CN116286701A - 一种不透明红球菌l-氨基酸氧化酶突变体及其应用 - Google Patents

一种不透明红球菌l-氨基酸氧化酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种不透明红球菌L‑氨基酸氧化酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明克服了野生型RoLAAO催化性能差的局限，通过麦芽糖蛋白工程及组合突变设计出突变体RoLAAOY226H/D227H/Y371L/A466C/W467A，其对五种选定底物催化效率为野生型的9.2‑82.8倍，能够以L‑氨基酸(L‑Leu、L‑Ile、L‑Met、L‑Val及L‑Phe)为底物规模化制备系列α‑酮酸(α‑酮亮氨酸、α‑酮异亮氨酸、α‑酮蛋氨酸、α‑酮缬氨酸及α‑苯丙酮酸)，对应产量>101g/L，转化率>95％，单位菌体生产α‑酮酸的能力在5.1‑5.5g/g，为多种α‑酮酸的工业化生产奠定了基础。

Description

一种不透明红球菌L-氨基酸氧化酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种不透明红球菌L-氨基酸氧化酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
α-酮酸是羧基在α碳原子上的酮酸。羧基和酮基两种官能团使得酮酸分子既具有羧酸的成盐、成酯性质，又具有酮的羟胺反应和加氢还原反应等。在生物体内，α-酮酸是氨基酸代谢中的重要物质。基于其特殊的化学和生物学性质，α-酮酸在医药、食品、饲料、化妆品领域被广泛应用，尤其是在有机化合物药物合成以及生物合成领域中作为重要的合成中间体。
目前，可用于工业生产α-酮酸的方法主要包括化学法和生物转化法。其中生物转化法在生产安全、经济效益和环境保护等方面均优于化学合成法，是工业化生产α-酮酸的优选方法。酶转化法是生物转化法的一种，是利用L-氨基酸氧化酶(LAAO，L-amino acidoxidase，EC1.4.3.2)对底物L-氨基酸进行转化获得α-酮酸。L-氨基酸的氧化脱氨反应可以分为两个步骤：首先将氨基酸Cα上的氢转移给FAD，氨基酸变成亚氨基酸，亚氨基酸不稳定分解成α-酮酸和水。然后FADH2被氧分子氧化后，变成了还原型FAD。由于酶转化法中用到的底物L-氨基酸成本低并且转化周期较短等优点使其具备很大的工业应用价值。但是，目前运用酶转化法大规模制备α-酮酸有以下缺陷：(1)LAAO底物谱广窄不一，需要对不同类型的LAAO进行底物谱测定；(2)底物谱较广的LAAO可能催化效率较低；(3)LAAO催化合成α-酮酸时伴随着H2O2的生成。因此迫切需要解决筛酶和LAAO的催化效率的问题，以实现酶转化法制备α-酮酸实现规模化应用。
蛋白质工程是在分子水平改善酶的性质最有效的方法，如扩大底物范围、提高酶的活性和改善酶的稳定性。通过蛋白质工程设计RoLAAO，可能解决其催化效率低的问题。目前，利用蛋白质工程改造LAAO的技术已经取得了一定的研究进展，通过在多个不同的关键位点同时突变，综合提高LAAO对几种特定底物的催化效率。这种多突变体改造后的RoLAAO兼具较广的底物谱和远高于野生型的催化效率，以其催化转化低价值的L-氨基酸生产更昂贵的α-酮酸极具研究价值。但是，尚无发现一种既具有较广的底物谱又具有较高催化效率的LAAO酶，限制了α-酮酸的规模化制备。
发明内容
本发明提供了一种可以高效制备α-酮酸的RoLAAO突变体，并利用RoLAAO突变体蛋白催化L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val及L-Phe制备五种α-酮酸(4-甲基-2-酮基戊酸(酮亮氨酸,α-KIC)、3-甲基-2-酮基戊酸(酮异亮氨酸,α-KMV)、2-酮基-4-甲硫基丁酸(酮蛋氨酸,α-KMTB)、3-甲基-2-酮基丁酸(酮缬氨酸,α-KIV)及2-酮基-3苯基丙酸(苯丙酮酸,α-PPA))。本发明还构建了表达RoLAAO突变体的重组菌株，该重组菌株在制备α-酮酸时具有高生产强度，高催化稳定性，可减少投菌量，极大节约了工业化的生产成本。
