CN102174632A

CN102174632A - 一种非天然l-氨基酸的生物催化去消旋化制备方法

Info

Publication number: CN102174632A
Application number: CN2009101038838A
Authority: CN
Inventors: 夏仕文; 方国兰; 徐红梅; 葛超; 郭丽娟; 李阳; 杨智慧
Original assignee: CHONGQING CHIRAL BIOCATALYSIS TECHNOLOGY Co Ltd; Chongqing University of Post and Telecommunications
Current assignee: CHONGQING CHIRAL BIOCATALYSIS TECHNOLOGY Co Ltd; Chongqing University of Post and Telecommunications
Priority date: 2009-05-19
Filing date: 2009-05-19
Publication date: 2011-09-07

Abstract

本发明提供一种非天然L-氨基酸的生物催化去消旋化制备方法。该方法以具有高对映选择性的固定化D-氨基酸氧化酶为生物催化剂，在分子氧存在下催化化学合成的DL-氨基酸中的D-对映体氧化为亚氨基酸，L-氨基酸保留。以Pd-C为催化剂，HCOONH₄为氢供体通过化学催化氢转移反应将形成的亚氨基酸原位转化为DL-氨基酸，实现DL-氨基酸向L-氨基酸的连续转化。反应过程中产生的过氧化氢利用过氧化氢酶原位高效分解为水和分子氧。方法用于制备手性药物中间体L-2-氨基丁酸、L-2-氨基戊酸、L-2-氨基己二酸、L-叔亮氨酸、L-环己基甘氨酸、L-邻氯苯甘氨酸、L-对氟苯甘氨酸、L-2-氨基-4-苯基丁酸、L-哌啶-2-羧酸、L-哌嗪-2-羧酸，收率75-95％，ee＞99％。

Description

一种非天然L-氨基酸的生物催化去消旋化制备方法

技术领域

本发明涉及非天然L-氨基酸的生物催化去消旋化制备方法，属于生物催化不对称氧化制备手性医药中间体技术领域。

背景技术

非天然L-氨基酸是自然界中不存在的非蛋白源氨基酸。非天然L-氨基酸及其衍生物如保护非天然L-氨基酸、非天然L-氨基醇等是手性药物的关键中间体，在医药领域有广泛应用。例如，L-2-氨基丁酸是抗癫痫药物左乙拉西坦中间体，L-2-氨基戊酸是抗高血压药物培哚普利中间体，L-2-氨基己二酸是谷氨酰胺合成酶抑制剂中间体，L-叔亮氨酸是抗病毒、抗肿瘤和抗炎药物中间体，L-环己基甘氨酸是环氧合酶(COX-2)抑制剂JTE-522中间体，L-邻氯苯甘氨酸是抗血栓药物氯吡格雷中间体，L-对氟苯甘氨酸是抗癌药物中间体，L-2-氨基-4-苯基丁酸是普利类抗高血压药物中间体，L-哌啶-2-羧酸是局麻药罗哌卡因、抗精神病药物硫利哒嗪中间体，L-哌嗪-2-羧酸是HIV蛋白酶抑制剂中间体。

非天然L-氨基酸不能像天然L-氨基酸一样采用发酵法生产。尽管非天然L-氨基酸可以采用化学法制备，但化学不对称合成采用价格昂贵的手性源、手性助剂或手性催化剂，化学拆分工艺路线复杂、环境污染大。无论是化学不对称合成或是化学拆分，都存在收率低、光学纯度不高、生产成本高的缺点。生物催化法具有立体选择性高、反应条件温和、环境友好等特征，是制备对映纯非天然L-氨基酸极为有用的方法。目前大量具有商业价值的非天然L-氨基酸都是用生物催化法制备的(Breuer M，Ditrich K，Habicher T，HauerB.Angew Chem Int Ed，2004，43，788)。生物催化法包括酶拆分法和酶催化不对称合成法。外消旋体的酶催化动力学拆分是制备非天然L-氨基酸的一个最成功的策略，但涉及消旋氨基酸的衍生以及游离氨基酸和衍生氨基酸的分离，工艺复杂，非天然L-氨基酸的理论收率仅为50％。因此，为了避免D-对映体的浪费，有必要开发收率＞50％的非天然L-氨基酸酶催化或化学酶催化合成方法。这可以通过三个途径实现：前手性底物的酶催化不对称合成，酶催化动态动力学拆分，酶催化去消旋化。酶催化去消旋化可以采用两种策略：采用具有互补对映选择性的双酶或多酶系统如氨基酸脱氢酶/转氨酶；对映选择性酶催化氧化反应和非选择性、非酶还原反应组合。

