CN108018265B

CN108018265B - 一种肌醇氧化酶突变体及其编码基因和应用

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Publication number: CN108018265B
Application number: CN201810104844.9A
Authority: CN
Inventors: 生举正; 王凤山; 郑爽
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2018-01-31
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2038-01-31
Also published as: CN108018265A

Abstract

本发明涉及一种肌醇氧化酶突变体及其编码基因和应用，属于基因工程技术领域。本发明以含有野生型肌醇氧化酶编码基因的质粒pACYCDuet‑MIOX‑Udh为模板，使用易错PCR技术，获得肌醇氧化酶MIOX随机突变文库；利用生物传感器高通量筛选获得高GA产量肌醇氧化酶突变体，该肌醇氧化酶突变体具有较高的催化活性，可应用于酶工程、基因工程以及代谢工程等领域。

Description

一种肌醇氧化酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种肌醇氧化酶突变体及其编码基因和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

葡萄糖二酸(Glucaric acid,GA)是一种六碳单糖衍生物，广泛存在于蔬菜、水果等植物中以及少数哺乳动物体内。葡萄糖二酸的应用同样广泛，从膳食补充剂比如D-葡糖酸钙，到降低胆固醇和抗癌药物的研究。GA被美国能源部归类为最具高价值回报的30种化合物之一，其重要性不仅在于其自身的用途，更因为它的多种具有更高价值的衍生物，比如尼龙、塑料和食品添加剂(Werpy,T.,and G.Petersen.2004.Top.value added chemicalsfrom biomass,volume 1—results of screening for potential candidates fromsugars and synthesis gas.U.S.De-partment of Energy,Washington,DC.http://www.pnl.gov/main/publications/external/technical_reports/PNNL-14808.pdf.)。

目前，GA工业生产仍几乎全部为化学方法，以葡萄糖为原料氧化合成。其中应用最多的方法为硝酸氧化法，以硝酸为氧化剂，氧化时无选择性，温度高且耗能高，但产量低，同时伴随有毒性副产物的生成，此外不可避免的成本也较高(Zhang,Z.A.-O.h.o.o.andG.W.A.-O.h.o.o.Huber,Catalytic oxidation of carbohydrates into organic acidsand furan chemi-cals.LID-10.1039/c7cs00213k[doi].(1460-4744(Electronic)))。鉴于此，目前的方法越来越满足不了对GA不断增加的需求，所以有必要寻找成本更低且环境更友好的替代方法。随着近年来合成生物学以及代谢工程的发展越来越成熟，使利用基因重组技术调节细胞功能成为可能。因此，使用生物生产系统作为活体催化剂催化合成目的产物的方法可能会得到更高的催化选择性和更高的产量，也吸引了越来越多的生物化学科学家们的研究兴趣。

