CN107488639B - 甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用 - Google Patents

甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用 Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract

本申请公开了分子生物学领域的甲苯单加氧酶，所述甲苯单加氧酶的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示。本发明的积极进步效果在于：含所述甲苯单加氧酶的基因工程菌能有效催化硫醚底物不对称氧化，获得高光学纯度的（R）构型亚砜。相对于其它现有的制备方法，使用所述制备方法反应时间短，反应条件温和，对环境友好，操作简便。

Description

甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用。
背景技术
手性亚砜是一类非常重要的生物活性物质，可作为手性中间体、辅剂、手性配体、催化剂以及临床药物，在有机合成和药物合成中有广泛的应用。目前，大多数化学催化剂在催化反应中还存在过度氧化、副产物多和反应条件苛刻等不足，且这些化学催化反应体系通常使用重金属催化剂和过氧酸等强氧化剂，不利于环境保护和可持续性发展的需求。生物酶的高效和高选择性，使得生物催化技术可望发展成为工业化绿色制备手性亚砜类药物的新途径。但现有研究表明，高活性，高对映选择性和高底物耐受性的手性亚砜合成酶还十分匮乏，无法满足绿色工业化生产的需求，获得高催化效率的生物酶和相应的生物催化合成方法，仍然是手性亚砜生物催化制备发展过程中的难点和瓶颈。
发明内容
本发明目的是提供一种甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用。
为了达到上述目的，本发明提供如下基础技术方案：甲苯单加氧酶（pmTOM），包含pmTOM-A和pmTOM-B两个亚基；两个所述亚基的氨基酸残基序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。
pmTOM是甲苯单加氧酶的英文解释。
本发明所涉及的甲苯单加氧酶（pmTOM）是从实验室保存的菌种中分离获得，获得的方法为本领域常规方法；较佳地为从重组表达pmTOM的基因工程菌中分离获得或者人工合成获得。
以下是对基础技术方案的优化：
优化方案一，基于基础方案：所述甲苯单加氧酶具有催化硫醚底物单加氧生成手性亚砜的功能。
优化方案二，基于基础方案或者优化方案一：所述的甲苯单加氧酶在手性亚砜制备中的应用。
优化方案三，基于基础方案或者优化方案一：编码如权利要求1或2所述的甲苯单加氧酶的基因。
优化方案四，基于优化方案三：本发明所述的甲苯单加氧酶（pmTOM）基因是从本实验室保存的菌种中克隆获得，获得的方法为本领域常规；较佳地为提取菌株基因组DNA，通过PCR扩增获得。
优化方案五，基于优化方案三：一种包含优化方案三所述基因的重组表达载体。
本发明所述重组表达载体由通过本领域常规方法将所述pmTOM的基因连接于各种骨架载体上构建而成；较佳地，可通过下述方法制得：将通过PCR 所得的pmTOM-A和pmTOM-B基因扩增产物和骨架载体pETDute-1用限制性内切酶酶切，经连接酶连接后形成重组表达载体pETDute1- pmTOM。
优化方案七在实现时，包括以下步骤：将培养的基因工程菌，悬浮于缓冲液，加入硫醚底物，放入摇床反应后，萃取并收集有机相，用无水硫酸钠干燥，离心除去硫酸钠并过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，获得（R）构型的手性亚砜。
优化方案八，基于优化方案五：一种包含优化方案五所述重组载体的基因工程菌。
本发明所述基因工程菌由通过本领域常规方法将所述重组表达载体转化至宿主微生物中制得；所述宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足所述重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的甲苯单加氧酶基因可被有效表达即可；较佳地，将所述重组表达质粒pETDute1- pmTOM转化至大肠杆菌 BL21(DE3)中。
本发明所述的基因工程菌既可以是含所述甲苯单加氧酶的休止细胞，生长中的细胞，也可以是固定化的细胞，或者纯化后的甲苯单加氧酶蛋白。较佳的为含所述甲苯单加氧酶的休止细胞。
本发明的积极进步效果在于：含所述甲苯单加氧酶的基因工程菌能有效催化硫醚底物不对称氧化，获得高光学纯度的（R）构型亚砜。相对于其它现有的制备方法，使用所述制备方法反应时间短，反应条件温和，对环境友好，操作简便。
