccctgg agcacctgga 960

ggatcaggac ctgcagatga gaatatagtt cttcaaatgg gacttggacc tgcaggattt 1020

gaaatcaacg gagttacatg ggcaaaccct gattcacctg ttatggttca aatcatgaac 1080

ggagttcctc ctgcagatat cgttccttca ggagcaatcc atacacttcc tagaaacaga 1140

gttgttgaag tttcaatccc tggatttgaa cttgcaggac ctcatccttt ccacctgcat 1200

ggacatgcat tcagcgtggt tagatcagca ggatcatcaa catataacta tgagaatccc 1260

gttagaagag atgttgttga tgttggagga gcatcagata acgttacaat cagatttaca 1320

acagataacc ctggaccttg gttcttccac tgccatatcg aatggcatct tgttcttgga 1380

cttgcaatgg tattcatgga ggcaccttca gatatccctt caacatcacc tcctcctcct 1440

tcatggtcag aactttgtcc taaatttgaa tcacttcctg catcagcaac atcaatccaa 1500

atcgttccta caccttgatg a 1521

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtaattattg gatcagagca atccctgatg ttggatcaaa caac 44

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atcagggatt gctctgatcc aataattacc tactggccg 39

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggttcttcca ctgccatatc gaatggcatc ttgttcttgg 40

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccattcgata tggcagtgga agaaccaagg tccag 35

Claims

1.催化活性提高的漆酶突变体Lcc9-M2，其特征在于，所述漆酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或NO:4所示。

2.一种提高漆酶的催化活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型漆酶Lcc9的第285位氨基酸由Asn突变为Asp、第475位氨基酸由Phe突变为Trp，或者，将氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的野生型漆酶Lcc9的第265位氨基酸由Asn突变为Asp、第455位氨基酸由Phe突变为Trp。

3.漆酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述的催化活性提高的漆酶突变体Lcc9-M2。

4.根据权利要求3所述的漆酶突变体基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7或NO:8所示。

5.包含权利要求3所述的漆酶突变体基因的重组载体。

6.包含权利要求3所述的漆酶突变体基因的重组菌株。

7.制备催化活性提高的漆酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 用包含权利要求1所述的催化活性提高的漆酶突变体Lcc9-M2的编码基因的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

(2) 培养重组菌株，诱导表达漆酶；

(3) 回收并纯化所表达的漆酶。

8.权利要求1所述的催化活性提高的漆酶突变体Lcc9-M2被添加到饲料和食品中的应用。

9.权利要求1所述的催化活性提高的漆酶突变体Lcc9-M2用于污水处理或制备药物的应用。