本发明提供了一种不透明红球菌(Rhodococcus opacus)L-氨基酸氧化酶RoLAAO突变体，所述不透明红球菌L-氨基酸氧化酶RoLAAO的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述L-氨基酸氧化酶RoLAAO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。进一步的，L-氨基酸氧化酶RoLAAO不仅仅局限于Rhodococcus opacus来源。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第226位酪氨酸突变为组氨酸，获得突变体RoLAAOY226H。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第227位天冬氨酸突变为组氨酸，获得突变体RoLAAOD227H。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第371位酪氨酸突变为亮氨酸，获得突变体RoLAAOY371L。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第466位丙氨酸突变为半胱氨酸，获得突变体RoLAAOA466C。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第467位色氨酸突变为丙氨酸，获得突变体RoLAAOW467A。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第226位酪氨酸突变为组氨酸，第227位天冬氨酸突变为组氨酸，获得突变体RoLAAOY226H/D227H。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第371位酪氨酸突变为亮氨酸，第466位丙氨酸突变为半胱氨酸，第467位色氨酸突变为丙氨酸，获得突变体RoLAAOY371L/A466C/W467A。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第226位酪氨酸突变为组氨酸，第227位天冬氨酸突变为组氨酸，第371位酪氨酸突变为亮氨酸，第466位丙氨酸突变为半胱氨酸，第467位色氨酸突变为丙氨酸，获得突变体RoLAAOY226H /D227H/Y371L/A466C/W467A。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体RoLAAOY226H、RoLAAOD227H、RoLAAOY371L、RoLAAOA466C、RoLAAOW467A、RoLAAOY226H/D227H、RoLAAOY371L/A466C/W467A、RoLAAOY226H /D227H/Y371L/A466C/W467A的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.7、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17所示，编码所述突变体的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18所示。
在本发明的一种实施方式中，突变体连接MBP蛋白与GS-Linker片段，所述MBP蛋白与GS-Linker片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，编码所述MBP蛋白与GS-Linker片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
在本发明的一种实施方式中，上述连有GS-Linker片段的MBP蛋白与L-氨基酸氧化酶RoLAAO或L-氨基酸氧化酶RoLAAO突变体连接时，去掉了L-氨基酸氧化酶RoLAAO第一位的甲硫氨酸。
本发明中去掉L-氨基酸氧化酶RoLAAO第一位的甲硫氨酸，同时连接MBP蛋白与GS-Linker片段是提高蛋白可溶性表达的常规手段，并不影响突变体本身的活性。
本发明提供了一种获得所述RoLAAO突变体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)在不透明红球菌L-氨基酸氧化酶RoLAAO氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计用于定点突变的突变引物，以携带MBP标签和RoLAAO基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体基因的质粒；
(2)将含突变体基因的质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化L-氨基酸氧化酶RoLAAO突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
本发明提供了一种含有pET28a-MBP-RoLAAOMutant重组载体的突变菌株BL21-MBP-RoLAAOMutant，所述突变菌株是以E.coli BL21(DE3)为宿主，携带pET28a-MBP-RoLAAOMutant，所述pET28a-MBP-RoLAAOMutant是以pET28a-MBP-RoLAAO为模板，通过全质粒PCR对RoLAAO的一个或多个位点进行突变所得。
