CN101423861A - L-氨基酸衍生物的生物催化制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种简单的高纯度L－氨基酸的生物催化制备方法，含多种酶的细菌Aeromonas sp.(保藏号CGMCC 2226)活细胞，在通空气的条件下，能够选择性地氧化消旋体氨基酸中D－型异构体，留下未反应的高纯度的L－氨基酸。本发明方法设计合理，无需传统方法中常用的先保护、再去保护的衍生步骤，可直接将消旋体中D－型氨基酸选择性地转化，制备过程不用金属催化剂、有机溶剂及助剂，反应在中性条件进行，除可再生的生物质外，无化学排放，属绿色环保生产过程。本发明方法路线简短，效率高，资源节省，步骤简单。本方法适于更多不同种类的氨基酸及其可能构成的各种可能混合物中D－型对映体的清除。
Description
技术领域
本发明属于化合物的制备方法，一种通过生物催化清除消旋体中D-型异构体制备高对映体纯的L-氨基酸的方法，主要涉及L-苯丙氨酸的衍生物的生物催化制备方法。
背景技术
非蛋白氨基酸，如高纯度含不同取代基的L-氨基酸衍生物，是现代新药研发的重要工具和基础原料。结构多样的非蛋白氨基酸在世界市场上一直价格昂贵，供不应求。非蛋白氨基酸等的制备能力也是一个国家新药研发能力的象征性指标，与发达国家相比，我国在该领域落后的差距较大。由于产品附加值高，进入市场容易，非蛋白氨基酸制造技术的发展竞争激烈。现行方法有化学合成法和生物转化法。前者用不对称催化剂，价格昂贵且回收难，过程中尚有保护去保护等步骤；后者有海因法，水解酶拆分法等，但每种方法都需要多步反应，工艺复杂，路线长，排放物种类多等弊端。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单的高纯度L-氨基酸的生物催化制备方法，通过以下技术方案实现：用细菌活细胞做催化剂。
在500ml摇瓶中，放置100ml培养基(营养肉汁琼脂：蛋白胨10克，牛肉提取物3克，琼脂15克，NaCl 5克，蒸馏水1000毫升)，接种细菌Aeromonas sp.(气单胞菌)，生长24小时后，离心，倾出清液，置回摇瓶中，每瓶中加入相同量消旋体D，L-氨基酸50mg；调pH7.3，通空气，透气封口，放回在控温摇床中，圆周式摇动，生物转化反应时间4-40小时，期间通过不定期采样，超滤、稀释，注入HPLC进行分析追踪转化进程，用大赛路冠醚手性色谱柱分析，分析时间控制在到120分钟，找到消旋体底物的两个等比信号峰(分布在15-60分钟，见实例色谱图)。实施中，通过HPLC上消旋体底物的两个峰中D型峰的消耗跟踪反应进程，当D的信号超出检测灵敏限度后，停止生物转化反应。反应混合物经离心收取清液，通过离子交换树脂柱分离，得到L型氨基酸衍生物。本发明所用的微生物菌株为气单胞菌，送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.2226。
本发明的有益之处是：(1)含多种酶的细菌Aeromonas sp.(气单胞菌)(CGMCC 2226)活细胞，在通空气的条件下，能够选择性地氧化消旋体氨基酸中D—型异构体，留下未反应的L—型。这一方法可用于高纯度L—型氨基酸的制备，也可以用于L—氨基酸中D—掺杂物的清除。(2)本发明方法无需传统方法中常用的先保护、再去保护的衍生步骤，可直接将消旋体中D-型氨基酸选择性地转化，留下未反应的高纯度的L-氨基酸。(3)本发明方法，路线简短，效率高，可控制产物的对映体纯度。(4)本发明方法也可用于其他类L型非蛋白氨基酸衍生物的制备。(5)本发明方法，制备过程不用金属催化剂、有机溶剂及助剂，反应在中性条件进行，除可再生的生物质外，无化学排放，属绿色环保生产过程。(6)本发明方法设计合理，资源节省，步骤简单。
附图说明
