CN107653233B - 一种改进的转氨酶、其编码基因及表达该酶的基因工程菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种改进的转氨酶及其编码基因，并通过构建大肠杆菌基因工程菌实现该酶的异源表达。改进的转氨酶对应于野生型转氨酶的氨基酸序列的第53位为丝氨酸，第115位为丙氨酸，第214位为脯氨酸。与来源于烟曲霉菌Aspergillus fumigatus Af293的野生型转氨酶相比，在催化对甲基苯乙酮不对称转氨生成(R)‑(+)‑1‑对甲基苯乙胺方面，改进的转氨酶的催化效率至少为野生型转氨酶的2倍。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种改进的转氨酶、其编码基因以及表达该酶的基因工程菌。
背景技术
(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺作为一种药物中间体，在有机合成和药物合成方面有着广泛的应用。常温常压下(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺是一种无色液体，可溶于乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂溶剂中，其结构式如下所示：
目前公布的(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺的合成方法以化学合成法为主，一种是利用手性拆分试剂对外消旋的1-(4-甲苯基)乙胺进行拆分，后经分离纯化获得手性纯的目标化合物(Tetrahedron:Asymmetry,2003,14,2683–2685)，该方法最终产率偏低(49.25％)，产物手性ee值为99％，反应过程使用的手性拆分试剂价格昂贵，生产成本较高。另一种是利用手性催化剂不对称催化对甲基苯乙酮合成(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺(Angew.Chem.,2003,115,5630–5632)，该方法产物手性纯度偏低(ee值为93％)，使用过渡金属[((R)-tol-binap)RuCl2]作为手性催化剂，价格昂贵且回收困难，排放环境中易造成污染。
与化学合成法相比，生物合成法具有反应条件温和、转化率高和立体选择性强等优点，目前已报道的生物合成法主要是利用脂肪酶或转氨酶进行动力学拆分或不对称催化合成(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺。专利CN1177382报道了利用脂肪酶Novozym435水解外消旋N-[1-(4-甲基苯基)-乙基]-乙酰胺制备(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺，该方法最终产率(32％)和产物手性纯度(ee值90％)均较低。专利CN1346342中以外消旋胺和酯为原料在南极假丝酵母脂肪酶B的作用下生成光学手性R型的酰胺化合物后，在三乙醇胺存在下用NaOH水解得到目标化合物(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺，该方法涉及两步反应，最终产率仅为45％，产物ee值为95％。Smidt H等报道了以外消旋的1-(4-甲苯基)乙胺和乙酰氯为原料反应得到酰胺，再由南极假丝酵母脂肪酶B选择性水解制备(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺的方法，但转化率较低，仅为31.7％，产物ee值为99％(Biotechnol Tech,1996,10(5),335-338)。利用脂肪酶进行动力学拆分制备目标化合物存在反应步骤多、产率低、手性选择性偏低等缺点，而转氨酶能够不对称催化潜手性酮类化合物一步合成手性胺类化合物，在制备手性胺化合物方面具有较好的应用前景。然而，现有的野生型的转氨酶在催化对甲基苯乙酮不对称合成(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺时催化效率很低。Giyoung Shin等以外消旋的1-(4-甲苯基)乙胺为原料，利用不同对映选择性的转氨酶一锅法制备目标化合物，其中S型和R型转氨酶分别来自Polaromonas sp.JS666和Mycobacterium vanbaalenii，利用该方法制备(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺的手性纯度较高(ee值>99％)，但转化效率较低，0.5g/L的纯酶至少需要24h才能完全转化10mmol/L的底物(Chem.Commun.,2013,49(77),8629—8631)，无法满足工业化应用的需求。Peter Both等报道了一种以1-乙基-4-甲苯为原料通过多级酶促反应(单加氧酶、醇脱氢酶及转氨酶)得到目标化合物(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺的方法(Angew.Chem.Int.Ed.,2016,55(4),1511–1513)，其中R型转氨酶来源于Arthrobacter sp，该方法最终转化率仅为5％，实际应用价值不大。目前，利用生物法制备合成(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺的技术缺乏一种既具有一定立体选择性，又具有较好催化活性的酶。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：基于已报道的不对称合成(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺的反应中产率偏低、立体选择性不佳、催化剂价格昂贵等问题，本发明提供了一种改进的转氨酶，同时还公开了该转氨酶的编码基因以及表达该酶的基因工程菌。
本发明解决其技术问题所采用的一个技术方案是：本发明第一方面提供了一种改进的转氨酶，其催化效率高于野生型转氨酶的催化效率。
所野生型转氨酶具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列，且来源于烟曲霉菌Aspergillus fumigatus Af293。
催化效率是指催化潜手性酮类化合物发生不对称转氨反应生成手性胺的转化效率。
