CN113151230B

CN113151230B - 一种甲醛裂合酶的突变体蛋白及其应用

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Publication number: CN113151230B
Application number: CN202110324720.3A
Authority: CN
Inventors: 谭天伟; 周均惠; 张世鼎; 陈必强; 杨倩; 余森申
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2041-03-26
Also published as: CN113151230A

Abstract

本发明提供一种甲醛裂合酶(FLS)的突变体蛋白，其通过理性设计和定点突变改造获得，具有较高的酶活力，其酶活力与原始甲醛裂合酶FLS相比提高了4.67倍；将该FLS的突变体蛋白应用于催化甲醛缩合合成1,3‑二羟基丙酮(DHA)具有较高的催化效率；本发明以FLS突变体蛋白为催化剂，酶法催化合成DHA，提高了DHA的产量。

Description

一种甲醛裂合酶的突变体蛋白及其应用

技术领域

本发明属于酶的定向进化改造和生物催化应用技术领域，涉及一种甲醛裂合酶的突变体蛋白及其应用。

背景技术

1,3-二羟基丙酮(DHA)是目前发现的最简单的酮糖，是一种天然存在的，生物可降解的酮糖，是一种具有多功能的添加剂，可应用于化妆品、医药和食品行业。DHA可提供类似于紫外线(UV)诱导的棕褐色的暂时性色素沉着，是免晒黑皮肤护理制剂的有效成分，被广泛应用于化妆品行业。DHA是糖代谢的中间产物，在糖代谢过程中起着重要作用，与体重增加和脂肪减少，抗氧化活性以及增加耐力的能力有关，可用作猪饲料来降低猪体脂肪，提高瘦肉率。DHA还可应用与医药行业，如用于治疗白癜风，除此之外，更重要的是DHA是合成各种精细化学品和药物前体的重要前体，并且是多种精细化学品有机合成的多功能构建基块。

根据已发表的文献和专利，DHA的合成方法主要有化学合成法和微生物法两种。化学合成法是利用卤化物等盐类或金属催化剂或电催化剂来催化甘油转化为DHA的方法。在专利(CN107141208A)报道了一种1,3-二羟基丙酮的制备方法，在催化剂存在的条件下，将甘油和卤代试剂进行接触反应，制备得到1,3-二氯-2-丙醇，将1,3-二氯-2-丙醇进行氧化脱氢反应，得到中间产物1,3-二氯-2丙酮，将1,3-二氯-2丙酮与碱性物质在含水介质中接触进行水解反应，得到1,3-二羟基丙酮，此法用到的卤代试剂的毒性较大，对环境污染较为严重，且合成工艺复杂。微生物法多是以甘油或甲醇为原料，主要有两种途径：途径一，以甘油为原料，利用微生物(如大肠杆菌E.coli、产气克雷伯氏菌Klebsiella aerogenes和氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacteroxydans等)发酵过程中合成的甘油脱氢酶，脱去甘油分子第二个C原子上-OH的H变为C＝O以合成DHA；途径二，以甲醇为原料，利用微生物代谢产生的二羟基丙酮合成酶，将甲醇经氧化生成的甲醛和5-磷酸木酮糖催化转化为DHA和3-磷酸甘油醛。在专利(CN103789250A)提供了一种1，3-二羟基丙酮高产菌株及其构建方法，将1,3-二羟基丙酮高产菌株GOX205以氧化葡萄糖酸杆菌ATCC621H作为宿主，选择质粒pBBR1MCS-2作为载体，通过将编码甘油脱氢酶的sldAB基因转化进入宿主并进行表达将甘油转化为DHA。微生物发酵法具有制备周期长，产生较大的废液，效率低等缺点。体外酶法以甲醛为原料合成DHA的报道较少。

专利(201510446357.7)提供了一种具有催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮的酶及其制备方法，该方法是对苯甲酰甲酸脱羧酶进行改造。而甲醛裂合酶(FLS)是JustinB.Siegel等人(Justin B.Siegel，Amanda Lee Smith,et al.Proc Natl Acad Sci USA(2015)3704-3709，DOI号：10.1073/pnas.1500545112)对苯甲醛裂解酶对A28I，W89R，L90T，R188H，A394G，G419N和A480W改造得到的可将三分子甲醛缩合为DHA的酶，但其催化效率较低，Kcat/Km仅为4.7±0.1M^-1s^-1。

因此，目前存在的问题是需要研究开发一种用于外酶法合成DHA的高酶活或高催化效率的甲醛裂合酶(FLS)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有的甲醛裂合酶(FLS)对催化甲醛转化为DHA催化效率低的问题，提供一种甲醛裂合酶的突变体蛋白，其通过理性设计和定点突变进行改造，具有较高的酶活力；将该FLS的突变体蛋白应用于催化甲醛缩合合成DHA具有较高的催化效率；并以原FLS及其突变体为催化剂，得到了催化甲醛缩合生产1,3-二羟基丙酮的方法。

为此，本发明第一方面提供了一种影响甲醛裂合酶(FLS)酶活力的氨基酸突变子，其包括位于原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第28位Ile与Thr的突变、第480位Trp与Phe的突变、第481位Thr与Ser的突变、第482位Leu与Glu的突变、第483位His与Val的突变、第484位Phe与Ala的突变、第485位Gln与Phe的突变中的一个或几个。

本发明第二方面提供了一种甲醛裂合酶的突变体蛋白，其序列包含位于原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第28位Ile与Thr的突变、第480位Trp与Phe的突变、第481位Thr与Ser的突变、第482位Leu与Glu的突变、第483位His与Val的突变、第484位Phe与Ala的突变、第485位Gln与Phe的突变中的一个或几个。

在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为1号FLS突变体蛋白，其序列包含位于原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第484位Phe与Ala的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述1号FLS突变体蛋白的序列如SEQ NO.2所示。

在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为2号FLS突变体蛋白，其序列包含位于原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第482位Leu与Glu的突变、第484位Phe与Ala的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述2号FLS突变体蛋白的序列如SEQ NO.3所示。

在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为3号FLS突变体蛋白，其序列包含位于原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第482位Leu与Glu的突变、第483位His与Val的突变、第485位Gln与Phe的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述3号FLS突变体蛋白的序列如SEQ NO.4所示。

在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为4号FLS突变体蛋白，其序列包含位于原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第28位Ile与Thr的突变、第480位Trp与Phe的突变、第481位Thr与Ser的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述4号FLS突变体蛋白的序列如SEQ NO.5所示。

根据本发明，所述突变体蛋白还包括本发明上述突变体蛋白的N端或C端连接标签得到的融合蛋白；优选地，所述标签包括His标签和/或SUMO标签；进一步优选地，所述突变体蛋白还包括1号FLS突变体蛋白、2号FLS突变体蛋白、3号FLS突变体蛋白或4号FLS突变体蛋白的N端或C端连接His标签或SUMO标签得到的融合蛋白。

本发明第三方面提供了一种影响甲醛裂合酶酶活力的核苷酸突变子，其包括位于编码原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第83位T与C的突变、第1439位G与T的突变、第1440位G与T的突变、第1442位C与G的突变、第1444位C与G的突变、第1445位T与A的突变、第1447位C与G的突变、第1448位A与T的突变、第1450位T与G的突变、第1451位T与C的突变、第1452位T与C的突变、第1453位C与T的突变、第1454位A与T的突变、第1455位G与C的突变中的一个或几个。

本发明第四方面提供了一种编码本发明第二方面所述的突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第83位T与C的突变、第1439位G与T的突变、第1440位G与T的突变、第1442位C与G的突变、第1444位C与G的突变、第1445位T与A的突变、第1447位C与G的突变、第1448位A与T的突变、第1450位T与G的突变、第1451位T与C的突变、第1452位T与C的突变、第1453位C与T的突变、第1454位A与T的突变、第1455位G与C的突变、中的一个或几个。