图1(A，B，C)苯丙氨酸生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。
图2(A，B，C)4-氟苯丙氨酸生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。
图3(A，B，C)2-氯苯丙氨酸生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。
图4(A，B，C)4-氯苯丙氨酸混合物转化不同时间下反应混合物的色谱图。
图5(A，B，C)2，4-二氯苯丙氨酸生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。
图6(A，B，C)3，4-二氯苯丙氨酸生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。
图7(A，B，C)2-溴苯丙氨酸生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。
图8(A，B，C)4-溴苯丙氨酸混合物转化不同时间下反应混合物的色谱图。
图9(A，B，C)4-甲基苯丙氨酸混合物生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。
图10(A，B，C)4-硝基苯丙氨酸生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。
图11(A，B，C)酪氨酸生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1高纯度L-苯丙氨酸衍生物的制备(以苯丙氨酸为例)
在500ml摇瓶中，加入100mL培养基，无菌条件下接种细菌Aeromonas sp.(CGMCC 2226)(气单胞菌)，生长24小时后，离心，倾出清液，用水洗涤，置回摇瓶中，加入相同量消旋体D，L-苯丙氨酸50mg；调解pH7.3，通空气，透气封口，放回在控温摇床中，圆周式摇动，在反应过程中，不定期的(0小时，6小时和12小时)阶段性取出一毫升样品，超滤、稀释后，，注入HPLC进行分析，追踪反应进程。用大赛路冠醚色谱柱，Crownpak CR(+)，分析时间延长到120分钟。结果参见图1，显示苯丙氨酸生物转化过程中各物质量的变化过程，其中图A：转化反应开始时t＝0：L/D＝1/1；图B：转化反应6小时后t＝6：L/D＝3/5；图C：转化反应24小时t＝24：D＝0(D-彻底消耗，只剩L)。
在图1A到图1C中，D-苯丙氨酸，保留时间＝7-9分钟，L-苯丙氨酸，保留时间＝11-15分钟。可以清楚地看出，反应时间24小时时，D-苯丙氨几乎完全转化。未反应的L-苯丙氨酸达到高ee.有一未知产物出现在18分钟。
本方法中，整个转化过程和产物的分离过程中不用有机试剂，是一个绿色环保的过程。本发明选用的Aeromonas sp.(保藏号：CGMCC 2226)(气单胞菌)，是经筛选后选择的最佳菌株。
参照实施例1的方法，制备一类高纯度L-苯丙氨酸衍生物(以苯丙氨酸为例)，结果参见表1和图2-11。图2-图11是用气单胞菌活细胞(Aeromonas sp)为催化剂的生物转化示例。
在图2A到图2C中，D-4-氟苯丙氨酸，保留时间＝5-6分钟，L-4-氟苯丙氨酸，保留时间＝6-7分钟。图2A：反应时间t＝0，L/D＝1/1；图2B：反应时间t＝18.5h：D/L＝3/4；图2C：反应时间t＝46h，D/L＝3/4。可以清楚地看出，随着反应时间延长，D-4-氟苯丙氨减少。未反应的L-4-氟苯丙氨酸达到高ee.有一未知产物出现在18分钟。
在图3A到图3C中，D-2-氯苯丙氨酸，保留时间＝35-47分钟，L-2-氯苯丙氨酸，保留时间＝42-58分钟。图3A：反应时间t＝0，L/D＝1/1；图3B：反应时间t＝18.5h：D/L＝2/5；图3C：反应时间t＝46h，D/L＝1/10。可以清楚地看出，随着反应时间延长，D-2-氯苯丙氨酸减少。未反应的L-2-氯苯丙氨酸达到高ee。