D-氨基酸氧化酶在分子氧存在下，立体选择性催化D-氨基酸氧化脱氢为相应的亚氨基酸，亚氨基酸经历非酶水解为酮酸。D-氨基酸氧化酶已成功用于从头孢菌素C工业合成7-氨基头孢烷酸(7-ACA，半合成抗生素的关键母核)、去除L-氨基酸中的少量D-对映体和从DL-氨基酸制备非天然L-氨基酸。为了获得收率＞50％的非天然L-氨基酸，对D-氨基酸氧化酶催化DL-氨基酸氧化和化学还原剂组合体系进行了广泛的研究。组合D-氨基酸氧化酶和NaBH₄用于DL-哌啶-2-羧酸的去消旋化，L-对映体的产率和光学纯度均＞98％(Soda K，Oikawa T，Yokoigawa K.J Mol Catal B：Enzymatic 2001，11，149.)。以NaCNBH₃替代NaBH₄为还原剂和猪肾D-氨基酸氧化酶为生物催化剂，实现了哌嗪-2-羧酸的去消旋化，收率和ee分别为86％和＞99％。以NaBH₄作还原剂，DL-苯甘氨酸、2-氨基丁酸、环戊基甘氨酸等非环和环状氨基酸去消旋化产生的非天然L-氨基酸收率75-90％，ee＞99％(Beard TM，Turner NJ.Chem Commun，2002，246.)。在这些方法中采用NaBH₄或NaCNBH₃与D-氨基酸氧化酶组合将DL-氨基酸去消旋化转化为非天然L-氨基酸有3个缺点：1)NaBH₄对水敏感，在D-氨基酸氧化酶表现最大活性和稳定性的pH(酸性或中性)条件下易分解。为使还原有效，必须多次缓慢加入且当量很大(500个当量以上)。虽然NaCNBH₃比NaBH₄的水稳定性好，但反应性较低，从而导致产生的非天然L-氨基酸收率低；2)大量NaBH₄的加入致使操作pH接近10。在如此高pH下，D-氨基酸氧化酶容易通过不可逆变性快速失活，增加制备成本，难于规模化；3)必须采用价格高昂的D-氨基酸氧化酶作生物催化剂。因此有必要提出基于D-氨基酸氧化酶的适合非天然L-氨基酸规模化制备的生物催化去消旋化方法。

以D-氨基酸氧化酶为生物催化剂，组合化学催化还原制备非天然L-氨基酸的方法未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的非天然L-氨基酸生物催化去消旋化制备方法，利用固定化D-氨基酸氧化酶高度的对映选择性，组合化学催化氢转移反应，以高的光学活性和高的收率制备非天然L-氨基酸。

方法的技术路线如下：

方法步骤如下：

1)选择固定化D-氨基酸氧化酶为生物催化剂将化学合成的非天然DL-氨基酸中的D-对映体氧化为亚氨基酸，L-氨基酸保留；

2)选择高活性的过氧化氢酶将上述反应过程中形成的过氧化氢原位分解为水和分子氧；

3)选择Pd-C为化学氢转移催化剂将反应中形成的亚氨基酸原位转化为非天然DL-氨基酸，用于非天然DL-氨基酸向非天然L-氨基酸的连续转化；

4)反应体系构建：在50ml甲酸铵溶液(1mol/L，pH7.2)中加入1-4g DL-氨基酸，1-4g固定化D-氨基酸氧化酶(58U/g)，1-2ml过氧化氢酶(50000U/ml)，1g Pd-C(10％)。