在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码1号FLS突变体蛋白的核苷酸分子，其序列包含位于编码原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第1450位T与G的突变、第1451位T与C的突变、第1452位T与C的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述1号FLS突变体蛋白的核苷酸分子如SEQ NO.7所示。

在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码2号FLS突变体蛋白的核苷酸分子，其序列包含位于编码原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第1444位C与G的突变、第1445位T与A的突变、第1450位T与G的突变、第1451位T与C的突变、第1452位T与C的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述2号FLS突变体蛋白的核苷酸分子如SEQ NO.8所示。

在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码3号FLS突变体蛋白的核苷酸分子，其序列包含位于编码原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第1444位C与G的突变、第1445位T与A的突变、第1447位C与G的突变、第1448位A与T的突变、第1453位C与T的突变、第1454位A与T的突变、第1455位G与C的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述3号FLS突变体蛋白的核苷酸分子如SEQ NO.9所示。

在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码4号FLS突变体蛋白的核苷酸分子，其序列包含位于编码原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第83位T与C的突变、第1439位G与T的突变、第1440位G与T的突变、第1442位C与G的突变。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述4号FLS突变体蛋白的核苷酸分子如SEQ NO.10所示。

根据本发明，所述核酸分子为如下DNA分子：

(a1)编码区包括如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列的DNA分子；

(a2)核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码本发明第二方面中的所述的蛋白质的DNA分子；

(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列杂交，且编码本发明第二方面中的所述的蛋白质的DNA分子。

本发明第五方面提供了一种含有如本发明第四方面所述核苷酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

本发明第六方面提供了如本发明第二方面所述的突变体蛋白或由本发明第三方面所述的核苷酸分子或如本发明第五方面所述的表达盒、重组载体或重组微生物制得的突变体蛋白在催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮中的应用。

在本发明的一些实施例中，所述应用包括催化甲醛合成DHA、提高催化合成DHA产量和提高FLS催化效率。

本发明提供了一种甲醛裂合酶的突变体蛋白，其通过理性设计和定点突变改造获得，具有较高的酶活力，其酶活力比原始甲醛裂合酶FLS提高了4.67倍；将该FLS的突变体蛋白应用于催化甲醛缩合合成DHA具有较高的催化效率；本发明以FLS突变体蛋白为催化剂，酶法催化合成DHA，提高了DHA的产量。

附图说明

下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：

图1为甲醛裂合酶FLS催化甲醛缩合合成DHA的反应示意图。

图2为原甲醛裂合酶FLS的晶体结构图。

图3为原甲醛裂合酶FLS与产物DHA分子对接图。

图4为FLS突变体蛋白SDS凝胶电泳图。

图5为原FLS酶促反应动力学曲线图。

图6为1号FLS突变体酶促反应动力学曲线图。

图7示出酶催化反应体系的HPLC结果，其中a为底物甲醛的2,4-二硝基苯肼衍生物；b为产物DHA的2,4-二硝基苯肼衍生物；底物甲醛的2,4-二硝基苯肼衍生物的出峰时间为5.8min左右，产物DHA的2,4-二硝基苯肼衍生物出峰时间为3.8min左右。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

Ⅰ.术语

本发明所述用语“dNTPs Mix”是指可用于聚合酶链式反应(PCR)、测序、填补、切口平移、cDNA合成及TdT加尾反应的试剂，其中，dNTP代表“2′-脱氧核苷酸-5′-三磷酸”，Mix包含四种核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。

本发明所述用语“TPP”是指焦磷酸硫胺素，DNPH是指2,4-二硝基苯肼，DHA是指1,3-二羟基丙酮。

本发明中所述用语“核苷酸突变子”是指基因的核苷酸系列中可发生突变的最小单位。

类似地，本发明中所述用语“氨基酸突变子”是指蛋白质的氨基酸序列中可发生突变的最小单位。

本发明中所用标记“>”在表示核苷酸突变时代表碱基突变。

本发明中所用标记“c.”表示蛋白质的编码基因的核苷酸序列。

本发明中所用标记“p.”在表示蛋白质突变子时代表蛋白质的氨基酸序列。

本发明所述用语“催化效率”是指催化甲醛缩合合成DHA的比活力。

本发明中所述用语“酶活力”(enzyme activity)也称酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力；本发明中酶活力以比活力表示，是指每g酶蛋白所具有的酶活力，单位为U/g。

本发明中所述用语“原FLS基因”是指具有编码本发明中的甲醛裂合酶的突变体蛋白的突变前的原始氨基酸序列的核苷酸序列的原始FLS基因，其中，所述“原”和“原始”均相对于本发明中所提供的“突变”而言。

本发明中所述用语“蛋白”与“蛋白质”可以互相使用。

Ⅱ.实施方案

现有的甲醛裂合酶FLS对催化甲醛缩合合成DHA效率低，为解决该问题，本发明人对FLS进行了大量的研究，通过理性设计和定点突变定向进化改造，获得了具有较高酶活力的FLS突变体蛋白。

定点突变技术是在已知的核苷酸序列中准确改变一个或多个碱基，从而改变从而改变组成蛋白质的一个或多个氨基酸残基，以研究蛋白质结构和功能的关系。定点突变技术在基因工程改造中发挥着巨大作用，在提高酶活，改善酶的催化特征等方面取得了非常有益的效果。

具体地，本发明人通过以下步骤获得较高酶活力的FLS突变体蛋白：

(1)本发明中所述原FLS基因由文献(Justin B.Siegel，Amanda Lee Smith,etal.Proc Natl Acad Sci USA(2015)3704-3709，DOI号：10.1073/pnas.1500545112)获得(基于该文献由华大基因合成获得)。在该文献中通过对荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens biovar I)苯甲醛裂解酶(bznB)基因(其GenBank登录号：AY007242.1)进行碱基密码子优化和对A28I，W89R，L90T，R188H，A394G，G419N和A480W七个位点的氨基酸突变后获得所述原FLS基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，由该原FLS基因的核苷酸序列编码的原FLS氨基酸序列SEQ ID NO.1所示(PDB登录号：4QQ8)。

(2)在步骤(1)所提供的生物学信息基础上，结合理性设计和定点突变，构建酶活提高的FLS突变体蛋白。

更加具体的操作参见本发明下文中的实施例1-2，实施例1-2说明了优选的FLS突变体蛋白的制备过程，并以1号突变体为例进行了详细的说明。从中可以看出，本发明基于已发表文献(Justin B.Siegel，Amanda Lee Smith,et al.Proc Natl Acad Sci USA(2015)3704-3709，DOI号：10.1073/pnas.1500545112)获得的原甲醛裂合酶基因，通过理性设计和定点突变定向进化，成功构建酶活力提高4.67倍的突变体，该FLS突变体可高效催化甲醛合成DHA，其酶催化反应示意图如图1所示。

基于上述，在本发明第一方面，本发明人研究发现以下氨基酸突变子影响FLS的酶活力，其序列包含位于原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第28位Ile与Thr的突变(p.Ile28Thr)、第480位Trp与Phe的突变(p.Trp480Phe)、第481位Thr与Ser的突变(p.Thr481Ser)、第482位Leu与Glu的突变(p.Leu482Glu)、第483位His与Val的突变(p.His483Val)、第484位Phe与Ala的突变(p.Phe484Ala)、第485位Gln与Phe的突变(p.Gln485Phe)。

本发明第二方面所提供的FLS突变体蛋白，其序列中包含如发明第一方面所述的氨基酸突变子，这可以理解为，当其序列包含其序列包含位于原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第28位Ile与Thr的突变、第480位Trp与Phe的突变、第481位Thr与Ser的突变、第482位Leu与Glu的突变、第483位His与Val的突变、第484位Phe与Ala的突变、第485位Gln与Phe的突变中的一个或几个时，FLS酶活力会呈现较显著的变化。