本发明提供了一种利用BL21-MBP-RoLAAOMutant突变菌株制备α-酮酸的方法，所述方法以L-氨基酸为反应底物，将BL21-MBP-RoLAAOMutant突变菌株加入反应液，在pH7.5～9.0、25～35℃、过氧化氢酶添加量为2000～3000U/mL，180-240rpm条件下反应16～24h。
在本发明的一种实施方式中，所述BL21-MBP-RoLAAOMutant突变菌株的添加量为终浓度10～30g/L。
本发明提供了一种所述BL21-MBP-RoLAAOMutant突变菌株在制备系列α-酮酸中的应用。
有益效果
本发明提供了一种不透明红球菌L-氨基酸氧化酶的突变体RoLAAOY226H /Y227H/Y371L/A466C/W467A，能高效转化系列L-氨基酸(L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val或L-Phe)用于生产系列α-酮酸。与野生酶相比，催化L-Leu生产酮亮氨酸的kcat上调4.4倍，Km下调3.7倍，kcat/Km上调16.4倍；催化L-Ile生产酮异亮氨酸的kcat上调7.5倍，Km下调5.3倍，kcat/Km上调39.9倍；催化L-Met生产酮蛋氨酸的kcat上调3.1倍，Km下调2.9倍，kcat/Km上调9.2倍；催化L-Val生产酮缬氨酸的kcat上调13.1倍，Km下调6.3倍，kcat/Km上调82.8倍；催化L-Phe生产苯丙酮酸的kcat上调11.5倍，Km下调2.4倍，kcat/Km上调28.1倍。
本发明得到的突变体菌株BL21-MBP-RoLAAOY226H/Y227H/Y371L/A466C/W467A可高效转化五种氨基酸底物，突变菌体添加量为20g/L，底物L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val或L-Phe添加量为110g/L，转化周期24h，对应α-酮酸(酮亮氨酸、酮异亮氨酸、酮蛋氨酸、酮缬氨酸、苯丙酮酸)的产量均＞101g/L，底物摩尔转化率均高于95％。
本发明提供了一种以L-氨基酸为底物，以不透明红球菌L-氨基酸氧化酶的突变体RoLAAOY226H/Y227H/Y371L/A466C/W467A或突变体菌株BL21-MBP-RoLAAOY226H/Y227H/Y371L/A466C/W467A为催化剂，制备系列α-酮酸的方法，有效降低了生产成本，并且反应中仅以水为催化介质，具有反应条件温和、操作简便、收率高等优点。
附图说明
图1：RoLAAO、MBP-RoLAAO和突变体RoLAAOY226H/D227H/Y371L/A466C/W467A的SDS-PAGE结果图，泳道1-3分别为BL21-pET28a-RoLAAO菌体、发酵液上清及沉淀；泳道4-6分别为BL21-MBP-RoLAAO菌体、上清及沉淀；泳道7-9分别为BL21-MBP-RoLAAOY226H/D227H/Y371L/A466C/W467A菌体、发酵液上清及沉淀；
图2：根据2,4-二硝基苯肼显色法在OD520处测定的吸光值绘制的α-酮酸标准品的标准曲线图；
(A)：酮亮氨酸标准曲线；(B)：酮异亮氨酸标准曲线；(C)：酮蛋氨酸标准曲线；(D)：酮缬氨酸标准曲线；(E)：苯丙酮酸标准曲线；(F)：丙酮酸标准曲线；
图3：五种代表性底物L-氨基酸(L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val、L-Phe)及其对应α-酮酸高效液相色谱图；
(A-1)：L-Leu标样；(A-2)：L-Leu转化上清液底物剩余量图谱；(A-3)：酮亮氨酸标样；(A-4)：L-Leu转化上清液；
(B-1)：L-Ile标样；(B-2)：L-Ile转化上清液底物剩余量图谱；(B-3)：酮异亮氨酸标样；(B-4)：L-甲硫氨酸转化上清液；
(C-1)：L-Met标样；(E-2)：L-Met转化上清液底物剩余量图谱；(E-3)：酮蛋氨酸标样；(E-4)：L-Met转化上清液；
(D-1)：L-Val标样；(D-2)：L-Val转化上清液底物剩余量图谱；(D-3)：酮缬氨酸标样；(D-4)：L-Val转化上清液；
(E-1)：L-Phe标样；(E-2)：L-苯丙氨酸转化上清液底物剩余量图谱；(E-3)：苯丙酮酸标样；(E-4)：L-苯丙氨酸转化上清液。
具体实施方式