5)反应条件：反应温度30℃，pH7.2，磁力搅拌，匀速通入氧气，反应时间16-30小时。

6)反应液处理：反应完成后减压浓缩，调等电点，冷冻析出非天然L-氨基酸，红外干燥。

分析方法

生物催化去消旋化反应过程监测采用旋光法。间隔一定时间测定反应液旋光度，旋光度不再增加时反应完成。产物非天然L-氨基酸的光学纯度以对映体过量值(ee)表示，采用手性液相色谱法测定。手性液相柱：Crownpak CR(+)，4.0×150mm，5μm，流动相：pH1.5-2.0HClO₄溶液，流速：0.4-1.0ml/min，检测：UV200nm。对映体色谱峰定位采用标准品对照。

本发明的有益效果

与传统的非天然L-氨基酸化学和酶法制备技术相比，本发明提出的生物催化方法具有以下优点：1)工艺简单。与化学拆分和生物拆分不同，DL-氨基酸不经衍生，直接作为酶催化反应底物。双酶反应和化学催化氢转移反应在同一反应体系中进行，中间产物不经分离，直接原位转化为DL-氨基酸，用于连续转化。终端产物仅为非天然L-氨基酸，无其他副产物，分离过程简单。2)方法的通用性好，不仅适用于非天然L-脂肪氨基酸的制备，也适用于非天然L-芳香氨基酸制备；3)反应条件温和，环境友好。酶催化反应和化学催化反应在常温下进行，不需要高温高压，节约能源。反应体系以缓冲液为反应介质，避免使用对环境有害的有机溶剂，产生的废水只需经过简单处理即可排放；4)成本低廉。固定化D-氨基酸氧化酶和Pd-C催化剂均为多相催化剂，可回收重复使用多次，有效降低了过程成本。

具体实施方式

以下是以固定化D-氨基酸氧化酶、过氧化氢酶为生物催化剂，Pd-C为化学催化氢转移催化剂，在水相体系中催化DL-氨基酸对映选择性去消旋化制备非天然L-氨基酸的实施例，但本发明并不限于所列出的几个实例。

实施例1：L-2-氨基丁酸

2.06g(0.02mol)DL-2-氨基丁酸溶于50ml甲酸铵(1.0mol/L，用氨水调节pH至7.2)溶液中，加入2.06g固定化D-氨基酸氧化酶(58U/g)、1ml过氧化氢酶溶液(50000U/ml)、1g Pd-C催化剂(10％)，连续通入氧气，30℃下搅拌反应16h，反应液旋光度不再增加。过滤除去固定化D-氨基酸氧化酶和Pd-C，滤液浓缩至约10ml，调等电点，冷冻析出白色晶体，烘干得1.8gL-2-氨基丁酸，收率87％，ee＞99％。

实施例2：L-2-氨基戊酸

2.90g(0.025mol)DL-2-氨基戊酸溶于50ml甲酸铵(1.0mol/L，用氨水调节pH至7.2)溶液中，加入2.90g固定化D-氨基酸氧化酶(58U/g)、1.5ml过氧化氢酶溶液(50000U/ml)、1g Pd-C催化剂(10％)，连续通入氧气，30℃下搅拌反应16h，反应液旋光度不再增加。过滤除去固定化D-氨基酸氧化酶和Pd-C，滤液浓缩至约10ml，调等电点，冷冻析出白色晶体，烘干得2.6gL-2-氨基戊酸，收率90％，ee＞99％。