催化效率是指催化底物对甲基苯乙酮发生不对称转氨反应生成(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺的转化效率。
改进的转氨酶是在SEQ ID No.2所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有转氨酶催化活性的蛋白质，且与SEQ ID No.2所示氨基酸序列有至少95％序列同源性。其中，所述的“几个”是指2-15个，更佳的小于10个。比如添加一个亲和标签或外分泌信号肽的融合蛋白也同样具有转氨酶的催化活性。
改进的转氨酶具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第53位组氨酸取代为丝氨酸，第115位谷氨酸取代为丙氨酸，第214位丝氨酸取代为脯氨酸。
改进的转氨酶的催化效率是所述野生型转氨酶催化效率的2倍以上。
本发明第二方面提供了编码改进转氨酶的基因，其包含与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列有至少95％序列同源性的核苷酸序列。
改进的转氨酶的编码基因如SEQ ID No.3所示核苷酸序列。
本发明第三方面提供了一种表达上述改进转氨酶的基因工程菌，可通过将包含改进转氨酶编码基因的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。表达载体可谓本领域常规的各种载体，如市售的质粒噬菌体或病毒载体等。宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体的复制以及转氨酶编码基因的有效表达即可。
基因工程菌所使用的表达载体为pET-28a，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的改进的转氨酶。利用该酶反应条件温和，产物手性纯度及收率均较高，大大提高了(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺的制备效率，具有较好的工业应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1为本发明实施例1中突变基因融合PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M为DNA分子量标准，A为突变基因融合PCR产物；
图2为本发明实施例4中表达AfATmutant转氨酶细胞破碎液中可溶性和非可溶性蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中，M为蛋白分子量标准，A为细胞破碎液中非可溶性蛋白，B为细胞破碎液中可溶性蛋白；
图3为本发明实施例5中转氨酶催化对甲基苯乙酮进行不对称转氨反应的转化率检测结果，其中，A为改进的转氨酶反应24h后HPLC图谱，B为野生型转氨酶反应24h后HPLC图谱；
图4为本发明实施例5中转氨酶催化对甲基苯乙酮进行不对称转氨反应的产物手性纯度检测结果，其中，A为改进的转氨酶反应产物手性纯度HPLC图谱，B为野生型转氨酶反应产物手性纯度HPLC图谱。
具体实施方式
现在结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1转氨酶突变体编码基因的构建
全基因合成序列如SEQ ID No.1所示核苷酸，选择Nde I和Hind III两个酶切位点插入pET-28a表达载体，获得的重组表达载体命名为pET28a-AfAT。为构建突变体库，我们设计了以下8条引物，详见表1：
表1PCR引物表
以pET28a-AfAT为模板利用上述引物进行PCR扩增，PCR体系为：5×PCR buffer为10L，2.5mmol/L dNTPs为4L，
DNA聚合酶为0.5L，pET28a-AfAT模板为0.5L(含DNA模板0.1g)，ddH2O为31L，分别以表1中AfAT-up上游引物(SEQ ID No.5)与H53-down下游引物(SEQ ID No.8)、H53-up上游引物(SEQ ID No.7)与E115-down下游引物(SEQID No.10)、E115-up上游引物(SEQ ID No.9)与S214-down下游引物(SEQ ID No.12)、S214-up上游引物(SEQ ID No.11)与AfAT-down下游引物(SEQ ID No.6)各2uL(10mol/L)进行PCR扩增。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)95℃，变性30s；(3)58℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收160、200、300、320bp左右的目标条带。以这四种PCR产物为模板，反应体系如下：5×PCR buffer为10L，2.5mmol/L dNTPs为4L，
DNA聚合酶为0.5L，ddH2O为28.5L，PCR回收片段各1L，利用AfAT-up上游引物与AfAT-down下游引物各2L进行PCR扩增，PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)95℃，变性30s；(3)58℃退火30s；(4)72℃延伸70s；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收目标条带，大小约1000bp(见图1)，该片段中则包含了具有三个位点组合突变的所有突变序列。
实施例2转氨酶突变体库的构建
将上述基因片段和载体pET-28a质粒分别进行酶切反应(Nde I和Hind III，37℃酶切1h)，酶切产物切胶回收后进行连接反应(16℃过夜反应)，转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，通过卡那霉素筛选获得阳性单克隆。于96孔板中每孔加入LB培养基0.6mL(含卡那霉素50g/L)，每块96孔板挑选93个阳性克隆和3个BL21(DE3)/pET28a-AfAT作为对照，共挑取12块96孔板，在37℃摇床中震荡培养16h，此即为突变体库。
实施例3转氨酶突变体的表达、筛选及鉴定