具体地，以下FLS的突变体蛋白具有相对于原FLS具有显著提高的酶活力，尤其是对于甲醛的催化效率。

所述突变体蛋白为1号FLS突变体蛋白，其序列包含位于原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第484位Phe与Ala的突变；所述1号FLS突变体蛋白的序列如SEQ NO.2所示。

所述突变体蛋白为2号FLS突变体蛋白，其序列包含位于原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第482位Leu与Glu的突变、第484位Phe与Ala的突变；所述2号FLS突变体蛋白的序列如SEQ NO.3所示。

所述突变体蛋白为3号FLS突变体蛋白，其序列包含位于原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第482位Leu与Glu的突变、第483位His与Val的突变、第485位Gln与Phe的突变；所述3号FLS突变体蛋白的序列如SEQ NO.4所示。

所述突变体蛋白为4号FLS突变体蛋白，其序列包含位于原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第28位Ile与Thr的突变、第480位Trp与Phe的突变、第481位Thr与Ser的突变；所述4号FLS突变体蛋白的序列如SEQ NO.5所示。

根据本发明，所述突变体蛋白还包括本发明上述突变体蛋白的N端或C端连接标签得到的融合蛋白；优选地，所述标签包括His标签和/或SUMO标签。

在本发明的一些实施例中，诸如1号FLS突变体蛋白、2号FLS突变体蛋白、3号FLS突变体蛋白或4号FLS突变体蛋白等的FLS突变体蛋白N端或或C端连接SUMO标签可形成融合蛋白，促进蛋白水溶性，减少包涵体；在蛋白分离纯化时，SUMO标签可用SUMO protease切除。

在本发明的一些实施例中，诸如1号FLS突变体蛋白、2号FLS突变体蛋白、3号FLS突变体蛋白或4号FLS突变体蛋白等的FLS突变体蛋白N端或C端连接His标签可形成融合蛋白；在蛋白分离纯化时，His标签可与镍离子结合，从而分离杂蛋白与目的蛋白，而分离纯化所获得的由FLS突变体蛋白质连接His标签构成的融合蛋白可与直接用作催化剂用于催化甲醛缩合DHA，而不会对酶活力有不良影响。

基于上述，本发明中，所述突变体蛋白还包含其制备过程中分离纯化时由本发明上述FLS突变体蛋白的N端或C端连接标签得到的融合蛋白。

在本发明第三方面，本发明人研究发现以下核苷酸突变子影响FLS酶活力，其包括位于编码原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第83位T与C的突变(c.83T>C)、第1439位G与T的突变(c.1439G>T)、第1440位G与T的突变(c.1440G>T)、第1442位C与G的突变(c.1442C>G)、第1444位C与G的突变(c.1444C>G)、第1445位T与A的突变(c.1445T>A)、第1447位C与G的突变(c.1447C>G)、第1448位A与T的突变(c.1448A>T)、第1450位T与G的突变(c.1450T>G)、第1451位T与C的突变(c.1450T>C)、第1452位T与C的突变(c.1450T>C)、第1453位C与T的突变(c.1453C>T)、第1454位A与T的突变(c.1454A>T)、第1455位G与C的突变(c.1455G>C)中的一个或几个。

如前文所述，所述原FLS基因是通过对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescensbiovar I)苯甲醛裂解酶(bznB)基因(其GenBank登录号：AY007242.1)进行改造获得[参见文献Justin B.Siegel，Amanda Lee Smith,et al.Proc Natl Acad Sci USA(2015)3704-3709，其DOI号：10.1073/pnas.1500545112]，基于此，如SEQ ID NO.1所示(PDB登录号：4QQ8)氨基酸序列为原FLS蛋白序列，编码如SEQ ID NO.1所示(PDB登录号：4QQ8)的原FLS蛋白序列的如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列为原FLS基因的核苷酸序列。

本发明第四方面所提供的编码本发明第二方面所述的突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含如本发明第三方面所述的核苷酸突变子，这可以理解为，当其序列中包含位于编码原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第83位T与C的突变、第1439位G与T的突变、第1440位G与T的突变、第1442位C与G的突变、第1444位C与G的突变、第1445位T与A的突变、第1447位C与G的突变、第1448位A与T的突变、第1450位T与G的突变、第1451位T与C的突变、第1452位T与C的突变、第1453位C与T的突变、第1454位A与T的突变、第1455位G与C的突变中的一个或几个时，FLS的酶活力会呈现较显著的变化。

具体地，以下核苷酸分子所编码的本发明第二方面所述的突变体蛋白的相对于由对荧光假单胞菌来源的苯甲醛裂解酶改造的文献报道中获得(Justin B.Siegel，AmandaLee Smith,et al.Proc Natl Acad Sci USA(2015)3704-3709，DOI号：10.1073/pnas.1500545112)的原FLS基因的核苷酸序列编码的原FLS具有显著提高的酶活力，尤其是对于催化甲醛缩合为DHA的催化效率。

所述核苷酸分子为编码1号FLS突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第1450位T与G的突变、第1451位T与C的突变、第1452位T与C的突变；优选地，所述编码FLS突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述核苷酸分子为编码2号FLS突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第1444位C与G的突变、第1445位T与A的突变、第1450位T与G的突变、第1451位T与C的突变、第1452位T与C的突变；优选地，所述编码FLS突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述核苷酸分子为编码3号FLS突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第1444位C与G的突变、第1445位T与A的突变、第1447位C与G的突变、第1448位A与T的突变、第1453位C与T的突变、第1454位A与T的突变、第1455位G与C的突变；优选地，所述编码FLS突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述核苷酸分子为编码4号FLS突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第83位T与C的突变、第1439位G与T的突变、第1440位G与T的突变、第1442位C与G的突变；优选地，所述编码FLS突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

所述核苷酸分子为编码FLS突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第1450位T与G的突变、第1451位T与C的突变、第1452位T与C的突变；所述编码FLS突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

根据本发明，所述核酸分子为如下DNA分子：

在本发明第五方面，提供了用于制备本发明第二方面所述FLS的突变体蛋白的表达盒、重组载体或重组微生物，其包括：

(1)含有本发明第四方面所述核苷酸分子的表达盒；

(2)含有本发明第四方面所述核苷酸的重组质粒；

(3)含有本发明第四方面所述核苷酸分子或上述重组质粒的重组细胞，即含有本发明第四方面所述核苷酸分子或上述重组质粒的基因工程菌。

由此可见，本发明基于荧光假单胞菌来源的苯甲醛裂解酶改造获得的FLS成功构建了含有本发明第四方面所述核苷酸分子或上述重组质粒的基因工程菌重组工程菌株。

本发明第四方面所述核苷酸分子所述cDNA可用于构建重组表达质粒，其可被转移到宿主细胞内进行突变体蛋白表达，并获得本发明第二方面所述的FLS的突变体蛋白。

本发明所述重组表达质粒的载体为pET28a(+)-SUMO(北京华越洋生物有限公司)，宿主细胞为E.coli BL21(DE3)(北京华越洋生物有限公司)。

本发明所提供的FLS突变体蛋白，其原蛋白(PDB登录号：4QQ8)是通过对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens biovar I)苯甲醛裂解酶基因bznB(GenBank登录号：AY007242.1)进行改造获得[参见文献J ustin B.Siegel，Amanda Lee Smith,et al.ProcNatl Acad Sci USA(2015)3704-3709，其DOI号：10.1073/pnas.1500545112]。所述突变体蛋白的编码基因(cDNA)被导入宿主细胞后，所形成的突变体蛋白为胞内蛋白，需通过超声破碎等方法获得。