GA的生物合成途径已经建成，该途径以大肠杆菌为宿主，由1-磷酸肌醇合成酶(myo-inositol-1-phosphate synthase from Saccharomyces cerevisiae,Ino1)、肌醇氧化酶(myo-inositol oxygenase from Mus musculus,MIOX)和葡萄糖醛酸脱氢酶(uronatedehy-drogenase from Pseudomonas syringae,Udh)三种外源重组蛋白组成，将底物葡萄糖最终转化为GA(Moon,T.S.,et al.,Production of Glucaric Acid from a SyntheticPathway in Recombinant Escherichia coli.Applied and EnvironmentalMicrobiology,2009.75(3):p.589-595.)。据研究表明，该路径的限速酶为肌醇氧化酶MIOX，肌醇氧化酶MIOX的活性越高则GA的产量越高(Moon,T.S.,et al.,Use of modular,synthetic scaffolds for improved production of glucaric acid in engineeredE.coli.Metabolic Engineering,2010.12(3):p.298-305.)。如何提高MIOX的活性(比如稳定性、溶解性和比活性)便成为了提高GA产量亟待解决的问题之一。SUMO标签具有可以提高蛋白的可溶性表达，将其重组在肌醇氧化酶上游，明显提高了肌醇氧化酶的溶解性(Shiue,E.and K.L.J.Prather(2014)."Improving D-glucaric acid production from myo-inositol in E.coli by increasing MIOX stability and myo-inositol transport."Metabolic Engi-neering 22(Supplement C):22-31)。此外，研究发现，该GA合成途径以大肠杆菌为宿主时，当GA产量高于5g/L时，由于伴随生产过程而产生的pH介导的酸毒性的存在(Moon,T.S.,et al.,Use of modular,synthetic scaffolds for improvedproduction of glucaric acid in engineered E.coli.Metabolic Engineering,2010.12(3):p.298-305.)，GA产量无法进一步提高，这使得更换宿主成为必要。作为在生物技术中应用得广泛而成熟仅次于大肠杆菌的工程菌株，酿酒酵母因其天然的耐酸性，成为GA合成途径更换宿主时的首选(Gupta,A.,et al.,Porting the syn-thetic D-glucaricacid pathway from Escherichia coli to Saccharomyces cerevisiae.(1860-7314(Electronic)).)。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种肌醇氧化酶突变体及其编码基因和应用。本发明以含有野生型肌醇氧化酶(Genebank：NP_064361.2)编码基因的质粒pACYCDuet-MIOX-Udh为模板，使用易错PCR技术，获得肌醇氧化酶MIOX随机突变文库；利用生物传感器高通量筛选获得高GA产量肌醇氧化酶突变体，该肌醇氧化酶突变体具有较高的催化活性，可应用于酶工程、基因工程以及代谢工程等领域。

本发明的技术方案如下：

一种肌醇氧化酶突变体MIOX(D82Y/S173N)，其特征在于，与野生型肌醇氧化酶相比，第82位的氨基酸残基由天门冬氨酸(D)突变为酪氨酸(Y)，第173位的氨基酸残基由丝氨酸(S)突变为天门冬酰胺(N)，所述肌醇氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种肌醇氧化酶突变体编码基因，其特征在于，与野生型肌醇氧化酶编码基因相比，第244位核苷酸由G突变为T，518位核苷酸由G突变为A，所述突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组质粒载体，其特征在于，含有上述肌醇氧化酶突变体编码基因。

根据本发明优选的，上述重组质粒载体为pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)和pIYC04-MIOX(D82Y/S173N)。

一种重组质粒载体，其特征在于，含有上述肌醇氧化酶突变体编码基因以及葡萄糖醛酸脱氢酶(Udh)编码基因。

根据本发明优选的，上述重组质粒载体为pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)-Udh和pIYC04-MIOX(D82Y/S173N)-Udh。

一种表达肌醇氧化酶突变体的宿主细胞，其特征在于，含有上述肌醇氧化酶突变体编码基因或重组质粒载体。

根据本发明优选的，上述宿主细胞为细菌、酵母或丝状真菌。

根据本发明优选的，上述重组质粒载体pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)和pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)-Udh的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

根据本发明优选的，上述重组质粒载体pIYC04-MIOX(D82Y/S173N)和pIYC04-MIOX(D82Y/S173N)-Udh的宿主细胞为酿酒酵母102-5b。

上述肌醇氧化酶突变体在以葡萄糖或肌醇为原料生产葡萄糖醛酸、葡萄糖二酸及其衍生物中的应用。

有益效果：

本发明公开了一种肌醇氧化酶突变型基因及其编码的肌醇氧化酶突变体，以及表达该高活性肌醇氧化酶的重组载体和宿主细胞。本发明提供的肌醇氧化酶突变体催化肌醇为葡萄糖醛酸的能力，无论在体内还是体外，均约为其野生型的4倍。肌醇氧化酶是酶法合成葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸的工具酶中的限速酶，提高该肌醇氧化酶催化活性将有利于提高葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸的产量，并扩大肌醇氧化酶在酶工程、基因工程以及代谢工程等领域的应用。

附图说明

图1为重组质粒载体pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)的物理图谱；

图2为重组质粒载体pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)和空质粒pACYCDuet-1的琼脂糖凝胶电泳图；

其中：M为marker；1为pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)经NdeI和XhoI处理的双酶切样品；2为pACYCDuet-1经NdeI和XhoI处理的双酶切样品；