实施例3：L-2-氨基己二酸

3.22g(0.02mol)DL-2-氨基己二酸溶于50ml甲酸铵(1.0mol/L，用氨水调节pH至7.2)溶液中，加入3.22g固定化D-氨基酸氧化酶(58U/g)、1ml过氧化氢酶溶液(50000U/ml)、1g Pd-C催化剂(10％)，连续通入氧气，30℃下搅拌反应20h，反应液旋光度不再增加。过滤除去固定化D-氨基酸氧化酶和Pd-C，滤液浓缩至约10ml，调等电点，冷冻析出白色晶体，烘干得2.8gL-2-氨基己二酸，收率87％，ee＞99％。

实施例4：L-叔亮氨酸

1.31g(0.01mol)DL-叔亮氨酸溶于50ml甲酸铵(1.0mol/L，用氨水调节pH至7.2)溶液中，加入1.31g固定化D-氨基酸氧化酶(58U/g)、1ml过氧化氢酶溶液(50000U/ml)、1g Pd-C催化剂(10％)，连续通入氧气，30℃下反应24h，反应液旋光度不再增加。过滤除去固定化D-氨基酸氧化酶和Pd-C，滤液浓缩至约10ml，调等电点，冷冻析出白色晶体，烘干得0.98g L-叔亮氨酸，收率75％，ee 99％。

实施例5：L-环己基甘氨酸

1.57g(0.01mol)DL-环己基甘氨酸溶于50ml甲酸铵(1.0mol/L，用氨水调节pH至7.2)溶液中，加入1.57g固定化D-氨基酸氧化酶(58U/g)、1ml过氧化氢酶溶液(50000U/ml)、1g Pd-C催化剂(10％)，连续通入氧气，30℃下反应24h，反应液旋光度不再增加。过滤除去固定化D-氨基酸氧化酶和Pd-C，滤液浓缩至约10ml，调等电点，冷冻析出白色晶体，烘干得1.4g L-环己基甘氨酸，收率89％，ee＞99％。

实施例6：L-邻氯苯甘氨酸

1.85g(0.01mol)DL-邻氯苯甘氨酸溶于50ml甲酸铵(1.0mol/L，用氨水调节pH至7.2)溶液中，加入1.85g固定化D-氨基酸氧化酶(58U/g)、1ml过氧化氢酶溶液(50000U/ml)、1g Pd-C催化剂(10％)，连续通入氧气，30℃下反应24h，反应液旋光度不再增加。过滤除去固定化D-氨基酸氧化酶和Pd-C，滤液浓缩至约10ml，调等电点，冷冻析出白色晶体，烘干得1.5g L-邻氯苯甘氨酸，收率81％，ee＞99％。

实施例7：L-对氟苯甘氨酸

1.69g(0.01mol)DL-对氟苯甘氨酸溶于50ml甲酸铵(1.0mol/L，用氨水调节pH至7.2)溶液中，加入1.69g固定化D-氨基酸氧化酶(58U/g)、1ml过氧化氢酶溶液(50000U/ml)、1g Pd-C催化剂(10％)，连续通入氧气，30℃下反应24h，反应液旋光度不再增加。过滤除去固定化D-氨基酸氧化酶和Pd-C，滤液浓缩至约10ml，调等电点，冷冻析出白色晶体，烘干得1.6g L-对氟苯甘氨酸，收率95％，ee＞99％。

实施例8：L-2-氨基-4-苯基丁酸

1.79g(0.01mol)DL-2--氨基-4-苯基丁酸溶于50ml甲酸铵(1.0mol/L，用氨水调节pH至7.2)溶液中，加入1.79g固定化D-氨基酸氧化酶(58U/g)、1ml过氧化氢酶溶液(50000U/ml)、1g Pd-C催化剂(10％)，连续通入氧气，30℃下反应24h，反应液旋光度不再增加。过滤除去固定化D-氨基酸氧化酶和Pd-C，滤液浓缩至约10ml，调等电点，冷冻析出白色晶体，烘干得1.6g L-2-氨基-4-苯基丁酸，收率89％，ee＞99％。