含甲苯单加氧酶重组蛋白的基因工程菌催化硫醚底物的反应过程为：
Figure 552059DEST_PATH_IMAGE001
本发明所述的甲苯单加氧酶的制备方法，包括如下步骤：培养所述基因工程菌，加入IPTG诱导剂后，从细胞中获得甲苯单加氧酶；所述培养的方法和条件为本领域常规的方法和条件，可以根据宿主类型和培养方法等因素进行适当的选择，只要使基因工程菌能够生长并产生所述亚砜还原酶即可；较佳地，为下述方法：挑取单菌落于2 mL LB培养基，于37℃摇床180 rpm的转速下培养12 h后，转入含有 50 mL LB 培养基的 250 mL 的大摇瓶，培养至OD600=0.6时加入终浓度为0.2 μM的IPTG，20℃下继续培养14 h后，于5000 rpm 的条件下离心去除上清液，获得含所述亚砜还原酶的菌株细胞；所述培养所用的培养基为本领域任何可使所述基因工程菌生长并产生所述亚砜还原酶的培养基；较佳地为LB 培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0。
附图说明
图1为本发明甲苯单加氧酶重组表达质粒 pETDute1- pmTOM的示意图；
图2为pmTOM重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图片；泳道1为蛋白质分子量标志；泳道2为pmTOM重组蛋白的表达情况，箭头所示分别为pmTOM-A和pmTOM-B蛋白条带。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：甲苯单加氧酶基因的获得，包括以下步骤：
以基因组DNA为模板，使用引物F：5’- CCGGGGATCCGATGAGAAGTTTCTTTCAATC -3’和R：5’- AATTGTCGACTTAGGAGTTCCGGCCGTCCG -3进行PCR扩增获得pmTOM-A基因；使用引物F：5’-CCGGAGATCTCATGTGGGAATACATCAAGTAC-3’和R：5’-TTAACTCGAGGCCGCGAGCCAAGGAAGGAC-3’ 进行PCR扩增获得pmTOM-B基因。PCR反应体系如下：2×TaqPCR Master Mix 10.0 μL、基因组DNA 1μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 8.0 μL。PCR反应条件：95℃ 10 min； 98℃ 10s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环循环；72℃延伸10 min。PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳验证是否获得符合目的基因大小的片段。
实施例2：甲苯单加氧酶基因表达载体构建，包括以下步骤：
用限制性内切酶BamH I 和Sal I对含有pmTOM-A基因序列的DNA 片段及载体pETDute-1进行双酶切，酶切回收的目的片段和载体。用T4 DNA连接酶，16 ℃连接4 h后，连接产物转化大肠杆菌DH5α。过夜培养后，挑取长出的单克隆菌落摇菌并提取质粒，利用BamHI 和Sal I对重组质粒pETDute1-pmTOMA进行双酶切检测。接着，接着用Bgl II和Xho I对pmTOM-B基因及pETDute1-pmTOMA进行同样的操作后，获得重组载体pETDute1-pmTOM，并进行DNA测序以确保序列准确。最后将测序准确的阳性重组质粒转化入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，甘油（终浓度为20%）保存于-80 ℃冰箱。
实施例3：甲苯单加氧酶重组蛋白的获得
将保存于甘油中含pETDute1- pmTOM质粒的基因工程菌BL21(DE3)划平板活化后，挑单菌落于3 ml含相应抗生素的液体LB培养基中，37 ℃振荡培养12 h，次日以1%接种量转接于新鲜的含抗生素的50 mL LB液体培养基中，37 ℃ 250 rpm振荡培养OD600为0.6（约3h），加入终浓度为0.2 mM的IPTG，25 ℃ 160 rpm诱导培养14 h。诱导结束后8000 rpm/min离心5 min收集菌体，菌体重悬于PBS缓冲液中，超声波破碎菌体，15000 rpm离心5 min去细胞碎片，取上清与5x上样缓冲液混合后，于恒温金属浴中100 ℃加热5 min后作SDS-PAGE电泳分析。图2的结果说明，获得了大量的可溶性表达的重组甲苯单加氧酶。
实施例4：利用重组甲苯单加氧酶制备（R）构型手性苯甲亚砜，包括以下步骤：