图3为重组蛋白(带有SUMO标签的MIOX(D82Y/S173N))的表达纯化SDS-PAGE图；

其中：M为marker；1为含质粒pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)的BL21(DE3)的菌液上清，2为含空白质粒的pACYCDuet-1的BL21(DE3)菌液上清，3为纯化含质粒pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)的BL21(DE3)的菌液上清得到的蛋白溶液；

图4为本发明中的肌醇氧化酶突变体与野生型肌醇氧化酶体外催化活性比较折线图；

其中：control为不加酶的反应，MIOX为加野生型肌醇氧化酶条件下的反应，MIOX-D82Y/S173N为加肌醇氧化酶突变体条件下的反应；

图5为本发明中的肌醇氧化酶突变体与野生型肌醇氧化酶体内活性比较柱状图；

其中：BL21(DE3)为不含重组质粒载体的菌株，EA31为含重组质粒载体pACYCDuet-MIOX-Udh的大肠杆菌BL21(DE3)，EA31-D82Y/S173N为含重组质粒载体pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)的大肠杆菌BL21(DE3)；白色柱状图表示各菌株的荧光强度，灰色柱状图表示各菌株的GA产量；

图6为含有肌醇氧化酶突变体编码基因的重组细胞合成的葡萄糖二酸MS图谱；

其中：A为从EA31-D82Y/S173培养基中纯化所得GA的MS图；B为从SG31-D82Y/S173NGA培养基中纯化所得GA的MS图。

具体实施方式

下面结合实施例和说明书附图对本发明作进一步说明，但并不仅限于此。实施例中未作具体说明的，均按照常规操作或说明书条件进行；未作具体说明的试剂或药品，均为普通市售产品。

我们从肌醇氧化酶(MIOX)随机突变文库中筛选出可明显提高葡萄糖二酸产量的突变型MIOX，然后对其进行了序列的测定和比对后，得到可以上调MIOX的两个位点的突变，并将两突变组合得到新的肌醇氧化酶突变体，并将其命名为MIOX(D82Y/S173N)。最后对MIOX(D82Y/S173N)进行了蛋白表达和体内和体外的活性分析。

实施例1突变型肌醇氧化酶的获取

以质粒pACYCDuet-MIOX-Udh为模板，使用易错PCR技术(外包于南京金斯瑞公司)，得到MIOX的随机突变文库，然后将文库电转(2500V,6ms)至大肠杆菌BL21(DE3)，在含氯霉素(34μg/mL)的LB平板上培养12h，筛选得阳性转化子。利用GA biosensor(Rogers,J.K.andG.M.Church,Genetically encoded sensors enable real-time observation ofmetabolite production.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,2016.113(9):p.2388-2393.)参与的一锅双菌法筛选出GA产量较高的菌株，并用LC/MS测定GA产量，选取GA产量最高的三种菌株测序，与野生型肌醇氧化酶(NP_064361.2)相比，得到两个上调肌醇氧化酶MIOX活性的突变位点，分别为肌醇氧化酶MIOX的第82位(天门冬氨酸(D)突变为酪氨酸(Y))和173位(丝氨酸(S)突变为天门冬酰胺(N))。

其中，电转化时的电转感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3)的制备如下：在不含抗生素的LB培养基中过夜活化培养大肠杆菌BL21(DE3)化学转化感受态细胞(购自北京天根生化科技有限公司)，然后将活化菌液以体积比1:100的比例扩大培养100mL，培养至至OD₆₀₀为0.6～0.8，然后5000g离心10min，收集菌体，并用10％甘油重悬洗涤菌体4次，最后用1mL10％甘油重悬混匀并分装，保存于-80℃。全部过程在冰浴或者4℃的条件下进行。

其中，GA biosensor参与的一锅双菌筛选方法具体如下：在96孔摇菌板中，每孔加500μL含氯霉素(34μg/mL)的LB液体培养基，挑取LB平板上的MIOX突变文库转化子于每个孔内，过夜活化。以体积比1:100的比例转接活化菌液于一新的每孔含有新鲜LB液体培养基的96孔板中，37℃、225rpm培养3h至对数生长期，加入IPTG(终浓度0.2mmol/L)和肌醇(myo-inositol,MI，终浓度60mmol/L)继续培养2h。取一部分菌液测OD₆₀₀，剩余菌液3000rpm离心10min。取180μL上清与120μL GA biosensor菌液混合，将混合菌液培养40min，之后测定菌液的荧光强度(ex＝485nm,em＝528nm)，将荧光强度除以相应的OD₆₀₀，并对数据排列，筛选出最高的7％和最低的3％。