本发明第六方面提供了如本发明第二方面所述的突变体蛋白或由本发明第三方面所述的核苷酸分子或如本发明第五方面所述的表达盒、重组载体或重组微生物制得的突变体蛋白在催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮中的应用，这可以理解为利用如本发明第二方面所述的突变体蛋白或由本发明第三方面所述的核苷酸分子或如本发明第五方面所述的表达盒、重组载体或重组微生物制得的突变体蛋白催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮的方法，亦即，利用具有催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮功能的FLS突变体，反应合成1,3-二羟基丙酮的方法。

本发明上述利用如本发明第二方面所述的突变体蛋白或由本发明第三方面所述的核苷酸分子或如本发明第五方面所述的表达盒、重组载体或重组微生物制得的突变体蛋白催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮的方法为优选的技术方案，实际应用中本发明并不排除利用原FLS催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮的方案。

本发明提供了甲醛裂合酶的定点突变及1,3-二羟基丙酮合成方法，属于生物合成、基因工程、酶的理性设计和定向进化领域。本发明的技术方案主要包括两部分：(1)在原甲醛裂合酶的氨基酸序列基础上，沿5′端到3′端方向通过定点突变获得甲醛裂合酶突变体，将该突变酶转化到大肠杆菌进行异源表达；(2)以甲醛裂合酶及其突变体为催化剂，得到了酶法催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮的合成新方法，1,3-二羟基丙酮的产量达到了9.59g/L。本发明通过理性设计、定点突变和定向进化获得了酶活力和催化效率较野生酶呈现显著提高的甲醛裂合酶，并开辟了1,3-二羟基丙酮的合成新方法，解决了以CO₂为原料多酶催化合成1,3-二羟基丙酮途径中甲醛转化为1,3-二羟基丙酮的产量低的难题。

本发明中的检测方法及仪器：

(1)采用PTC-200型PCR仪(MJRESEARCH.INC.美国)进行PCR扩增。

(2)采用MINI-SUB CELL GT POWER PAC 1000型琼脂糖凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)进行PCR产物的检测与分离。

(3)采用10mL规格镍琼脂糖凝胶FF亲和层析柱填料预装柱(中国bersee)进行蛋白纯化。

(4)采用870型酶标仪(Thermo Fisher Scientific)进行纯化后蛋白质浓度测定。

(5)采用HPLC U3000型高效液相色谱仪(Thermo Fisher Scientific)测定产物。

Ⅲ.实施例

以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明均可由商业渠道获得。

以下实施例中涉及到的培养基配方如下[培养基中的单位为％(W/V)]：

LB液体培养基：蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％；

LB固体培养基：琼脂1.5％、蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％。

实施例1：理性设计

从PDB数据库中获得FLS的晶体结构(图2)，并用modeller建模得到FLS模型结构图。

基于FLS模型结构图，使用Autodock4.0中的半柔性对接方法，选取辅酶TPP的C2原子作为对接中心，将二羟丙酮对接到每一个蛋白的活性位点附近(见图3)。对接体系过程中保留蛋白的辅因子TPP，为配体和蛋白质添加氢并计算其Gasteiger电荷，之后使用Lamarckian遗传算法进行对接模拟，筛选得到距离活性中心较近和具有最高对接能的结构被选择为初始MD结构。

使用GROMACS程序对初始MD结构进行分子动力学(MD)模拟，发现I28、W480、T481、L482、H483、F484、Q485残基使得口袋保持了闭合的状态，此时底物无法进行口袋与TPP结合，导致原FLS酶活较低。通过对模拟轨迹的分析发现底物目前还不能在结合口袋中稳定的结合，而口袋的开口大小和口袋环境可能会影响其结合。

实施例2：理性设计的定点突变

因此从扩大口袋大小、优化口袋环境和增强TPP与底物的相互作用的策略出发，结合对各种氨基酸残基的性质分析，设计了以下突变体蛋白(表1)：

表1 理性设计的突变文库

定点突变所用引物对如表5所示：

表2 引物序列

以1号突变体F484A为例详细说明实验过程及方法。

引物对1：上游引物-HindⅢ：atggctatgattactggtggtgaactggttg

下游引物-F484A-R：ccagctgctgggcgtgcagggtccagcc

引物对2：上游引物-F484A-F：cctgcacgcccagcagctggccgttggt

下游引物-XhoⅠ：cgcgccggattggaaatacagattctcc

以FLS(全长1725bp)为模板，利用设计好的引物对1和引物对2分别扩增目的基因的上游基因(1-1452bp)和下游基因(1452-1725bp)，PCR扩增反应体系1如表3所示。

表3 PCR扩增反应体系1

PCR扩增反应程序1如表4所示。

表4 PCR扩增反应程序1

扩增得到的上游基因和下游基因PCR产物通过DNA琼脂糖凝胶电游分离检验后，胶回收得到实验所需的基因DNA片段，将胶回收得到的上游基因和下游基因产物继续进行PCR，上游基因和下游基因互补序列重新结合，使二者重新形成完整的目的基因片段，PCR扩增体系2如表5所示，扩增程序第4步时间设置应以目的基因全长设定。

表5 PCR扩增反应体系2

PCR扩增反应程序2如表6所示。

表6 PCR扩增反应程序1

将上述PCR产物加入引物继续扩增，PCR扩增体系3如表7所示。

表7 PCR扩增反应体系3

PCR扩增反应程序3如表8所示。

表8 PCR扩增反应程序3

PCR结束后将PCR产物通过DNA琼脂糖凝胶电泳分离检验后，胶回收得到实验所需的基因DNA片段，纯化后所得基因DNA片段及载体pET28a(+)-SUMO空质粒均用限制性内切酶HindⅢ-HF和XhoⅠ-HF进行双酶切，然后连接，转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于LB平板上(含有50μg/mL的Kana抗生素)，37℃过夜培养12h，挑取平板上的单克隆菌进行菌落PCR及核苷酸序列测定，获得正确的突变菌株。

实施例3：摇瓶发酵培养菌体获得酶液

(1)将获得的正确突变菌株接菌到加有50μg/mL的Kana抗生素的4mL LB液体培养基中，在37℃、180rpm的恒温培养箱中培养12-16h；

(2)将步骤(1)培养的菌液接菌到加有50μg/mL的Kana抗生素的50mL LB液体培养基中，在37℃、150rpm的恒温培养箱中培养至OD600为0.6-0.8后，加入IPTG诱导剂(终浓度为0.2mM)，在25℃、150rpm的恒温培养箱中诱导培养24h；

(3)培养结束，4℃、12000rpm离心10min收集菌体，加入10mL含有10mM咪唑和100mMNaCl的PBS溶液(0.05M，pH＝7.5)重悬菌体，超声破碎15min；

(4)细胞破碎后4℃、12000rpm离心20min，所得上清为实验所需粗酶液；

(5)粗酶液过镍琼脂糖凝胶FF亲和层析柱调料预装柱纯化得到纯化酶1；

(6)纯化酶1使用SUMO protease(北京博迈德基因技术有限公司)在4℃中反应16-24h切除SUMO标签，接着使用镍琼脂糖凝胶FF亲和层析柱调料预装柱纯化得到纯化溶液2，使用30KDa的超滤膜超滤纯化溶液1得到最终纯化酶液，使用SDS凝胶电泳验证蛋白表达正确(图4)；

(7)使用G250考马斯亮蓝与酶液进行反应，然后使用870型酶标仪(Thermo FisherScientific)检测595nm的吸光度，从而计算蛋白浓度。

实施例4酶活测定

反应体系：6mM甲醛，2Mm无水硫酸镁，0.1mM TPP，0.16μM酶，反应体系总体积为1mL，缓冲液为0.05M，pH＝8.0的PBS。35℃中反应16h后，使用DNPH在60℃条件下对反应液进行衍生1h得到产物DHA的DNPH衍生物，利用HPLC检测产物DHA的DNPH衍生物的生成量计算酶活。