在图4A到图4C中，D-4-氯苯丙氨酸，保留时间＝15分钟，L-4-氯苯丙氨酸，保留时间＝23分钟。图4A：反应时间t＝0，L/D＝1/1；图4B：反应时间t＝6h：D/L＝2/5；图4C：反应时间t＝22h，D/L＝1/100。可以清楚地看出，随着反应时间延长，D-4-氯苯丙氨酸减少。未反应的L-4-氯苯丙氨酸达到高ee。
在图5A到图5C中，D-2，4-二氯苯丙氨酸，保留时间＝45分钟，L-2，4-二氯苯丙氨酸，保留时间＝53分钟。图5A：反应时间t＝0，L/D＝1/1；图5B：反应时间t＝6h：D/L＝2/5；图5C：反应时间t＝22h，D/L＝1/100。可以清楚地看出，随着反应时间延长，D-2，4-二氯苯丙氨酸减少。未反应的L-2，4-二氯苯丙氨酸达到高ee。
在图6A到图6C中，D-3，4-二氯苯丙氨酸，保留时间＝37分钟，L-3，4-二氯苯丙氨酸，保留时间＝42分钟。图6A：反应时间t＝0，L/D＝1/1；图6B：反应时间t＝6h：D/L＝2/5；图6C：反应时间t＝22h，D/L<1/100。可以清楚地看出，随着反应时间延长，D-3，4-二氯苯丙氨酸减少。未反应的L-3，4-二氯苯丙氨酸达到高ee。
在图7A到图7C中，D-2-溴苯丙氨酸，保留时间＝9分钟，L-2-溴苯丙氨酸，保留时间＝13-16分钟。图7A：反应时间t＝0，L/D＝1/1；图7B：反应时间t＝26h：D/L＝2/5；图7C：反应时间t＝46h，D/L<1/100。可以清楚地看出，随着反应时间延长，D-2-溴苯丙氨酸减少。未反应的L-2-溴苯丙氨酸达到高ee。
在图8A到图8C中，D-4-溴苯丙氨酸，保留时间＝22分钟，L-4-溴苯丙氨酸，保留时间＝30分钟。图8A：反应时间t＝0，L/D＝1/1；图8B：反应时间t＝6h：D/L＝2/5；图8C：反应时间t＝22h，D/L<1/100。可以清楚地看出，随着反应时间延长，D-4-溴苯丙氨酸减少。未反应的L-4-溴苯丙氨酸达到高ee。
在图9A图9C中，D-4-甲基苯丙氨酸，保留时间＝29分钟，L-4-甲基苯丙氨酸，保留时间＝35-40分钟。图9A：反应时间t＝0，L/D＝1/1；图9B：反应时间t＝6h：D/L＝2/5；图9C：反应时间t＝22h，D/L<1/100。可以清楚地看出，随着反应时间延长，D-4-甲基苯丙氨酸减少。未反应的L-4-甲基苯丙氨酸达到高ee。转化产品出现在62分钟。
在图10A图10C中，D-4-硝基苯丙氨酸，保留时间＝16分钟，L-4-硝基苯丙氨酸，保留时间＝22分钟。图10A：反应时间t＝0，L/D＝1/1；图10B：反应时间t＝18h：D/L＝2/5；图10C：反应时间t＝42h，D/L<1/100。可以清楚地看出，随着反应时间延长，D-4-硝基苯丙氨酸减少。未反应的L-4-硝基苯丙氨酸达到高ee。
在图11A图11C中，D-4-羟基苯丙氨酸(酪氨酸)，保留时间＝6分钟，L-4-硝基苯丙氨酸，保留时间＝9分钟。图11A：反应时间t＝0，L/D＝1/1；图10B：反应时间t＝18h：D/L＝4/5；图10C：反应时间t＝42h，D/L＝7/3。转化反应两天后反应自动停止。得到产物L-4-硝基苯丙氨酸的ee～40％。
表1.本发明实施实例结果汇总表
| 序号 | 底物 | 产物 | 时间(小时) | 对映体过量(％) | 产率(％) |
| 1 | (D，L)-苯丙氨酸 | L-苯丙氨酸 | 24 | 95 | 44.3 |
| 2 | (D，L)-4-氟-苯丙氨酸 | L-4-氟-苯丙氨酸 | 53 | 71.9 | 38.6 |
| 3 | (D，L)-2-氯-苯丙氨酸 | L-2-氯-苯丙氨酸 | 43 | 91.8 | 44 |