其中，上述筛选方法中所使用的GA biosensor菌液的获得方法如下：将质粒pJKR-H-cdaR(购自addgene)转入大肠杆菌DH5α(购自北京天根生化科技有限公司)中，得GAbiosensor菌株。过夜活化GA biosensor菌株，以1:100的比例转接菌液至新鲜的含有氨苄抗生素(100μg/mL)的LB培养基培养8h。收取菌液，将菌液浓缩四倍后用于一锅双菌筛选方法。

其中，大肠杆菌DH5α的转化按照感受态细胞的说明书操作。

其中，LC/MS分析GA产量的方法如下：将筛选所得的GA产量较高的3菌株过夜活化。以体积比1:100的比例转接至3ml新鲜的含34μg/mL氯霉素的LB液体培养基，37℃、225rpm培养3h至对数生长期，加入IPTG(终浓度0.2mmol/L)和肌醇(myo-inositol,MI，终浓度60mmol/L)，降温度至22℃继续培养20h。收集菌液，将0.22μm滤膜过滤后的含60％乙腈的菌液用LC/MS(Thermo 3000Ultimate HPLC和Thermo LCQ FLEET MS)分析。使用的液相柱为Therom EMD SeQuant HILIC column(长150mm，内径2.1mm，颗粒粒径3.5μm)，流动相有两种，流动相A为20mM乙酸铵，流动相B为乙腈。液相程序为30min内流动相B从80％降到20％，0.1min内，流动相B从20％升为80％，并保持80％11.9min，程序结束。

实施例2含有重组质粒载体的宿主细胞的构建

根据实施例1测序检测到的两个氨基酸残基突变位点，以野生型肌醇氧化酶编码基因(Genebank：NM_019977)为模板，利用定点突变的方法将244位核苷酸由G突变为T、518位核苷酸由G突变为A，得到双位点突变的SUMO-MIOX(D82Y/S173N)基因序列，并将其重组到质粒载体pACYCDuet-1和pACYCDuet-MIOX-Udh的MCS2的NdeI和XhoI酶切位点之间，得重组质粒载体pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)(其物理图谱见图1)和pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)-Udh，将质粒载体pACYCDuet-MIOX以及上述原始质粒载体和重组质粒载体分别转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(外包于南京金斯瑞公司)，获得分别含有pACYCDuet-MIOX、pACYCDuet-1、pACYCDuet-MIOX-Udh、pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)、pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)-Udh的大肠杆菌BL21(DE3)。

其中，双定点突变的SUMO-MIOX(D82Y/S173N)基因序列为为提高MIOX(D82Y/S173N)的可溶性表达，在MIOX(D82Y/S173N)基因序列(SEQ ID NO.2)上游组装了SUMO标签，重组后位于质粒载体pACYCDuet-1的MCS2中，在IPTG诱导型启动子乳糖操纵子lac的控制下表达。

其中，pACYCDuet-MIOX为在pACYCDuet-1的MCS2的NdeI和XhoI酶切位点之间插入SUMO-MIOX的核酸序列；pACYCDuet-MIOX-Udh为在pACYCDuet-1的MCS2的NdeI和XhoI酶切位点之间插入SUMO-MIOX的核酸序列，并在pACYCDuet-1的MCS1的NcoI和SalI酶切位点之间插入Udh的核酸序列所得。

实施例3重组质粒载体的酶切和电泳

分别将实施例2中制备的含pACYCDuet-1和含pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)的大肠杆菌BL21(DE3)菌液以体积比1:500的比例接种于氯霉素浓度为34μg/mL的LB液体培养基中，37℃，225rpm过夜活化12h，用质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I(购自OMEGA Bio-tek公司)并按照质粒提取试剂盒说明书提取菌液中的质粒。