HPLC检测DHA方法：带有紫外检测器的U3000高效液相色谱仪，C18柱子(Thermo，5μm，4.6×250mm)，35℃，0.8mL/min，A流动相和B流动相分别为水和乙腈，A和B的体积比为3:7。

1个酶活力单位定义为：在特定条件下，在1min内转化1μmol底物(甲醛)生成产物(DHA)的产量的酶量，故比酶活的计算公式为：

U/g＝(C_DHA(μmol)×3/(16×60min))/蛋白质量(g)

比活力最终测定结果如表10所示，1号突变体酶活是原FLS酶活的4.67倍。

表10 蛋白质比活力

使用HPLC检测产物DHA的生成，HPLC结果如图7所示，其中a为底物甲醛的2,4-二硝基苯肼衍生物；b为产物DHA的2,4-二硝基苯肼衍生物；底物甲醛的2,4-二硝基苯肼衍生物的出峰时间为5.8min左右，产物DHA的2,4-二硝基苯肼衍生物出峰时间为3.8min左右。

实施例5：动力学参数测定

分别测定底物浓度0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20mM的反应体系的反应速率，以底物浓度为横坐标，V为纵坐标绘制酶促反应动力学曲线，采用米氏方程求得Km值，从而计算Kcat＝Vmax/蛋白浓度和Km/Kcat。

原FLS和1号FLS突变体蛋白的酶促反应动力学曲线如图5、6所示，Km、Kcat与Km/Kcat的计算结果如表11所示：

表11 动力学参数

实施例6：酶法催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮体系1

以pET28a-SUMO为载体，E.coli BL21(DE3)为宿主，加入200μM IPTG在25℃诱导表达原FLS及FLS突变体，细胞破碎纯化后得到的酶液进行催化甲醛合成DHA的反应。

反应体系：6mM甲醛，2mM无水硫酸镁，0.1mM TPP，1号40μg原FLS或1号FLS突变体蛋白，反应体系总体积为1mL，缓冲液为0.05M，pH＝8.0的PBS。25℃中反应16h后，使用DNPH在60℃条件下对反应液进行衍生1h得到产物DHA的DNPH衍生物，利用HPLC检测产物DHA的产量。

最终测定结果显示原FLS、1号FLS突变体蛋白(p.F484A)催化体系DHA的产量分别为0.062g/L和0.128g/L，转化率分别为34％和71％，FLS突变体蛋白的DHA产量是原FLS的DHA产量的2.08倍。

实施例7：酶法催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮体系2

以pET29b(+)质粒(北京华越洋生物有限公司)为载体，加入pGro7分子伴侣(北京天根生化科技有限公司)共表达，E.coliBL21(DE3)为宿主，加入50μM IPTG在16℃诱导原FLS和1号FLS突变体蛋白，细胞破碎纯化后得到的酶液进行催化甲醛合成DHA的反应。在含有甲醛、TPP和无水硫酸镁的反应体系中分别加入40μg纯化后的原FLS或1号FLS突变体蛋白，35℃中反应，利用HPLC检测产物DHA的生成量。测定结果显示1号FLS突变体蛋白(p.F484A)催化体系反应4h后DHA的产量为0.188g/L，原FLS催化体系反应16h后DHA产量才达到0.155g/L，1号FLS突变体蛋白的催化效率较原FLS显著提高了。

实施例8：酶法催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮体系3

以pET29b(+)为载体，加入pGro7分子伴侣共表达，E.coliBL21(DE3)为宿主，加入50μM IPTG在16℃诱导1号FLS突变体蛋白，细胞破碎纯化后得到的酶液进行催化甲醛合成DHA的反应。在含有甲醛、TPP和无水硫酸镁的反应体系中加入1mg纯化后的1号FLS突变体蛋白，35℃中反应2h后，利用HPLC检测产物DHA的生成量。测定结果显示1号FLS突变体蛋白(p.F484A)催化体系DHA的产量为9.59g/L，1号FLS突变体蛋白催化合成DHA的产量显著提高。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 一种甲醛裂合酶的突变体蛋白及其应用

<130> RB2100691-FF

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 575

<212> PRT

<213> （原FLS）

<400> 1

Met Ala Met Ile Thr Gly Gly Glu Leu Val Val Arg Thr Leu Ile Lys Ala Gly Val Glu

1 5 10 15 20

His Leu Phe Gly Leu His Gly Ile His Ile Asp Thr Ile Phe Gln Ala Cys Leu Asp His

25 30 35 40

Asp Val Pro Ile Ile Asp Thr Arg His Glu Ala Ala Ala Gly His Ala Ala Glu Gly Tyr

45 50 55 60

Ala Arg Ala Gly Ala Lys Leu Gly Val Ala Leu Val Thr Ala Gly Gly Gly Phe Thr Asn

65 70 75 80

Ala Val Thr Pro Ile Ala Asn Ala Arg Thr Asp Arg Thr Pro Val Leu Phe Leu Thr Gly

85 90 95 100

Ser Gly Ala Leu Arg Asp Asp Glu Thr Asn Thr Leu Gln Ala Gly Ile Asp Gln Val Ala

105 110 115 120

Met Ala Ala Pro Ile Thr Lys Trp Ala His Arg Val Met Ala Thr Glu His Ile Pro Arg

125 130 135 140

Leu Val Met Gln Ala Ile Arg Ala Ala Leu Ser Ala Pro Arg Gly Pro Val Leu Leu Asp

145 150 155 160

Leu Pro Trp Asp Ile Leu Met Asn Gln Ile Asp Glu Asp Ser Val Ile Ile Pro Asp Leu

165 170 175 180

Val Leu Ser Ala His Gly Ala His Pro Asp Pro Ala Asp Leu Asp Gln Ala Leu Ala Leu

185 190 195 200

Leu Arg Lys Ala Glu Arg Pro Val Ile Val Leu Gly Ser Glu Ala Ser Arg Thr Ala Arg

205 210 215 220

Lys Thr Ala Leu Ser Ala Phe Val Ala Ala Thr Gly Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Glu

225 230 235 240

Gly Leu Ser Met Leu Ser Gly Leu Pro Asp Ala Met Arg Gly Gly Leu Val Gln Asn Leu

245 250 255 260

Tyr Ser Phe Ala Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu Val Leu Met Leu Gly Ala Arg Phe

265 270 275 280

Gly Leu Asn Thr Gly His Gly Ser Gly Gln Leu Ile Pro His Ser Ala Gln Val Ile Gln

285 290 295 300

Val Asp Pro Asp Ala Cys Glu Leu Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ala Leu Gly Ile Val Ala

305 310 315 320

Asp Val Gly Gly Thr Ile Glu Ala Leu Ala Gln Ala Thr Ala Gln Asp Ala Ala Trp Pro

325 330 335 340

Asp Arg Gly Asp Trp Cys Ala Lys Val Thr Asp Leu Ala Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ile

345 350 355 360

Ala Ala Lys Ser Ser Ser Glu His Ala Leu His Pro Phe His Ala Ser Gln Val Ile Ala

365 370 375 380

Lys His Val Asp Ala Gly Val Thr Val Val Ala Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Leu Trp Leu