1）基因工程菌的培养：挑取构建好的基因工程菌单菌落于2 mL LB培养基，于37℃摇床180 rpm的转速下培养12 h后，转入含有50 mL LB 培养基的250 mL 的大摇瓶，培养至OD600=0.6时加入终浓度为0.2 μM的IPTG，继续培养14 h后，于5000 rpm 的条件下离心去除上清液，获得菌株的湿细胞备用；
2）生物转化：将所培养菌株的湿细胞，以30 g /L 的细胞浓度悬浮于 5 mL、pH为7.5的PBS缓冲液中，将底物苯甲硫醚4.5 mg加入上述5 mL反应体系中，放入摇床于30℃，250 rpm条件下反应16 h后，加入乙酸乙酯萃取，收集15瓶萃取后的有机相，用无水硫酸钠干燥，离心去除硫酸钠并过滤。加压蒸去溶剂，柱层析分离，获得（R）-苯甲亚砜。产物做手性HPLC分析，（R）-苯甲亚砜8.4%产率，99% ee。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
<110> 遵义医学院
<120> 甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Arg Ser Phe Phe Gln Ser Ile Phe Gly Lys Ala Val Gln Lys Gln
1 5 10 15
Leu Arg Ile Leu Pro Gln Asp Ile Thr Ile Ser Leu Asn Pro Gly Gln
20 25 30
Thr Leu Met Ser Tyr Arg Asp Arg Leu Ser Glu His Leu Ala Leu Arg
35 40 45
Gly Cys Ala Val Cys Thr Leu Glu Ala Val Leu Ala Asn Gly Ile Ala
50 55 60
Tyr Pro His Asp Cys Thr Val Gly Thr Cys Ala Ser Cys Lys Thr Arg
65 70 75 80
Leu Lys Gln Gly Arg Val Arg Glu Ala Thr Pro Phe Gly Tyr Thr Leu
85 90 95
Ser Lys Ala Glu Leu Asp Ala Gly Tyr Ile Leu Ala Cys Gln Ala Phe
100 105 110
Pro Arg Asp Glu Leu Thr Val Val Glu Ile Asp Pro Pro Ser Ala Glu
115 120 125
Ser Ser Thr Asp Leu Gly Gly Lys Arg Pro Lys Gly Ala Asn Leu Ala
130 135 140 145
Ser Leu Ile Arg Pro Val His Tyr Leu Ala Gly Gln Tyr Ala Asn Leu
150 155 160
Arg Val Pro Gly Ser Ser Arg Phe Arg Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Ala
165 170 175
Pro Gln Arg Lys Gly Gln Ser Thr Leu Glu Phe Tyr Ile Arg Lys Val
180 185 190
Pro Gly Gly Glu Phe Thr Glu Ala Leu Phe Arg Gly Glu Leu Asp Gly
195 200 205
Arg Pro Leu Glu Met Glu Ala Pro Gln Gly Thr Phe His Leu His Gly
210 215 220 225
Gly Asp Ala Pro Met Val Cys Ile Ala Gly Gly Ser Gly Leu Ala Pro
230 235 240
Leu Ile Ser Ile Leu Gln His Ala Arg Ala Trp Ile Ala Ile Gly Ala
245 250 255
Phe Pro Ala Ile Ala Ile Leu Asp Met Leu Leu Pro Leu Asp Leu Ser
260 265 270
Glu Arg Arg Met Lys Asn His Phe Trp Ala Tyr Leu Pro Ile Trp Ala
275 280 285
Ser Thr Ile Asp Ala Ala Ile Ser Arg Leu Ala Glu Gln Gly Ile Pro
290 295 300 305
Leu Glu Arg Val Phe Tyr Asp Lys Phe Thr Asp Gly Arg Asn Ser
310 315 320
<210> 2