使用NdeI和XhoI(购自Thermo Scientific公司)对上述提取的空质粒pACYCDuet-1和重组质粒pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)进行双酶切，并进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图2。

其中，双酶切20μL反应体系：质粒，200ng；内切酶XhoI，1μL；内切酶NdeI，1μL；Reaction Buffer，2μL；H₂O，补足至20μL。37℃水浴2h。操作按照NdeI和XhoI(购自ThermoScientific公司)的说明书进行。

实施例4肌醇氧化酶突变体的表达和纯化

将实施例2制备的含pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)和含pACYCDuet-1的大肠杆菌BL21(DE3)，在含氯霉素(34μg/mL)的LB液体培养基中过夜活化。

将活化后的菌液按体积比1:100的比例接入含有34μg/mL氯霉素的液体LB培养基中，37℃，225rpm震荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8之间(约3h)，加入IPTG(终浓度0.2mmol/L)，22℃，225rpm，诱导20h。离心(8000g，4℃)20min，收集菌体，并用上样缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,pH＝7.6；0.5mol/L NaCl；5mmol/L咪唑)重悬，超声破碎(工作3s，间歇5s，振幅35％，能量1500kJ，4℃)30min，将破碎菌体离心(12000g，4℃)30min，上清用0.22μm滤膜过滤。将样品上样到Ni-Sepharose 6Fast Flow(购自GE healthcare)柱上纯化，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对诱导后重组蛋白的表达情况进行鉴定，结果如图3所示，含pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)的大肠杆菌有目的蛋白表达，含pACYCDuet-1的大肠杆菌无目的蛋白表达。

其中，目的蛋白纯化步骤按照GE healthcare手册中亲和色谱方法纯化。

其中，SDS-PAGE使用胶浓度为10％的预制胶(购自南京金斯瑞生化科技有限公司)，电压为140V，至前沿条带到达底部时停止电泳，然后进行染色和脱色。电泳具体操作按照预制胶所附说明书进行。

实施例5重组蛋白体外活性

将实施例2制备的含pACYCDuet-MIOX和含pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)的大肠杆菌BL21(DE3)，在含氯霉素(34μg/mL)的LB液体培养基中过夜活化，按照实施例4的方法进行诱导和纯化，得野生型MIOX和突变型MIOX(D82Y/S173N)。

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)对上述纯化所得蛋白进行浓度测定，得野生型MIOX和突变型MIOX(D82Y/S173N)蛋白浓度分别为0.154mg/mL和0.220mg/mL，然后配置肌醇氧化酶反应体系，将反应体系在37℃水浴中反应2h。将肌醇氧化酶反应体系沸水浴10min以停止反应的进行，反应体系中所生成的葡萄糖二酸的浓度用Udh检测液进行测定。将20μL肌醇氧化酶反应液与80μL Udh检测液混合，于37℃水浴中反应2h。测定340nm下的吸光度，根据A₃₄₀的大小分析葡萄糖二酸(Glucaric acid,GlcUA)的产量，结果如图4所示，突变型MIOX(D82Y/S173N)的催化能力是野生型MIOX的4倍。

其中，肌醇氧化酶反应体系如下：50mM MES(pH 3–6.5)或者Tris-HCl(pH 7–9),2mM L-cysteine,1mM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂,10mM肌醇以及35.4μg/mL纯化的蛋白。

其中，Udh检测液配方如下：16.25μg/mL纯化的Udh蛋白,62.5mM PBS和2mM NAD⁺。

实施例6重组蛋白体内活性

分别将实施例2中制备的含质粒pACYCDuet-MIOX-Udh和含重组质粒pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)-Udh的大肠杆菌BL21(DE3)(分别命名为EA31和EA31-D82Y/S173N)以及不含质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，在含氯霉素(34μg/mL)的LB液体培养基中过夜活化。