385 390 395 400

Ser Glu Val Met Ser Arg Val Lys Pro Gly Gly Phe Leu Cys His Gly Tyr Leu Asn Ser

405 410 415 420

Met Gly Val Gly Phe Gly Thr Ala Leu Gly Ala Gln Val Ala Asp Leu Glu Ala Gly Arg

425 430 435 440

Arg Thr Ile Leu Val Thr Gly Asp Gly Ser Val Gly Tyr Ser Ile Gly Glu Phe Asp Thr

445 450 455 460

Leu Val Arg Lys Gln Leu Pro Leu Ile Val Ile Ile Met Asn Asn Gln Ser Trp Gly Trp

465 470 475 480

Thr Leu His Phe Gln Gln Leu Ala Val Gly Pro Asn Arg Val Thr Gly Thr Arg Leu Glu

485 490 495 500

Asn Gly Ser Tyr His Gly Val Ala Ala Ala Phe Gly Ala Asp Gly Tyr His Val Asp Ser

505 510 515 520

Val Glu Ser Phe Ser Ala Ala Leu Ala Gln Ala Leu Ala His Asn Arg Pro Ala Cys Ile

525 530 535 540

Asn Val Ala Val Ala Leu Asp Pro Ile Pro Pro Glu Glu Leu Ile Leu Ile Gly Met Asp

545 550 555 560

Pro Phe Ala Gly Ser Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ala

565 570 575

<210> 2

<211> 575

<212> PRT

<213> （1号FLS突变体蛋白）

<400> 2

Met Ala Met Ile Thr Gly Gly Glu Leu Val Val Arg Thr Leu Ile Lys Ala Gly Val Glu

1 5 10 15 20

His Leu Phe Gly Leu His Gly Ile His Ile Asp Thr Ile Phe Gln Ala Cys Leu Asp His

25 30 35 40

Asp Val Pro Ile Ile Asp Thr Arg His Glu Ala Ala Ala Gly His Ala Ala Glu Gly Tyr

45 50 55 60

Ala Arg Ala Gly Ala Lys Leu Gly Val Ala Leu Val Thr Ala Gly Gly Gly Phe Thr Asn

65 70 75 80

Ala Val Thr Pro Ile Ala Asn Ala Arg Thr Asp Arg Thr Pro Val Leu Phe Leu Thr Gly

85 90 95 100

Ser Gly Ala Leu Arg Asp Asp Glu Thr Asn Thr Leu Gln Ala Gly Ile Asp Gln Val Ala

105 110 115 120

Met Ala Ala Pro Ile Thr Lys Trp Ala His Arg Val Met Ala Thr Glu His Ile Pro Arg

125 130 135 140

Leu Val Met Gln Ala Ile Arg Ala Ala Leu Ser Ala Pro Arg Gly Pro Val Leu Leu Asp

145 150 155 160

Leu Pro Trp Asp Ile Leu Met Asn Gln Ile Asp Glu Asp Ser Val Ile Ile Pro Asp Leu

165 170 175 180

Val Leu Ser Ala His Gly Ala His Pro Asp Pro Ala Asp Leu Asp Gln Ala Leu Ala Leu

185 190 195 200

Leu Arg Lys Ala Glu Arg Pro Val Ile Val Leu Gly Ser Glu Ala Ser Arg Thr Ala Arg

205 210 215 220

Lys Thr Ala Leu Ser Ala Phe Val Ala Ala Thr Gly Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Glu

225 230 235 240

Gly Leu Ser Met Leu Ser Gly Leu Pro Asp Ala Met Arg Gly Gly Leu Val Gln Asn Leu

245 250 255 260

Tyr Ser Phe Ala Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu Val Leu Met Leu Gly Ala Arg Phe

265 270 275 280

Gly Leu Asn Thr Gly His Gly Ser Gly Gln Leu Ile Pro His Ser Ala Gln Val Ile Gln

285 290 295 300

Val Asp Pro Asp Ala Cys Glu Leu Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ala Leu Gly Ile Val Ala

305 310 315 320

Asp Val Gly Gly Thr Ile Glu Ala Leu Ala Gln Ala Thr Ala Gln Asp Ala Ala Trp Pro

325 330 335 340

Asp Arg Gly Asp Trp Cys Ala Lys Val Thr Asp Leu Ala Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ile

345 350 355 360

Ala Ala Lys Ser Ser Ser Glu His Ala Leu His Pro Phe His Ala Ser Gln Val Ile Ala

365 370 375 380

Lys His Val Asp Ala Gly Val Thr Val Val Ala Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Leu Trp Leu

385 390 395 400

Ser Glu Val Met Ser Arg Val Lys Pro Gly Gly Phe Leu Cys His Gly Tyr Leu Asn Ser

405 410 415 420

Met Gly Val Gly Phe Gly Thr Ala Leu Gly Ala Gln Val Ala Asp Leu Glu Ala Gly Arg

425 430 435 440

Arg Thr Ile Leu Val Thr Gly Asp Gly Ser Val Gly Tyr Ser Ile Gly Glu Phe Asp Thr

445 450 455 460

Leu Val Arg Lys Gln Leu Pro Leu Ile Val Ile Ile Met Asn Asn Gln Ser Trp Gly Trp

465 470 475 480

Thr Leu His Ala Gln Gln Leu Ala Val Gly Pro Asn Arg Val Thr Gly Thr Arg Leu Glu

485 490 495 500

Asn Gly Ser Tyr His Gly Val Ala Ala Ala Phe Gly Ala Asp Gly Tyr His Val Asp Ser

505 510 515 520

Val Glu Ser Phe Ser Ala Ala Leu Ala Gln Ala Leu Ala His Asn Arg Pro Ala Cys Ile

525 530 535 540

Asn Val Ala Val Ala Leu Asp Pro Ile Pro Pro Glu Glu Leu Ile Leu Ile Gly Met Asp

545 550 555 560

Pro Phe Ala Gly Ser Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ala

565 570 575

<210> 3

<211> 575

<212> PRT

<213> （2号FLS突变体蛋白）

<400> 3

Met Ala Met Ile Thr Gly Gly Glu Leu Val Val Arg Thr Leu Ile Lys Ala Gly Val Glu

1 5 10 15 20

His Leu Phe Gly Leu His Gly Ile His Ile Asp Thr Ile Phe Gln Ala Cys Leu Asp His

25 30 35 40

Asp Val Pro Ile Ile Asp Thr Arg His Glu Ala Ala Ala Gly His Ala Ala Glu Gly Tyr

45 50 55 60

Ala Arg Ala Gly Ala Lys Leu Gly Val Ala Leu Val Thr Ala Gly Gly Gly Phe Thr Asn

65 70 75 80

Ala Val Thr Pro Ile Ala Asn Ala Arg Thr Asp Arg Thr Pro Val Leu Phe Leu Thr Gly

85 90 95 100

Ser Gly Ala Leu Arg Asp Asp Glu Thr Asn Thr Leu Gln Ala Gly Ile Asp Gln Val Ala

105 110 115 120

Met Ala Ala Pro Ile Thr Lys Trp Ala His Arg Val Met Ala Thr Glu His Ile Pro Arg

125 130 135 140

Leu Val Met Gln Ala Ile Arg Ala Ala Leu Ser Ala Pro Arg Gly Pro Val Leu Leu Asp

145 150 155 160

Leu Pro Trp Asp Ile Leu Met Asn Gln Ile Asp Glu Asp Ser Val Ile Ile Pro Asp Leu

165 170 175 180

Val Leu Ser Ala His Gly Ala His Pro Asp Pro Ala Asp Leu Asp Gln Ala Leu Ala Leu

185 190 195 200

Leu Arg Lys Ala Glu Arg Pro Val Ile Val Leu Gly Ser Glu Ala Ser Arg Thr Ala Arg

205 210 215 220

Lys Thr Ala Leu Ser Ala Phe Val Ala Ala Thr Gly Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Glu

225 230 235 240

Gly Leu Ser Met Leu Ser Gly Leu Pro Asp Ala Met Arg Gly Gly Leu Val Gln Asn Leu

245 250 255 260

Tyr Ser Phe Ala Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu Val Leu Met Leu Gly Ala Arg Phe

265 270 275 280

Gly Leu Asn Thr Gly His Gly Ser Gly Gln Leu Ile Pro His Ser Ala Gln Val Ile Gln

285 290 295 300

Val Asp Pro Asp Ala Cys Glu Leu Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ala Leu Gly Ile Val Ala