基因来源：本专利所涉及到的生物酶RoLAAO基因来源于Rhodococcus opacus，根据NCBI数据库中公开的Rhodococcus opacus来源的LAAO基因序列，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成基因并进行密码子优化，所得基因命名为RoLAAO，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述基因编码的L-氨基酸氧化酶RoLAAO的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
pET28a(+)质粒购自Novagen(Madison,WI,U.S.A.)，所用宿主为E.coli BL21(DE3)，限制性内切酶、ClonExpress II One Step Cloning Kit、Primer Star Max等购自TaKaRa(Dalian,China)。标样购自SIGMA。RoLAAO突变体均为分子改造所得，其余试剂均为市场购买所得。
配制LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，在121℃灭菌20min。
配置TB发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，安琪酵母粉FM 802 24g/L，甘油4g/L，KH2PO42.31g/L和K2HPO4 12.31g/L。
配制pH6.0的磷酸盐钠冲液：20mmol/L的Tris-HCl缓冲液，具体配方见《工业微生物实验技术手册》(中国轻工业出版社，诸葛健主编)。
五种α-酮酸标准曲线的绘制：称取酮亮氨酸(α-KIC)、酮异亮氨酸(α-KMV)、酮缬氨酸(α-KIV)、酮蛋氨酸(α-KMTB)、苯丙酮酸酸(α-PPA)、丙酮酸(α-PA)各10mg,分别溶于10mLddH2O中，按照表6配制各标准品浓度梯度，充分混匀后取标准品75μL，加入150μL 20mM2,4-二硝基苯肼，避光静置15分钟，加入3mL 0.8M的NaOH溶液，然后转移200μL至酶标条内，使用酶标仪在520nM波长处检测吸光值。按照上述方法绘制五种α-酮酸(酮亮氨酸、酮异亮氨酸、酮缬氨酸、酮蛋氨酸及苯丙酮酸酸)的标准曲线，对应标准曲线可见图2。
表1标准品的配制
Figure BDA0004066863250000051
2,4-二硝基苯肼显色法测定α-酮酸及HPLC法测定L-氨基酸和α-酮酸：具体步骤参见文献ChemCatChem,2021,13(21):4557-4566(Enhanced catalytic efficiency of L-amino acid deaminase achieved by a shorter hydride transfer distance)
相对活性测定方法：相对活性测定使用2,4-二硝基苯肼显色法测定，以相同催化条件下催化不同L-氨基酸底物生成对应α-酮酸量计算，亲本酶催化活性最高的底物组对应的酶相对活性定义为100％，其他酶的相对活性与之相比。
实施例1基于MBP标签蛋白产RoLAAO的重组菌株的构建
1.表达RoLAAO亲本菌株的构建、诱导表达与SDS-PAGE验证
以BamHⅠ和HindⅢ为酶切位点，将RoLAAO基因连接到pET-28a载体上，并将其转化E.coli BL21(DE3)，所得重组菌命名为BL21-pET-28a-RoLAAO。
将重组菌BL21-pET-28a-RoLAAO接种至LB种子培养基，200rpm、37℃培养培养8～12h，分别以2％接种量接种至摇瓶发酵培养基，在220rpm、37℃培养至OD600＝0.6～0.8左右，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，诱导条件为200rpm、16℃诱导16～20h。
收集发酵液中的菌体并超声破碎，将破碎后的悬浊液离心，对BL21-pET-28a-RoLAAO、破碎液上清及破碎液沉淀进行SDS-PAGE检测，结果显示RoLAAO蛋白大部分在沉淀中，可溶性表达很差(图1)，于是后续通过引入实验室现有的促进蛋白可溶表达的麦芽糖结合蛋白来提升亲本酶RoLAAO在上清中的表达，进而提升RoLAAO对L-氨基酸底物的催化性能。
2.MBP标签蛋白与RoLAAO共表达菌株的构建
以含MBP基因的质粒为模板(质粒信息公开在Rational design ofphospholipase D to improve the transphosphatidylation activity forphosphatidylserine synthesis[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2022,70(22):6709-6718.)，以表2所示MBP-S与MBP-A为引物进行PCR实验(反应体系如表3所示)，PCR反应条件为：①98℃30s；②98℃10s；③55℃15s；④72℃2000bp/min；⑤将②～④三个步骤循环34次；⑥72℃10min；⑦12℃保温。将PCR产物在37℃孵育30-45min以消化质粒模板(消化体系为：DpnI quick 0.3μL、上述反应PCR产物8.7μL、10×T Buffer 1μL)，获得MBP-GS linker片段。