将活化后的菌液按体积比1:100的比例接入含有34μg/mL氯霉素的液体LB培养基中，37℃，225rpm震荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8之间(约3h)，加入IPTG(终浓度0.2mmol/L)和肌醇(myo-inositol,MI，终浓度60mmol/L)诱导，继续培养2h。其余操作同实施例1中所述的一锅双菌筛选方法，得各菌株的荧光强度。GA产量用实施例1中所述的LC/MS方法测定。将所得荧光强度与OD₆₀₀的比值及GA产量的数据结果进行处理(见图5)，结果显示，含有重组质粒pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)-Udh的大肠杆菌BL21(DE3)，即EA31-D82Y/S173N的GA产量较高，大约是野生型EA31的4倍，说明突变型MIOX(D82Y/S173N)的体内活性高于野生型MIOX。

实施例7含有MIOX突变体重组细胞合成葡萄糖二酸的MS验证

将实施例2中制备的含重组质粒pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)-Udh的大肠杆菌BL21(DE3)的大肠杆菌(命名为EA31-D82Y/S173N)在含氯霉素(34μg/mL)的LB液体培养基中过夜活化。将活化后的菌液以体积比1:100的比例转接至200mL新鲜的含34μg/mL氯霉素的培养基，37℃、225rpm培养约3h至对数生长期(OD₆₀₀为0.6-0.8)，加入IPTG(终浓度0.2mmol/L)和肌醇(myo-inositol,MI，终浓度60mmol/L)，于温度22℃下继续培养20h。

按照实施例2的重组质粒的构建方法将双定点突变的SUMO-MIOX(D82Y/S173N)基因序列重组到质粒载体pIYC04上，得重组质粒载体pIYC04-MIOX(D82Y/S173N)-Udh，并转化进入酿酒酵母102-5b。

将上述制备的含有质粒pIYC04-MIOX(D82Y/S173N)-Udh的酿酒酵母102-5b(命名为SG31-D82Y/S173N)于其相应的培养基中活化24h。将活化后的菌液以1:100的体积比转接至200mL新鲜的培养基中，30℃、250rpm培养48h。

收集两菌株的菌液，离心(8000g，4℃)20min，获取上清，然后将上清浓缩至约10mL。将浓缩后的上清用affi-gel纯化。将纯化后的液体用P2柱(长30cm，柱体积25ml)分离纯化和除盐。搜集P2柱流出液，每管2mL，用MS对P2柱流出液分析，结果如图6所示，两菌株均有葡萄糖二酸的生成。

其中，affi-gel及P2柱填料均购自bio-rad生命医学产品有限公司，相应纯化过程的操作按照其所附说明书进行。

其中，酿酒酵母的转化按照S.c.EasyComp^TM Transformation Kit(购自invitrogen生命科技公司)所附说明书进行操作。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种肌醇氧化酶突变体及其编码基因和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 285

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Lys Val Asp Val Gly Pro Asp Pro Ser Leu Val Tyr Arg Pro Asp

1 5 10 15

Val Asp Pro Glu Met Ala Lys Ser Lys Asp Ser Phe Arg Asn Tyr Thr

20 25 30

Ser Gly Pro Leu Leu Asp Arg Val Phe Thr Thr Tyr Lys Leu Met His

35 40 45

Thr His Gln Thr Val Asp Phe Val Ser Arg Lys Arg Ile Gln Tyr Gly

50 55 60

Ser Phe Ser Tyr Lys Lys Met Thr Ile Met Glu Ala Val Gly Met Leu

65 70 75 80

Asp Tyr Leu Val Asp Glu Ser Asp Pro Asp Val Asp Phe Pro Asn Ser

85 90 95

Phe His Ala Phe Gln Thr Ala Glu Gly Ile Arg Lys Ala His Pro Asp

100 105 110

Lys Asp Trp Phe His Leu Val Gly Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ile