转接培养过夜的突变体菌液200L至一个新的96孔板中，该板每孔内含新鲜LB培养基1mL，其中卡那霉素浓度为50g/L、IPTG浓度为1.0mmol/L，于25℃诱导培养20h左右，离心弃上清，收集菌体。每孔加入600L反应液，其中包括：10g/L的底物对甲基苯乙酮，60g/L的异丙胺，1mmol/L的辅酶磷酸吡哆醛(PLP)，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH＝8.0)，于35℃摇床振荡反应24h后，反应液进行HPLC分析检测突变体转化率。转化率检测条件：Shimadzu2010AHT高效液相色谱仪；Athena C18-WP(150×4.6mm,5m)色谱柱；波长214nm；流动相A(H2O+0.1％TFA)，流动相B(CH3CN+0.1％TFA)，流速为1.0mL/min，等度洗脱(20％B+80％A)，检测12min，柱温28℃。将突变体的产物峰面积与BL21(DE3)/pET28a-AfAT对照组反应产物峰面积比较，峰面积超过对照组30％的反应液进行手性HPLC分析检测产物手性纯度，手性纯度检测条件：Shimadzu 2010AHT高效液相色谱仪；Chiralcel AS-H(250×4.6mm,5m)色谱柱；波长214nm；流动相A(正己烷+0.1％二乙醇胺)，流动相B(异丙醇+0.1％二乙醇胺)，流速为0.4mL/min，等度洗脱(10％B+90％A)，检测25min，柱温25℃。其中产物手性ee值>99.5％的突变体即为筛选出的活性提高的突变体。
为了从所筛选出表达突变体的细胞中获得转氨酶的编码基因，将其所对应的菌种送测序，测序结果显示含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列，编码SEQ ID No.4所示氨基酸序列。该改进的转氨酶命名为AfATmutant，菌种命名为BL21(DE3)/pET28a-AfATmutant。
实施例4重组AfATmutant转氨酶的表达
转接甘油保藏菌种至5mL含卡那霉素的LB试管培养基中活化培养(37℃培养12h)，按1％接种量转接活化培养物至400mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养菌体浓度A600至0.6-0.8，加入IPTG(终浓度0.1mmol/L)于25℃诱导培养16h，离心收集菌体。取0.1g菌体重悬于10mL磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH 7.5)中，冰水浴中超声破碎15min，离心收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况，目的蛋白大小约34kDa(见图2)。
实施例5AfATmutant转氨酶催化对甲基苯乙酮的不对称转氨反应
于100mL反应容器中加入100mmol/L的磷酸盐缓冲液(40mL，pH＝8.5)和异丙胺(3.0g)，用磷酸调节pH至8.5，加入底物对甲基苯乙酮(1.0g)，搅拌均匀后加入已表达改进转氨酶的重组菌菌体(BL21(DE3)/pET28a-AfATmutant，1.0g)和辅酶PLP(13.25mg)，定容至50mL，35℃下磁力搅拌敞口反应，反应过程中用异丙胺(4mol/L)控制反应pH在8.5左右，反应24h后HPLC分析(同实施例3所示)，同时利用已表达野生型转氨酶的重组菌BL21(DE3)/pET28a-AfAT菌体进行反应作为对照组实验。HPLC结果显示改进转氨酶AfATmutant的转化率为99.6％，R型产物ee值为99.9％，而对照组野生型转氨酶AfAT的转化率仅为15.9％，R型产物ee值为99.5％(见图3和图4)。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (6)
1.一种改进的转氨酶，其特征在于：
所述的改进的转氨酶的催化效率高于野生型转氨酶的催化效率；
所述催化效率是指催化酮类化合物发生不对称转氨反应生成手性胺的转化效率；
所述野生型转氨酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示氨基酸序列，且来源于烟曲霉菌Aspergillus fumigatus Af293；
所述改进的转氨酶为SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第53位组氨酸取代为丝氨酸，第115位谷氨酸取代为丙氨酸，第214位丝氨酸取代为脯氨酸。
2.一种编码权利要求1中所述的改进的转氨酶的基因，其特征在于：所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
3.一种基因工程菌，其特征在于：所述的菌种表达权利要求1中所述的改进的转氨酶。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌所使用的表达载体为pET-28a，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
5.一种基因工程菌，其特征在于：所述的菌种包含权利要求2中所述的改进的转氨酶的基因。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌所使用的表达载体为pET-28a，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
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Effective date of registration: 20230424 Address after: No. 51, No.4 Road, Private Science and Technology Entrepreneurship Park, Jianhu County, Yancheng City, Jiangsu Province, 224799 Patentee after: YANCHENG RENYUE BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: No. 93, Ji Chuan Road, Hailing District, Taizhou, Jiangsu Province Patentee before: TAIZHOU University |
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