以pET-28a-RoLAAO载体为模板，以表2所示ZT-MBP-RoLAAO-S与ZT-MBP-RoLAAO-A为引物进行PCR实验(反应体系如表3所示)，PCR反应条件与上述构建MBP-GS linker片段方法相同。采用上述构建MBP-GS linker片段中所述方法消化质粒模板，获得pET-28a-RoLAAO载体的线性片段。
表2构建E.coli-pET-28a-MBP-RoLAAO引物序列
Figure BDA0004066863250000061
Figure BDA0004066863250000071
表3 Primer Star Max体系表
Figure BDA0004066863250000072
将上述MBP-GS linker片段与pET-28a-RoLAAO载体的线性片段通过ClonExpressII One Step Cloning Kit重组体系进行连接，获得含有MBP蛋白标签的载体pET-28a-MBP-RoLAAO。上述ClonExpress II One Step Cloning Ki重组体系如表4所示，反应条件为37℃，30-45min。。
表4 ClonExpress II One Step Cloning Kit重组体系表
Figure BDA0004066863250000073
将上述pET-28a-MBP-RoLAAO载体通过化学转化方法导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，化学转化法具体步骤：
(1)将10μL同源重组产物导入100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞；
(2)冰浴15-30min；
(3)42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；
(4)加入800μL无抗性LB培养基混匀，于37℃，200rpm培养45min-1h；
(5)4000rpm离心3min收菌；
(6)移去上清，剩余100-200μL吹吸混匀涂布至含0.05mg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃恒温培养12h左右；
(7)挑取单克隆于含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中，200rpm、37℃恒温培养12h后，送去公司测序，测序正确的即为阳性转化子，命名为BL21-MBP-RoLAAO。
实施例2突变体菌株的构建
1.单突突变体菌株的构建
以pET-28a-MBP-RoLAAO载体为模板，设计RoLAAOY226H、RoLAAOD227H、RoLAAOY371L、RoLAAOA466C、和RoLAAOW467A突变位点的引物，通过全质粒PCR进行突变体构建。所用引物如表5中SEQ ID NO.25-34所示，PCR体系及步骤与实施例1相同。全质粒PCR结束后，使用DpnIquick消化酶消化PCR产物，然后将其转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，卡那霉素抗性平板培养后，挑选阳性转化子测序验证，得到BL21-MBP-RoLAAOY226H、BL21-MBP-RoLAAOD227H、BL21-MBP-RoLAAOY371L、BL21-MBP-RoLAAOA466C、和BL21-MBP-RoLAAOW467A突变体菌株。
表5突变引物序列
Figure BDA0004066863250000081
2.双突、三突和五突突变体菌株的构建
(1)在突变体BL21-MBP-RoLAAOY226H的基础上，以pET-28a-MBP-RoLAAOY226H为模板，利用突变引物D227H-S和D227H-A，通过全质粒PCR进行双突突变体构建，所用引物如表5中SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示，其他构建方法与上述单突突变体的构建相同，得到双突突变体BL21-MBP-RoLAAOY226H/D227H菌株。
(2)在突变体BL21-MBP-RoLAAOW467A的基础上，以pET-28a-MBP-RoLAAOW467A为模板，利用突变引物Y371-S、Y371-A和A466-S、A466-A，分别通过全质粒PCR进行双突突变体构建，所用引物如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32所示，其他构建方法与上述单突突变体的构建相同，制备得到双突突变体BL21-MBP-RoLAAOY371L/W467A、BL21-MBP-RoLAAOA466C/W467A菌株。