305 310 315 320

Asp Val Gly Gly Thr Ile Glu Ala Leu Ala Gln Ala Thr Ala Gln Asp Ala Ala Trp Pro

325 330 335 340

Asp Arg Gly Asp Trp Cys Ala Lys Val Thr Asp Leu Ala Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ile

345 350 355 360

Ala Ala Lys Ser Ser Ser Glu His Ala Leu His Pro Phe His Ala Ser Gln Val Ile Ala

365 370 375 380

Lys His Val Asp Ala Gly Val Thr Val Val Ala Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Leu Trp Leu

385 390 395 400

Ser Glu Val Met Ser Arg Val Lys Pro Gly Gly Phe Leu Cys His Gly Tyr Leu Asn Ser

405 410 415 420

Met Gly Val Gly Phe Gly Thr Ala Leu Gly Ala Gln Val Ala Asp Leu Glu Ala Gly Arg

425 430 435 440

Arg Thr Ile Leu Val Thr Gly Asp Gly Ser Val Gly Tyr Ser Ile Gly Glu Phe Asp Thr

445 450 455 460

Leu Val Arg Lys Gln Leu Pro Leu Ile Val Ile Ile Met Asn Asn Gln Ser Trp Gly Trp

465 470 475 480

Thr Glu His Ala Gln Gln Leu Ala Val Gly Pro Asn Arg Val Thr Gly Thr Arg Leu Glu

485 490 495 500

Asn Gly Ser Tyr His Gly Val Ala Ala Ala Phe Gly Ala Asp Gly Tyr His Val Asp Ser

505 510 515 520

Val Glu Ser Phe Ser Ala Ala Leu Ala Gln Ala Leu Ala His Asn Arg Pro Ala Cys Ile

525 530 535 540

Asn Val Ala Val Ala Leu Asp Pro Ile Pro Pro Glu Glu Leu Ile Leu Ile Gly Met Asp

545 550 555 560

Pro Phe Ala Gly Ser Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ala

565 570 575

<210> 4

<211> 575

<212> PRT

<213> （3号FLS突变体蛋白）

<400> 4

Met Ala Met Ile Thr Gly Gly Glu Leu Val Val Arg Thr Leu Ile Lys Ala Gly Val Glu

1 5 10 15 20

His Leu Phe Gly Leu His Gly Ile His Ile Asp Thr Ile Phe Gln Ala Cys Leu Asp His

25 30 35 40

Asp Val Pro Ile Ile Asp Thr Arg His Glu Ala Ala Ala Gly His Ala Ala Glu Gly Tyr

45 50 55 60

Ala Arg Ala Gly Ala Lys Leu Gly Val Ala Leu Val Thr Ala Gly Gly Gly Phe Thr Asn

65 70 75 80

Ala Val Thr Pro Ile Ala Asn Ala Arg Thr Asp Arg Thr Pro Val Leu Phe Leu Thr Gly

85 90 95 100

Ser Gly Ala Leu Arg Asp Asp Glu Thr Asn Thr Leu Gln Ala Gly Ile Asp Gln Val Ala

105 110 115 120

Met Ala Ala Pro Ile Thr Lys Trp Ala His Arg Val Met Ala Thr Glu His Ile Pro Arg

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Leu Val Met Gln Ala Ile Arg Ala Ala Leu Ser Ala Pro Arg Gly Pro Val Leu Leu Asp

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Leu Pro Trp Asp Ile Leu Met Asn Gln Ile Asp Glu Asp Ser Val Ile Ile Pro Asp Leu

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Val Leu Ser Ala His Gly Ala His Pro Asp Pro Ala Asp Leu Asp Gln Ala Leu Ala Leu

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Leu Arg Lys Ala Glu Arg Pro Val Ile Val Leu Gly Ser Glu Ala Ser Arg Thr Ala Arg

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Lys Thr Ala Leu Ser Ala Phe Val Ala Ala Thr Gly Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Glu

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Tyr Ser Phe Ala Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu Val Leu Met Leu Gly Ala Arg Phe

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305 310 315 320

Asp Val Gly Gly Thr Ile Glu Ala Leu Ala Gln Ala Thr Ala Gln Asp Ala Ala Trp Pro

325 330 335 340

Asp Arg Gly Asp Trp Cys Ala Lys Val Thr Asp Leu Ala Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ile

345 350 355 360

Ala Ala Lys Ser Ser Ser Glu His Ala Leu His Pro Phe His Ala Ser Gln Val Ile Ala

365 370 375 380

Lys His Val Asp Ala Gly Val Thr Val Val Ala Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Leu Trp Leu

385 390 395 400

Ser Glu Val Met Ser Arg Val Lys Pro Gly Gly Phe Leu Cys His Gly Tyr Leu Asn Ser

405 410 415 420

Met Gly Val Gly Phe Gly Thr Ala Leu Gly Ala Gln Val Ala Asp Leu Glu Ala Gly Arg

425 430 435 440

Arg Thr Ile Leu Val Thr Gly Asp Gly Ser Val Gly Tyr Ser Ile Gly Glu Phe Asp Thr

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Leu Val Arg Lys Gln Leu Pro Leu Ile Val Ile Ile Met Asn Asn Gln Ser Trp Gly Trp

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Asn Gly Ser Tyr His Gly Val Ala Ala Ala Phe Gly Ala Asp Gly Tyr His Val Asp Ser

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Val Glu Ser Phe Ser Ala Ala Leu Ala Gln Ala Leu Ala His Asn Arg Pro Ala Cys Ile

525 530 535 540

Asn Val Ala Val Ala Leu Asp Pro Ile Pro Pro Glu Glu Leu Ile Leu Ile Gly Met Asp

545 550 555 560

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565 570 575

<210> 5

<211> 575

<212> PRT

<213> （4号FLS突变体蛋白）

<400> 5

Met Ala Met Ile Thr Gly Gly Glu Leu Val Val Arg Thr Leu Ile Lys Ala Gly Val Glu

1 5 10 15 20

His Leu Phe Gly Leu His Gly Thr His Ile Asp Thr Ile Phe Gln Ala Cys Leu Asp His

25 30 35 40

Asp Val Pro Ile Ile Asp Thr Arg His Glu Ala Ala Ala Gly His Ala Ala Glu Gly Tyr

45 50 55 60

Ala Arg Ala Gly Ala Lys Leu Gly Val Ala Leu Val Thr Ala Gly Gly Gly Phe Thr Asn

65 70 75 80

Ala Val Thr Pro Ile Ala Asn Ala Arg Thr Asp Arg Thr Pro Val Leu Phe Leu Thr Gly

85 90 95 100

Ser Gly Ala Leu Arg Asp Asp Glu Thr Asn Thr Leu Gln Ala Gly Ile Asp Gln Val Ala

105 110 115 120

Met Ala Ala Pro Ile Thr Lys Trp Ala His Arg Val Met Ala Thr Glu His Ile Pro Arg

125 130 135 140

Leu Val Met Gln Ala Ile Arg Ala Ala Leu Ser Ala Pro Arg Gly Pro Val Leu Leu Asp

145 150 155 160

Leu Pro Trp Asp Ile Leu Met Asn Gln Ile Asp Glu Asp Ser Val Ile Ile Pro Asp Leu

165 170 175 180

Val Leu Ser Ala His Gly Ala His Pro Asp Pro Ala Asp Leu Asp Gln Ala Leu Ala Leu

185 190 195 200

Leu Arg Lys Ala Glu Arg Pro Val Ile Val Leu Gly Ser Glu Ala Ser Arg Thr Ala Arg

205 210 215 220

Lys Thr Ala Leu Ser Ala Phe Val Ala Ala Thr Gly Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Glu