115 120 125

Met Ala Leu Trp Gly Glu Pro Gln Trp Ala Val Val Gly Asp Thr Phe

130 135 140

Pro Val Gly Cys Arg Pro Gln Ala Ser Val Val Phe Cys Asp Ser Thr

145 150 155 160

Phe Gln Asp Asn Pro Asp Leu Gln Asp Pro Arg Tyr Asn Thr Glu Leu

165 170 175

Gly Met Tyr Gln Pro His Cys Gly Leu Glu Asn Val Leu Met Ser Trp

180 185 190

Gly His Asp Glu Tyr Leu Tyr Gln Met Met Lys Phe Asn Lys Phe Ser

195 200 205

Leu Pro Ser Glu Ala Phe Tyr Met Ile Arg Phe His Ser Phe Tyr Pro

210 215 220

Trp His Thr Gly Gly Asp Tyr Arg Gln Leu Cys Ser Gln Gln Asp Leu

225 230 235 240

Asp Met Leu Pro Trp Val Gln Glu Phe Asn Lys Phe Asp Leu Tyr Thr

245 250 255

Lys Cys Pro Asp Leu Pro Asp Val Glu Ser Leu Arg Pro Tyr Tyr Gln

260 265 270

Gly Leu Ile Asp Lys Tyr Cys Pro Gly Thr Leu Ser Trp

275 280 285

<210> 2

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgaaagtgg acgttggtcc ggatccgagc ctggtgtacc gtccggacgt tgatccggag 60

atggcgaaga gcaaagatag cttccgtaac tataccagcg gcccgctgct ggaccgtgtt 120

tttaccacct acaaactgat gcacacccac cagaccgtgg acttcgttag ccgtaagcgt 180

atccaatacg gtagcttcag ctacaagaaa atgaccatca tggaagcggt gggcatgctg 240

gactatctgg ttgatgagag cgacccggat gtggacttcc cgaacagctt ccacgcgttt 300

cagaccgcgg aaggtatccg taaagcgcac ccggataagg actggtttca cctggttggt 360

ctgctgcacg acctgggcaa gattatggcg ctgtggggcg agccgcagtg ggcggtggtt 420

ggtgatacct tcccggtggg ttgccgtccg caagcgagcg tggttttctg cgacagcacc 480

tttcaggata acccggacct gcaagatccg cgttacaaca ccgaactggg catgtatcag 540

ccgcactgcg gcctggaaaa cgtgctgatg agctggggtc acgacgagta cctgtaccaa 600

atgatgaagt tcaacaagtt cagcctgccg agcgaggcgt tctacatgat ccgtttccac 660

agcttttatc cgtggcacac cggtggcgat taccgtcagc tgtgcagcca gcaagatctg 720

gacatgctgc cgtgggttca agaattcaac aagttcgacc tgtacaccaa gtgcccggac 780

ctgccggatg tggagagcct gcgtccgtac tatcaaggtc tgattgataa atactgcccg 840

ggcaccctga gctgg 855

Claims

1.一种肌醇氧化酶突变体MIOX(D82Y/S173N)，其特征在于，与野生型肌醇氧化酶相比，第82位的氨基酸残基由天门冬氨酸(D)突变为酪氨酸(Y)，第173位的氨基酸残基由丝氨酸(S)突变为天门冬酰胺(N)，所述肌醇氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种肌醇氧化酶突变体编码基因，其特征在于，与野生型肌醇氧化酶编码基因相比，第244位核苷酸由G突变为T，518位核苷酸由G突变为A，所述突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组质粒载体，其特征在于，含有权利要求2所述的肌醇氧化酶突变体编码基因。

4.如权利要求3所示的重组质粒载体，其特征在于，重组质粒载体为pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)和pIYC04-MIOX(D82Y/S173N)。

5.一种重组质粒载体，其特征在于，含有权利要求2所述的肌醇氧化酶突变体编码基因以及葡萄糖醛酸脱氢酶(Udh)编码基因。

6.如权利要求5所示的重组质粒载体，其特征在于，重组质粒载体为pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)-Udh和pIYC04-MIOX(D82Y/S173N)-Udh。

7.一种表达肌醇氧化酶突变体的宿主细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的肌醇氧化酶突变体编码基因或权利要求3～6任一项所述的重组质粒载体；

所述宿主细胞为细菌、酵母或丝状真菌。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，权利要求3～6中的重组质粒载体pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)和pACYCDuet-MIOX(D82Y/S173N)-Udh的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，pIYC04-MIOX(D82Y/S173N)和pIYC04-MIOX(D82Y/S173N)-Udh的宿主细胞为酿酒酵母102-5b。

9.权利要求1所述的肌醇氧化酶突变体在以葡萄糖或肌醇为原料生产葡萄糖醛酸、葡萄糖二酸及其衍生物中的应用。