| 4 | (D，L)-4-氯-苯丙氨酸 | L-4-氯-苯丙氨酸 | 22 | >99 | 50 |
| 5 | (D，L)-2，4-二氯-苯丙氨酸 | L-2，4-二氯-苯丙氨酸 | 22 | >99 | 27 |
| 6 | (D，L)-3，4-二氯-苯丙氨酸 | L-3，4-二氯-苯丙氨酸 | 22 | >99 | 26 |
| 7 | (D，L)-2-溴-苯丙氨酸 | L-2-溴-苯丙氨酸 | 46 | >99 | 50 |
| 8 | (D，L)-4-溴-苯丙氨酸 | L-4-溴-苯丙氨酸 | 22 | 99.3 | 50 |
| 9 | (D，L)-4-甲基-苯丙氨酸 | L-4-甲基-苯丙氨酸 | 43 | 99 | 50 |
| 10 | (D，L)-4-硝基-苯丙氨酸 | L-4-硝基-苯丙氨酸 | 42 | 94.6 | 50 |
| 11 | (D，L)-4-羟基-苯丙氨酸 | L-4-羟基-苯丙氨酸 | 53 | 40 | 49 |
本研究发现一个具有D-氨基酸选择性代谢菌，它可以将消旋体(或非消旋体)中的D-型氨基酸衍生物选择性地清除掉(深度转化)，保留高光学纯L-对映体。因而成为一个有效的制备非天然非蛋白L-型氨基酸衍生物合物的生物转化方法。本方法已成功用于11个苯丙氨酸衍生物高光学纯L-对映体的制备。但本方法不限于文中所列氨基酸以及各种氨基酸混合物。本方法也不限于各种消旋体氨基酸混合物中D-型对映体的清除，应该适于更多不同种类的氨基酸及其可能构成的各种可能混合物中D-型对映体的清除。本发明应用了手性清除法(enantioselective scavenger)方法，其中一个手性对映体被选择性地深度转化为未知或已知产品，留下未反应的高手性纯的另一对映体。因此，本方法不限于文中所列氨基酸系列，应该广泛适于于不同种类的消旋体化合物中某一对映体或异构体的清除。
本发明所用的微生物菌株为气单胞菌，送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.2226；分类命名为气单胞菌(Aeromonas sp.)；保藏日期为2007年10月23日。
Claims (5)
1.一种L-氨基酸的生物催化制备方法，其特征是通过以下步骤实现：在摇瓶中，放置100ml培养基，接种细菌Aeromonas sp，生长24小时后，离心，倾出清液，置回摇瓶中，每瓶中加入相同量消旋体D，L-氨基酸50mg，调pH7.3，通空气，透气封口，放回在控温摇床中，圆周式摇动，生物转化反应时间4-40小时，采样，超滤、稀释，注入HPLC进行分析追踪转化进程，用大赛路冠醚手性色谱柱分析，分析时间控制在到120分钟，确定获得目的产物，所用生物菌株为气单胞菌，被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 2226。
2.根据权利要求1所述的一种L-氨基酸的生物催化制备方法，其特征是：所述的HPLC进行分析追踪转化进程，是找到消旋体底物的两个等比信号峰的消耗跟踪反应进程，当信号超出检测灵敏限度后，停止反应，反应混合物经离心收取清液，通过离子交换树脂柱分离，得到L型氨基酸衍生物。
3.根据权利要求1所述的一种L-氨基酸的生物催化制备方法，其特征是：培养基选用营养肉汁琼脂，组成为：蛋白胨10克，牛肉提取物3克，琼脂15克，NaCl 5克，蒸馏水1000毫升。
4.根据权利要求1所述的一种L-氨基酸的生物催化制备方法，其特征是：采用阶段性的采样，选用0小时，6小时和12小时。
5.根据权利要求1所述的一种L-氨基酸的生物催化制备方法，其特征是：所用大赛路冠醚色谱柱分析条件：Crownpak CR(+)，D-Try，tr＝65min。
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