(3)在双突变体BL21-MBP-RoLAAOY371L/W467A的基础上，以pET-28a-MBP-RoLAAOY371L /W467A为模板，利用突变引物A466-S和A466-A，通过全质粒PCR进行三突突变体构建，所用引物如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示，其他构建方法与上述单突突变体的构建相同，制备得到三突突变体BL21-MBP-RoLAAOY371L/A466C/W467A菌株。
(4)在三突变体BL21-MBP-RoLAAOY371L/A466C/W467A的基础上，以pET-28a-MBP-RoLAAOY371L/A466C/W467A为模板，利用突变引物Y226HD227H-S、Y226HD227H-A，通过全质粒PCR进行五突突变体构建，所用引物如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示，其他构建方法与上述单突突变体的构建相同，制备得到五突突变体BL21-MBP-RoLAAOY226H/D227H/Y371L/A466C/W467A菌株。
实施例3突变体的筛选
1.RoLAAO亲本酶催化L-氨基酸相对活性测定
以下所述RoLAAO亲本酶均为未经MBP标签修饰的亲本菌株BL21-pET-28a-RoLAAO所表达的酶。催化L-氨基酸相对活性测定使用BL21-pET-28a-RoLAAO菌体进行，反应体系包含20g/L的菌体，100g/L的L-氨基酸底物(L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val、L-Phe或L-Ala)，反应温度为30℃，pH为8.0，商品化过氧化氢酶添加量为2200U/mL，转化时间为24h，转速为220rpm。转化反应结束后使用2,4-二硝基苯肼显色法进行活性检测，取部分稀释转化液加入20％的三氯乙酸；12000rpm离心10min后，取500μL上清，加入100μL20 mM的2,4-二硝基苯肼溶液，静置15min，加2mL 0.8M的NaOH溶液，混匀静置10min，在520nm下测定OD520值。根据图2的标准曲线算得对应α-酮酸生产量，结果表明：RoLAAO亲本酶催化L-Ala活性最强，将其相对活性定义为100％，与之相比，得出上述亲本酶对L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val及L-Phe相对活性依次为68.1％，45.2％，72.4％，32.3％，53.1％。
2.突变体酶催化L-氨基酸相对活性测定
将测序正确的突变体菌株BL21-MBP-RoLAAOMutant接种至LB种子培养基，200rpm、37℃培养培养8～12h，分别以2％接种量接种至摇瓶发酵培养基，在220rpm、37℃培养至OD600＝0.6～0.8左右，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，诱导条件为200rpm、16℃诱导16～20h。将诱导表达后的菌体与五种底物(L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val或L-Phe)进行转化。
采用与上述RoLAAO亲本菌株催化L-氨基酸的转化实验相同的转化方法对突变菌株分别进行五种底物L-氨基酸(L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val或L-Phe)的转化。转化反应结束后采用上述RoLAAO亲本菌株催化L-氨基酸相对活性测定所用方法通过2,4-二硝基苯肼(DNP)显色法进行测定，并根据图2的标准曲线算得对应α-酮酸生产量，结果如表6所示，结果显示突变体RoLAAOY226H/D227H/Y371L/A466C/W467A对五种底物催化效果最好。
表6代表性突变体转化五种底物L-氨基酸生成对应α-酮酸摇瓶测试结果
Figure BDA0004066863250000101
实施例4：亲本酶和突变体酶的表达纯化
将亲本菌株BL21-pET-28a-RoLAAO与实施例2制备得到的突变体重组菌株BL21-MBP-RoLAAOMutant阳性转化子分别接种至LB培养基，37℃培养至OD600为0.6～0.8时加入终浓度0.2mM IPTG诱导酶的表达，诱导温度为16℃，诱导时间18-22h，得到发酵液。发酵液于4℃、8000rpm离心8min，取菌体。加入10mL结合液A(20mM Tris-HCl、0.5mM NaCl、20mM咪唑，用HCl调pH至8.0)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间4s，间隔时间6s，共计15min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、10000rpm离心30min，得粗酶液。用0.22μm微孔滤膜过滤，备用。
