CN106544328B - 一种亚砜还原酶及其应用和制备方法 - Google Patents

一种亚砜还原酶及其应用和制备方法 Download PDF

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Abstract

本专利公开了分子生物学领域的一种亚砜还原酶及其应用和制备方法，所述亚砜还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。该亚砜还原酶应用于生物催化制备R构型手性亚砜，利用含有亚砜还原酶基因的重组表达载体，和含有该重组载体的基因工程菌，制备本发明亚砜还原酶，并利用本发明亚砜还原酶生物催化制备R构型手性亚砜。含所述亚砜还原酶的基因工程菌能有效催化消旋体亚砜的不对称拆分，获得高光学纯度的R构型亚砜。由于消旋体亚砜易于合成且价格便宜，以其作为底物以水为介质的环境中进行不对称拆分反应获取手性亚砜是经济有效的制备途径。相对于其它现有的制备方法，使用所述制备方法反应时间短，反应条件温和，对环境友好，操作简便。

Description

一种亚砜还原酶及其应用和制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种亚砜还原酶及其应用和制备方法。
背景技术
手性亚砜是重要的生物活性物质，可作为手性中间体和辅剂、手性配体、催化剂以及临床药物，在有机合成和药物合成中有广泛的应用。目前，除了一些过渡金属催化剂如钛、钒、铑能有效催化硫醚底物的不对称氧化或将消旋体亚砜动力学拆分生成手性亚砜外，大多数化学催化剂在催化反应中还存在过度氧化、副产物多和反应条件苛刻等不足，且这些化学催化反应体系通常使用重金属催化剂和过氧酸等强氧化剂，不利于环境保护和可持续性发展的需求。而生物催化的不对称反应，是合成亚砜类化合物的新途径之一。但目前，获得高催化效率的生物酶和相应的生物催化合成方法，仍然是手性亚砜生物催化制备发展过程中的难点和瓶颈。
发明内容
本发明旨在克服上述缺点，提供一种催化活性高、底物耐受性强的亚砜还原酶，以及该亚砜还原酶的制备方法和在生物学中应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下基础技术方案：一种亚砜还原酶（pmMsrA），所述亚砜还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
pmMsrA是亚砜还原酶的英文解释。本发明所涉及的亚砜还原酶是从实验室保存的菌种中克隆获得，具体获取方法为本领域常规方法；较佳地为分离获得、从重组表达所述亚砜还原酶的基因工程菌中分离获得或者人工合成获得。
技术方案之二，作为对基础方案的优化：涉及一种包含所述亚砜还原酶的重组表达载体。
本发明所述重组表达载体由通过本领域常规方法，将本发明亚砜还原酶的基因连接于各种骨架载体上构建而成；较佳地，可通过下述方法制得：将通过PCR 所得的亚砜还原酶基因扩增产物和骨架载体pET-28a用限制性内切酶BamH I 和Hind Ⅲ双酶切，再经连接酶连接，形成含有亚砜还原酶基因的重组表达载体pET-28a-pmMsrA。骨架载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，较佳地为质粒pET-28a。
技术方案三，作为对基础方案的优化：涉及一种包含所述亚砜还原酶基因重组载体的基因工程菌。
本发明所述基因工程菌由通过本领域常规方法，将所述重组表达载体转化至宿主微生物中制得；较佳地，将技术方案二制得的中含有亚砜还原酶基因的重组表达载体pET-28a-pmMsrA转化至大肠杆菌 BL21(DE3)中即可。宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的亚砜还原酶基因可被有效表达即可；较佳地为大肠杆菌BL21(DE3)。
技术方案四，本发明亚砜还原酶的制备方法，利用技术方案三获得的基因工程菌，加入IPTG诱导后，从细胞中获得重组亚砜还原酶。