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Trp Glu Tyr Ile Lys Tyr Tyr Phe Ala Pro Leu Val Gln Val Phe
1 5 10 15
Ala Ile Leu Gly Phe Tyr Trp Gly Gly His Tyr Thr Gly Val Ala Pro
20 25 30
Ala Leu Ala Ala Ser Trp Gly Leu Tyr Arg His Thr Phe Phe Arg Pro
35 40 45
Gly Phe Ala Trp Ser Val Ala Asn Asn Asp Leu Thr Gly Leu Gln Met
50 55 60
Ala Ala Gly Val Leu Gly Leu Ala Trp Leu Ser Val Val Pro Gly Val
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Val Trp Arg Gly Glu Arg Tyr Ala Leu Gly Val Gly Ala Phe Ala Ser
115 120 125
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130 135 140 145
Trp Arg Ala Leu Leu Ala Ile Val Val Phe Leu Gly Cys Ile Tyr Ala
150 155 160
Ile Gly Gly Gly Met Ala Val Gly Leu Cys Ser Ile Ser Met Ile Ile
165 170 175
Ala Arg Phe Trp Val Glu Ala Phe Asn Tyr Tyr Gln His Tyr Gly Gln
180 185 190
Val Arg Leu Val Gly Met Pro Ile Glu Lys Arg His Val Trp Asn His
195 200 205
Phe Gly Thr Leu Ser Arg Leu Tyr Ala Phe Glu Ile Thr Asn His Ala
210 215 220 225
Asp His His Leu Asn Ser Tyr Ile Pro Tyr Tyr Lys Leu Val Pro Asp
230 235 240
Arg Glu Ala Ile Ile Ile Pro Ser Ile Ile Ala Cys Phe Leu Ser Gly
245 250 255
Phe Ile Pro Pro Leu Trp Tyr Arg Ala Ile Ile Lys Pro Ala Leu Lys
260 265 270
Arg Trp Asp Asn Glu Tyr Ala Ser Pro Ala Glu Arg Arg Leu Ala Gln
275 280 285
Glu Gln Asn Arg Glu Ala Asp Val Phe Trp Pro Cys Glu Gln Ser Ser
290 295 300 305
Ile Pro Ile Leu Val His Ser Ser Asn Asp Ala Leu Gly Arg Glu Ser
310 315 320
Leu Leu Arg Glu Lys Val Leu Asn Leu Asn Val Leu Thr Tyr Gly Trp
325 330 335
Asp Asp Trp Phe Asn Asp Gln Gly Gly Arg Gly Ser Gln Pro Asp Gly
340 345 350
Pro Ser Leu Ala Arg Gly
355

Claims (6)

1.甲苯单加氧酶，其特征在于：所述甲苯单加氧酶包含pmTOM-A和pmTOM-B两个亚基；两个所述亚基的氨基酸残基序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。
2.如权利要求1所述的甲苯单加氧酶，其特征在于：所述甲苯单加氧酶具有催化硫醚底物单加氧生成（R）-苯甲亚砜的功能。
3.如权利要求1或2所述的甲苯单加氧酶的应用，其特征在于，所述甲苯单加氧酶在（R）-苯甲亚砜制备中的应用。
4.一种编码如权利要求1或2所述的甲苯单加氧酶的基因。
5.一种包含如权利要求4所述基因的重组表达载体。
6.一种包含如权利要求5所述的重组载体的基因工程菌。
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Applicant after: ZUNYI MEDICAL University

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