准备镍离子亲和层析柱，首先，在4℃环境下利用恒流泵，向柱子里泵入超纯水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用10mL结合液A平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用结合液A冲洗杂蛋白至基线平衡，再用洗脱液B(20mM Tris-HCl、0.5mMNaCl、500mM咪唑)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，测定酶活，获得达到电泳纯的目的蛋白。
实施例5：亲本酶和最佳突变体的动力学参数测定
为了对突变体进行评价，本发明利用DNT显色法测定了RoLAAO亲本酶及最佳突变体RoLAAOY226H/Y227H/Y371L/A466C/W467A在30℃下的动力学参数。测试流程如下：取250μL实施例4所获酶液与2.5mL浓度梯度为0-100mM的L-氨基酸(L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val或L-Phe)混合，30℃震荡反应10min，加入20％的三氯乙酸终止酶反应；离心取500μL上清，加入100μL20mM的2,4-二硝基苯肼溶液，静置15min，加2mL 0.8M的NaOH溶液，混匀静置10min，在520nm下测定OD520值。根据所测得的OD520值，带入α-酮酸标准曲线中算得产生对应α-酮酸(酮亮氨酸、酮异亮氨酸、酮蛋氨酸、酮缬氨酸及苯丙酮酸酸)的浓度，并计算对应的酶学参数kcat、Km及kcat/Km值。
如表7所示，最佳突变体RoLAAOY226H/Y227H/Y371L/A466C/W467A与RoLAAO相比，催化L-Leu生产酮亮氨酸的kcat上调4.4倍，Km下调3.7倍，kcat/Km上调16.4倍；催化L-Ile生产酮异亮氨酸的kcat上调7.5倍，Km下调5.3倍，kcat/Km上调39.9倍；催化L-Met生产酮蛋氨酸的kcat上调3.1倍，Km下调2.9倍，kcat/Km上调9.2倍；催化L-Val生产酮缬氨酸的kcat上调13.1倍，Km下调6.3倍，kcat/Km上调82.8倍；催化L-Phe生产苯丙酮酸的kcat上调11.5倍，Km下调2.4倍，kcat/Km上调28.1倍。
表7 RoLAAO亲本酶及最佳突变体RoLAAOY226H/Y227H/Y371L/A466C/W467A的动力学参数
Figure BDA0004066863250000111
实施例6：最佳突变体规模化制备系列α-酮酸
为了进一步验证最佳突变体的催化性能，我们使用RoLAAOY226H/Y227H/Y371L/A466C/W467A在实施例3中的转化条件下在摇瓶中规模化制备五种底物L-氨基酸(L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val或L-Phe)生成对应α-酮酸，转化结果显示，以110g/L L-氨基酸(L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val或L-Phe)为底物，湿菌体添加量为20g/L，转化周期24h，如表8所示，对应α-酮酸(酮亮氨酸、酮异亮氨酸、酮蛋氨酸、酮缬氨酸、苯丙酮酸)的产量均＞101g/L，底物摩尔转化率均高于95％。
表8最佳突变体RoLAAOY226H/Y227H/Y371L/A466C/W467A规模化制备汇总表
Figure BDA0004066863250000121
对比例1：其他代表性突变体动力学参数测定
参照实施例5中的测定方法，测定了其他代表性突变体对L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val或L-Phe的动力学参数，包括双突变体RoLAAOY226H/D227H和三突变体RoLAAOY371L/A466C/W467A的酶学参数kcat、Km及kcat/Km值，详见表9。
表9双突变体RoLAAOY226H/D227H和三突变体RoLAAOY371L/A466C/W467A的动力学参数
Figure BDA0004066863250000122
Figure BDA0004066863250000131
对比例2：亲本酶转化110g/L底物生成系列α-酮酸