获得重组亚砜还原酶的方法是：将技术方案三中制得的基因工程菌经过培养所得，培养的方法和条件为本领域常规的方法和条件，可以根据宿主类型和培养方法等因素进行适当的选择，只要使基因工程菌能够生长并产生所述亚砜还原酶即可；较佳地，采用下述方法：挑取单菌落于2 mL LB培养基，于37℃摇床180 rpm的转速下培养12 h后，转入含有50 mL LB 培养基的 250 mL 的大摇瓶，培养至OD600=0.6时加入终浓度为0.2 μM的IPTG，继续培养14 h后，于5000 rpm 的条件下离心去除上清液，获得含本发明亚砜还原酶的菌株细胞；培养所用的培养基为本领域任何可使本发明基因工程菌生长并产生本发明亚砜还原酶的培养基；较佳地为LB 培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0。
技术方案五，一种R构型手性亚砜的生物催化制备方法：利用技术方案三中获得的基因工程菌，将其悬浮于缓冲液中，向缓冲液中加入消旋体亚砜底物，放入摇床反应后，再加入乙酸乙酯、乙酸丁酯和二氯甲烷的一种或多种，进行萃取后收集有机相，向有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，离心除去硫酸钠并过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，获得R构型的手性亚砜。
技术方案六，作为对技术方案五的优化，所述缓冲液为50 mM浓度、pH 6～8的磷酸钠缓冲液；所述基因工程菌的细胞浓度为10～50 g/L；所述的摇床转速为250 rpm/min；反应温度为25～35℃；反应时间为12～24小时，较佳的为16小时；所述的消旋体亚砜底物浓度为2～10 mM。
技术方案七，作为对技术方案六的优化，所述缓冲液为50 mM浓度、pH 7.5的磷酸钠缓冲液；所述基因工程菌的细胞浓度为30 g/L；所述的摇床转速为250 rpm/min；反应温度为30℃；反应时间为16小时；所述的消旋体亚砜底物浓度为5 mM。
技术方案七，作为对基础方案五、技术方案六和技术方案七的进一步优化，制备过程中所用的基因工程菌可采用基因工程菌休止细胞、基因工程菌生长期细胞、基因工程菌固定化细胞和基因工程菌所含的MsrA重组酶蛋白中的一种。
本发明的积极进步效果在于：含所述亚砜还原酶的基因工程菌能有效催化消旋体亚砜的不对称拆分，获得高光学纯度的R构型亚砜。由于消旋体亚砜易于合成且价格便宜，以其作为底物以水为介质的环境中进行不对称拆分反应获取手性亚砜是经济有效的制备途径。相对于其它现有的制备方法，使用所述制备方法反应时间短，反应条件温和，对环境友好，操作简便。
附图说明
图1为重组表达载体 pET-28a-pmMsrA的示意图；
图2为亚砜还原酶重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图片；其中M为蛋白质分子量标志；泳道2为负对照，泳道3～8依次表示0、2、4、8、14、20h的诱导时间下pmMsrA的表达情况，箭头所示为目标蛋白条带。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：亚砜还原酶基因工程菌的构建与重组酶的获得，包括以下步骤：
使用引物F：5’-aaccGGATCCATGGTCCTGCGTTCGGAAATC-3’和R：5’-aaggAAGCTTGTTACCCTGCAGGCTCGGTG-3’，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系如下：2×TaqPCR Master Mix 10.0 μL、基因组DNA 1μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 8.0 μL。PCR反应条件：95℃ 10 min； 98℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃延伸10min，将获得的含有pmMsrA基因序列的DNA 片段分别用BamH I 和Hind III 进行双酶切，随后与同样经过BamH I 和Hind III双酶切的质粒pET-28a进行连接。用T4 DNA连接酶，16 ℃连接4 h后，连接产物转化大肠杆菌DH5α。过夜培养后，挑取长出的单克隆菌落摇菌并提取质粒，利用BamH I 和Hind III对重组质粒进行双酶切检测，并选取阳性重组质粒进行DNA序列测定，获得重组质粒pET-28a-pmMsrA，其示意图参见图1。最后将质粒pET-28a-pmMsrA转化到大肠杆菌BL21(DE3) 中，甘油（终浓度为20%）保存于-80℃冰箱。