实施例9：L-哌啶-2-羧酸

3.23g(0.025mol)DL-哌啶-2-羧酸溶于50ml甲酸铵溶液(1.0mol/L，用氨水调节pH至7.2)，加入1.62g固定化D-氨基酸氧化酶(58U/g)、1.6ml过氧化氢酶溶液(50000U/ml)、1g Pd-C催化剂(10％)，连续通入氧气，30℃下反应24h，反应液旋光度不再增加。过滤除去固定化D-氨基酸氧化酶和Pd-C，滤液浓缩至约10ml，调等电点，冷冻析出白色晶体，烘干得2.6g L-哌啶-2-羧酸，收率80％，ee＞99％。

实施例10：L-哌嗪-2-羧酸

3.25g(0.025mol)DL-哌嗪-2-羧酸溶于50ml甲酸铵溶液(1.0mol/L，用氨水调节pH至7.2)，加入1.63g固定化D-氨基酸氧化酶(580U/g)、1.6ml过氧化氢酶溶液(50000U/ml)、1g Pd-C催化剂(10％)，连续通入氧气，30℃下反应24h，反应液旋光度不再增加。过滤除去固定化D-氨基酸氧化酶和Pd-C，滤液浓缩至约10ml，调等电点，冷冻析出淡黄色晶体，烘干得2.8g L-哌嗪-2-羧酸，收率86％，ee＞99％。

Claims

1.一种非天然L-氨基酸的生物催化去消旋化制备方法，其特征是非天然DL-氨基酸中的D-对映体以D-氨基酸氧化酶为生物催化剂，在氧源存在下对映选择性氧化为亚氨基酸，L-氨基酸保留；亚氨基酸采用金属催化剂、在氢源存在下原位转化为DL-氨基酸，反应过程中产生的过氧化氢利用氧化剂原位分解为水和分子氧；

方法步骤如下：

4)反应体系构建：在50ml甲酸铵溶液(1mol/L，pH7.2)中加入1-4g DL-氨基酸，1-4g固定化D-氨基酸氧化酶(58U/g)，1-2ml过氧化氢酶(50000U/ml)，1g Pd-C(10％)；

5)反应条件：反应温度30℃，pH7.2，磁力搅拌，匀速通入氧气，反应时间16-30小时；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述非天然L-氨基酸选自L-脂肪族氨基酸中的L-2-氨基丁酸、L-2-氨基戊酸、L-2-氨基己二酸、L-叔亮氨酸；或选自L-脂环族氨基酸中的L-环己基甘氨酸、L-哌啶-2-羧酸或L-哌嗪-2-羧酸；或选自L-芳香族氨基酸中的L-邻氯苯甘氨酸、L-对氟苯甘氨酸、L-2-氨基-4-苯基丁酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是底物非天然DL-氨基酸的使用浓度为0.1-0.5mlo/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是D-氨基酸氧化酶为固定化酶。固定化D-氨基酸氧化酶与DL-氨基酸的质量比为0.5-1.0。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是氧化DL-氨基酸中D-对映体为亚氨基酸的氧源为空气氧或纯氧。

6.根据权利要求1所述的方法，金属催化剂为Pd-C、钯黑、钯/氧化铝；Pd-C催化剂与固定化D-氨基酸氧化酶的质量比为0.3-1.0。

7.根据权利要求1所述的方法，氢源为氢气或甲酸铵；甲酸铵既作为生物催化氧化反应的缓冲盐，也作为化学催化氢转移反应的氢供体；甲酸铵浓度为1-3mol/L，最好为1mol/L。缓冲液pH为5-8，最好为7.2。

8.根据权利要求1所述的方法，分解反应过程中产生的过氧化氢的氧化剂为Fe³⁺、过氧化氢酶，最好为过氧化氢酶。过氧化氢酶与固定化D-氨基酸氧化酶的活性比为300-1000。

9.根据权利要求1所述的方法，反应温度为10-40℃，最好为30℃。