使用RoLAAO亲本酶在实施例3中的转化条件下在摇瓶中转化五种底物L-氨基酸(L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val或L-Phe)生成对应α-酮酸，转化结果显示，以110g/L L-氨基酸(L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val或L-Phe)为底物，湿菌体添加量为20g/L，转化周期24h，发现底物有大量残余，转化率普遍较低，对应α-酮酸(酮亮氨酸、酮异亮氨酸、酮蛋氨酸、酮缬氨酸、苯丙酮酸)的产量及底物摩尔转化率可见表10。
表10RoLAAO亲本酶规模化制备α-酮酸汇总表
Figure BDA0004066863250000132
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种不透明红球菌L-氨基酸氧化酶RoLAAO突变体，其特征在于，所述L-氨基酸氧化酶RoLAAO的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变位点包括L-氨基酸氧化酶RoLAAO的第226位、第227位、第371位、第466位、第467位的氨基酸中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为以下之一：
(a)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第226位酪氨酸突变为组氨酸，获得突变体RoLAAOY226H；
(b)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第227位天冬氨酸突变为组氨酸，获得突变体RoLAAOD227H；
(c)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第371位酪氨酸突变为亮氨酸，获得突变体RoLAAOY371L；
(d)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第466位丙氨酸突变为半胱氨酸，获得突变体RoLAAOA466C；
(e)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第467位色氨酸突变为丙氨酸，获得突变体RoLAAOW467A；
(f)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第226位酪氨酸突变为组氨酸，第227位天冬氨酸突变为组氨酸，获得突变体RoLAAOY226H/D227H；
(g)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第371位酪氨酸突变为亮氨酸，第466位丙氨酸突变为半胱氨酸，第467位色氨酸突变为丙氨酸，获得突变体RoLAAOY371L/A466C/W467A；
(h)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第226位酪氨酸突变为组氨酸，第227位天冬氨酸突变为组氨酸，第371位酪氨酸突变为亮氨酸，第466位丙氨酸突变为半胱氨酸，第467位色氨酸突变为丙氨酸，获得突变体RoLAAOY226H/D227H/Y371L/A466C/W467A。
3.编码权利要求1或2所述的突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的载体。
5.根据权利要求4所述载体，其特征在于，携带麦芽糖结合蛋白MBP基因及权利要求3所述突变体的基因，所述MBP基因与突变体的基因通过GS-Linker连接。
6.一种含有权利要求5所述载体的重组微生物细胞或重组菌。
7.一种系列α-酮酸的制备方法，其特征在于，所述方法是以L-氨基酸为底物，以权利要求1或2所述突变体或权利要求6所述重组菌为催化剂。
8.根据权利要求7所述系列α-酮酸的制备方法，其特征在于，所述α-酮酸包括4-甲基-2-酮基戊酸、3-甲基-2-酮基戊酸、α-酮基-γ-甲硫基丁酸、3-甲基-2-酮基丁酸或2-酮基-3苯基丙酸，所述底物包括L-Leu、L-Ile、L-Met、L-Val或L-Phe。
9.根据权利要求7所述系列α-酮酸的制备方法，其特征在于，突变体的添加量为终浓度10～30g/L，在pH7.5～9.0、25～35℃、过氧化氢酶添加量为2000～3000U/mL，180-240rpm条件下反应16～24h。
10.权利要求1或2所述突变体或权利要求6所述重组菌在制备系列α-酮酸中的应用。
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