将保存于甘油中含pET-28a-pmMsrA质粒的基因工程菌BL21(DE3)划平板活化后，挑单菌落于3 ml含相应抗生素的液体LB培养基中，37 ℃振荡培养12 h，次日以1%接种量转接于新鲜的含抗生素的50 mL LB液体培养基中，37 ℃ 250 rpm振荡培养OD600为0.6（约3h），加入终浓度为0.2 mM的IPTG，25 ℃ 160 rpm诱导培养8 h。诱导结束后8000 rpm/min离心5 min收集菌体，菌体重悬于PBS缓冲液中，超声波破碎菌体，15000 rpm离心5 min去细胞碎片，取上清与5x上样缓冲液混合后，于恒温金属浴中100 ℃加热5 min后作SDS-PAGE电泳分析。图2的结果说明，获得了大量的可溶性表达的亚砜还原酶。
实施例2:
利用重组亚砜还原酶制备R构型手性苯甲亚砜，包括以下步骤：
1）基因工程菌的培养：挑取构建好的基因工程菌单菌落于2 mL LB培养基，于37℃摇床180 rpm的转速下培养12 h后，转入含有50 mL LB 培养基的250 mL 的大摇瓶，培养至OD600=0.6时加入终浓度为0.2 μM的IPTG，继续培养14 h后，于5000 rpm 的条件下离心去除上清液，获得菌株的湿细胞备用；
2）生物转化：将所培养菌株的湿细胞，以30 g /L 的细胞浓度悬浮于 5 mL、pH为7.5的PBS缓冲液中，将底物消旋体苯甲亚砜4.2 mg加入上述5 mL反应体系中，放入摇床于30℃，250 rpm条件下反应16 h后，加入乙酸乙酯萃取，收集15瓶萃取后的有机相，用无水硫酸钠干燥，离心去除硫酸钠并过滤。加压蒸去溶剂，柱层析分离，获得R-苯甲亚砜。产物做手性HPLC分析，R-苯甲亚砜49%产率，95% ee。
产物分析：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
R-苯甲亚砜的1H NMR和13C NMR如下：δ7.63-7.60 (m, 2H), 7.51-7.46 (m,3H), 2.69 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 43.9, 123.5, 124.0, 131.09,145.63。炫光值为：[α]25D=+159.86 (c 1.00, CHCl3)。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
采用OD-H手性柱进行HPLC分析，流动相速度为1mL/min，流动相比例为异丙醇：正己烷=5：95，两种构型的保留时间分别为tR=22.6 min， tS=31.5 min。
实施例3：
利用重组亚砜还原酶制备R构型手性2-氯苯甲亚砜，包括以下步骤：
1）基因工程菌的培养：挑取构建好的基因工程菌单菌落于2 mL LB培养基，于37℃摇床180 rpm的转速下培养12 h后，转入含有 50 mL LB 培养基的 250 mL 的大摇瓶，培养至OD600=0.6时加入终浓度为0.2 μM的IPTG，继续培养14 h后，于5000 rpm 的条件下离心去除上清液，获得菌株的湿细胞备用；
2）生物转化：将所培养菌株的湿细胞，以30 g /L 的细胞浓度悬浮于 5 mL、pH为7.5的PBS缓冲液中，将底物消旋体2-氯苯甲亚砜4.25 mg加入上述5 mL反应体系中，放入摇床于30℃，250 rpm条件下反应16 h后，加入乙酸乙酯萃取，收集15瓶萃取后的有机相，用无水硫酸钠干燥，离心去除硫酸钠并过滤。加压蒸去溶剂，柱层析分离，获得R-2-氯苯甲亚砜。产物做手性HPLC分析，R-2-氯苯甲亚砜47%产率，93% ee。
产物分析：
Figure 242367DEST_PATH_IMAGE002
R-2-氯苯甲亚砜的1H NMR和13C NMR如下：δ2.73 (s,3H), 7.46 (s, 3H), 7.65(s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ44.1, 121.7, 123.8, 130.8, 131.3, 135.8,147.9。炫光值为：[α]25D=+270 (c 0.50, CHCl3)。
Figure 143196DEST_PATH_IMAGE004
采用OD-H手性柱进行HPLC分析，流动相速度为1mL/min，流动相比例为异丙醇：正己烷=5：95，两种构型的保留时间分别为tR=22.1 min， tS=23.7 min。
实施例4：
利用重组亚砜还原酶制备R构型手性3-氯苯甲亚砜，包括以下步骤：
1）基因工程菌的培养：挑取构建好的基因工程菌单菌落于2 mL LB培养基，于37℃摇床180 rpm的转速下培养12 h后，转入含有 50 mL LB 培养基的 250 mL 的大摇瓶，培养至OD600=0.6时加入终浓度为0.2 μM的IPTG，继续培养14 h后，于5000 rpm 的条件下离心去除上清液，获得菌株的湿细胞备用；
2）生物转化：将所培养菌株的湿细胞，以30 g /L 的细胞浓度悬浮于 5 mL、pH为7.5的PBS缓冲液中，将底物消旋体3-氯苯甲亚砜4.25 mg加入上述5 mL反应体系中，放入摇床于30℃，250 rpm条件下反应16 h后，加入乙酸乙酯萃取，收集15瓶萃取后的有机相，用无水硫酸钠干燥，离心去除硫酸钠并过滤。加压蒸去溶剂，柱层析分离，获得R-3-氯苯甲亚砜。产物做手性HPLC分析，R-3-氯苯甲亚砜44%产率，61.2% ee。
产物分析：
Figure 500097DEST_PATH_IMAGE002
R-3-氯苯甲亚砜的1H NMR和13C NMR如下：δ2.81 (s,3H), 7.38 (d, J = 8.0Hz, 1H), 7.43 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.52 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 8.0Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl 3 ): δ41.7, 125.4, 128.3, 129.9, 132.1。炫光值为：[α]25D=+121.7 (c 0.50, CHCl3)。
Figure 551098DEST_PATH_IMAGE004
采用OD-H手性柱进行HPLC分析，流动相速度为1mL/min，流动相比例为异丙醇：正己烷=5：95，两种构型的保留时间分别为tR=17.2 min， tS=18.3 min。
实施例5：
利用重组亚砜还原酶制备R构型手性4-氯苯甲亚砜，包括以下步骤：
1）基因工程菌的培养：挑取构建好的基因工程菌单菌落于2 mL LB培养基，于37℃摇床180 rpm的转速下培养12 h后，转入含有 50 mL LB 培养基的 250 mL 的大摇瓶，培养至OD600=0.6时加入终浓度为0.2 μM的IPTG，继续培养14 h后，于5000 rpm 的条件下离心去除上清液，获得菌株的湿细胞备用；
2）生物转化：将所培养菌株的湿细胞，以30 g /L 的细胞浓度悬浮于 5 mL、pH为7.5的PBS缓冲液中，将底物消旋体4-氯苯甲亚砜4.25 mg加入上述5 mL反应体系中，放入摇床于30℃，250 rpm条件下反应16 h后，加入乙酸乙酯萃取，收集15瓶萃取后的有机相，用无水硫酸钠干燥，离心去除硫酸钠并过滤。加压蒸去溶剂，柱层析分离，获得R-4-氯苯甲亚砜。产物做手性HPLC分析，R-4-氯苯甲亚砜49%产率，98% ee。
产物分析：
Figure 693366DEST_PATH_IMAGE002
R-4-氯苯甲亚砜的1H NMR和13C NMR如下：δ2.71 (s,3H), 7.50 (d, J = 8.0Hz, 1H), 7.58 (d, J = 8.0 Hz,2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ44.1, 125.1,129.7, 131.1, 137.4, 144.3。炫光值为：[α]25D=+198 (c 0.50, CHCl3)。
Figure 453512DEST_PATH_IMAGE004
采用OD-H手性柱进行HPLC分析，流动相速度为1mL/min，流动相比例为异丙醇：正己烷=5：95，两种构型的保留时间分别为tR=22.5 min， tS=23.6 min。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
<110> 遵义医学院
<120> 一种亚砜还原酶及制备R构型手性亚砜的方法
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Met Gly Arg Gly Ser Gly
20 25 30
Gln Gln Met Val Leu Arg Ser Glu Ile Leu Val Asn Lys Asn Val Met
35 40 45
Pro Thr Ala Glu Gln Ala Leu Pro Gly Arg Glu Thr Pro Met Ser Leu
50 55 60
Pro Glu Phe His Tyr Val Phe Lys Asp Thr Pro Leu Leu Gly Pro Phe
65 70 75 80
Phe Glu Gly Ala Ile Asp Phe Ala Ile Phe Gly Leu Gly Cys Phe Trp
85 90 95
Gly Ala Glu Arg Arg Phe Trp Gln Arg Glu Gly Val Val Ser Thr Val
100 105 110
Val Gly Tyr Ala Gly Gly Phe Thr Pro His Pro Thr Tyr Glu Glu Val
115 120 125
Cys Ser Gly Leu Thr Gly His Thr Glu Val Val Leu Val Val Phe Asp
130 135 140
Lys Asp Arg Val Ser Tyr Arg Glu Leu Leu Ala Met Phe Trp Glu Leu
145 150 155 160
His Asn Pro Thr Gln Gly Met Arg Gln Gly Asn Asp Ile Gly Thr Gln
165 170 175
Tyr Arg Ser Ala Ile Tyr Cys Thr Ser Pro Glu Gln Leu Glu Gln Ala
180 185 190
Lys Ala Ser Arg Asp Ala Phe Gln Ala Glu Leu Ser Lys Ala Gly Phe
195 200 205
Gly Glu Ile Thr Thr Glu Ile Asp Gln Ala Pro Thr Val Tyr Phe Ala Glu
210 215 220 225
Ala Tyr His Gln Gln Tyr Leu Ala Lys Asn Pro Asp Gly Tyr Cys Gly
230 235 240
Ile Gly Gly Thr Gly Val Cys Leu Pro Pro Ser Leu Gln Gly Asn Lys
245 250 255
Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His
260 265

Claims (5)

1.一种R构型手性亚砜的生物催化制备方法，其特征在于：利用含有亚砜还原酶基因的重组表达载体的基因工程菌，并将其悬浮于缓冲液中，向缓冲液中加入消旋体亚砜底物，放入摇床反应后，再加入乙酸乙酯萃取并收集有机相，向有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，离心除去硫酸钠并过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，获得R构型的手性亚砜，所述亚砜还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其中，所述消旋体亚砜底物为消旋体苯甲亚砜、消旋体2-氯苯甲亚砜或者消旋体4-氯苯甲亚砜。
2.如权利要求1所述R构型手性亚砜的生物催化制备方法，其特征在于：所述缓冲液为50 mM浓度、pH 6～8的磷酸钠缓冲液；所述基因工程菌的细胞浓度为10～50 g/L；所述的摇床转速为250 rpm；反应温度为25～35℃；反应时间为12～24小时；所述的消旋体亚砜底物浓度为2～10 mM。
3.如权利要求2所述R构型手性亚砜的生物催化制备方法，其特征在于：所述缓冲液为50 mM浓度、pH 7.5的磷酸钠缓冲液；所述基因工程菌的细胞浓度为30 g/L；所述的摇床转速为250 rpm；反应温度为30℃；反应时间为16小时；所述的消旋体亚砜底物浓度为5 mM。
4.如权利要求1～3中任一项所述的R构型手性亚砜的生物催化制备方法，其特征在于：所述基因工程菌采用基因工程菌休止细胞、基因工程菌生长期细胞或基因工程菌固定化细胞中的一种。
5.一种如权利要求1~3任一所述的亚砜还原酶在R构型手性亚砜制备中的应用，其特征在于：消旋体亚砜底物为消旋体苯甲亚砜、消旋体2-氯苯甲亚砜或者消旋体4-氯苯甲亚砜。
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