225 230 235 240

Gly Leu Ser Met Leu Ser Gly Leu Pro Asp Ala Met Arg Gly Gly Leu Val Gln Asn Leu

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Tyr Ser Phe Ala Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu Val Leu Met Leu Gly Ala Arg Phe

265 270 275 280

Gly Leu Asn Thr Gly His Gly Ser Gly Gln Leu Ile Pro His Ser Ala Gln Val Ile Gln

285 290 295 300

Val Asp Pro Asp Ala Cys Glu Leu Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ala Leu Gly Ile Val Ala

305 310 315 320

Asp Val Gly Gly Thr Ile Glu Ala Leu Ala Gln Ala Thr Ala Gln Asp Ala Ala Trp Pro

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Asp Arg Gly Asp Trp Cys Ala Lys Val Thr Asp Leu Ala Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ile

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Ala Ala Lys Ser Ser Ser Glu His Ala Leu His Pro Phe His Ala Ser Gln Val Ile Ala

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Lys His Val Asp Ala Gly Val Thr Val Val Ala Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Leu Trp Leu

385 390 395 400

Ser Glu Val Met Ser Arg Val Lys Pro Gly Gly Phe Leu Cys His Gly Tyr Leu Asn Ser

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Met Gly Val Gly Phe Gly Thr Ala Leu Gly Ala Gln Val Ala Asp Leu Glu Ala Gly Arg

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Arg Thr Ile Leu Val Thr Gly Asp Gly Ser Val Gly Tyr Ser Ile Gly Glu Phe Asp Thr

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Leu Val Arg Lys Gln Leu Pro Leu Ile Val Ile Ile Met Asn Asn Gln Ser Trp Gly Phe

465 470 475 480

Ser Leu His Phe Gln Gln Leu Ala Val Gly Pro Asn Arg Val Thr Gly Thr Arg Leu Glu

485 490 495 500

Asn Gly Ser Tyr His Gly Val Ala Ala Ala Phe Gly Ala Asp Gly Tyr His Val Asp Ser

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Val Glu Ser Phe Ser Ala Ala Leu Ala Gln Ala Leu Ala His Asn Arg Pro Ala Cys Ile

525 530 535 540

Asn Val Ala Val Ala Leu Asp Pro Ile Pro Pro Glu Glu Leu Ile Leu Ile Gly Met Asp

545 550 555 560

Pro Phe Ala Gly Ser Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ala

565 570 575

<210> 6

<211> 1725

<212> DNA

<213> （编码野生型FLS的核苷酸分子）

<400> 6

atggctatga ttactggtgg tgaactggtt gttcgtaccc tgattaaagc tggcgtagaa 60

catctgtttg gcctgcatgg cattcatatt gacaccattt ttcaggcttg cctggaccac 120

gacgtcccaa tcattgatac tcgccacgaa gcggcggcag gccacgctgc ggaaggttat 180

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ctgccatggg acatcctgat gaaccaaatc gatgaagatt ccgttatcat cccagacctg 540

gtgctgtctg ctcacggtgc ccatccagac ccggctgacc tggaccaggc tctggcactg 600

ctgcgtaaag ccgaacgccc agttatcgta ctgggctccg aggcgtcccg caccgcacgc 660

aagaccgcac tgagcgcatt cgtagcggcg accggtgtac cggttttcgc tgactatgaa 720

ggcctgtcca tgctgagcgg cctgccggac gctatgcgtg gcggcctggt gcagaacctg 780

tactcctttg caaaagctga tgcagctccg gacctggtac tgatgctggg tgctcgtttc 840

ggtctgaaca ccggtcatgg ttccggtcaa ctgatcccgc attctgctca ggtgatccag 900

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gatgtaggtg gcaccattga agcgctggct caggcgaccg cacaggacgc cgcgtggccg 1020

gaccgcggcg actggtgcgc caaggtaact gacctggccc aggagcgtta cgcttccatc 1080

gcggctaaat ccagctctga acatgcgctg cacccgttcc acgcttctca ggttatcgcg 1140

aaacacgtgg acgcaggcgt gaccgtcgtt gcggatggtg gcctgactta tctgtggctg 1200

tccgaagtta tgtctcgtgt caaaccaggc ggcttcctgt gccacggcta tctgaacagc 1260

atgggtgtag gcttcggtac tgccctgggt gcgcaggttg cggatctgga ggcaggtcgt 1320

cgtaccatcc tggtgaccgg cgacggctct gttggttatt ccattggcga attcgacacc 1380

ctggtacgca aacagctgcc gctgattgta attatcatga acaaccagtc ttggggctgg 1440

accctgcact ttcagcagct ggccgttggt cctaaccgtg tcaccggcac ccgcctggaa 1500

aatggttcct atcacggcgt tgctgcggca ttcggtgctg atggttacca cgtcgactct 1560

gtcgagagct tcagcgccgc tctggctcag gcactggcac acaaccgccc ggcatgcatc 1620

aacgttgctg tggccctgga cccgatcccg ccggaggaac tgatcctgat tggcatggac 1680

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<210> 7

<211> 1725

<212> DNA

<213> （编码1号FLS突变体的核苷酸分子）

<400> 7

atggctatga ttactggtgg tgaactggtt gttcgtaccc tgattaaagc tggcgtagaa 60

catctgtttg gcctgcatgg cattcatatt gacaccattt ttcaggcttg cctggaccac 120

gacgtcccaa tcattgatac tcgccacgaa gcggcggcag gccacgctgc ggaaggttat 180

gcccgcgcgg gcgctaaact gggtgttgcc ctggtgaccg ctggcggtgg ctttaccaat 240

gccgttacgc cgatcgcgaa cgctcggacc gatcgcactc cggttctgtt cctgaccggt 300

tctggtgctc ttcgtgatga cgaaaccaac accctgcagg ccggtattga tcaggtggcc 360

atggcggccc cgatcacgaa atgggctcat cgtgttatgg caactgaaca catcccgcgt 420

ctggttatgc aggccattcg tgccgctctg agcgccccac gtggcccggt gctgctggat 480

ctgccatggg acatcctgat gaaccaaatc gatgaagatt ccgttatcat cccagacctg 540

gtgctgtctg ctcacggtgc ccatccagac ccggctgacc tggaccaggc tctggcactg 600

ctgcgtaaag ccgaacgccc agttatcgta ctgggctccg aggcgtcccg caccgcacgc 660

aagaccgcac tgagcgcatt cgtagcggcg accggtgtac cggttttcgc tgactatgaa 720

ggcctgtcca tgctgagcgg cctgccggac gctatgcgtg gcggcctggt gcagaacctg 780

tactcctttg caaaagctga tgcagctccg gacctggtac tgatgctggg tgctcgtttc 840

ggtctgaaca ccggtcatgg ttccggtcaa ctgatcccgc attctgctca ggtgatccag 900

gtggatccag acgcgtgtga actgggtcgc ctgcaaggca tcgcgctggg tatcgtggct 960

gatgtaggtg gcaccattga agcgctggct caggcgaccg cacaggacgc cgcgtggccg 1020

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gcggctaaat ccagctctga acatgcgctg cacccgttcc acgcttctca ggttatcgcg 1140

aaacacgtgg acgcaggcgt gaccgtcgtt gcggatggtg gcctgactta tctgtggctg 1200

tccgaagtta tgtctcgtgt caaaccaggc ggcttcctgt gccacggcta tctgaacagc 1260

atgggtgtag gcttcggtac tgccctgggt gcgcaggttg cggatctgga ggcaggtcgt 1320

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accctgcacg cccagcagct ggccgttggt cctaaccgtg tcaccggcac ccgcctggaa 1500

aatggttcct atcacggcgt tgctgcggca ttcggtgctg atggttacca cgtcgactct 1560

gtcgagagct tcagcgccgc tctggctcag gcactggcac acaaccgccc ggcatgcatc 1620

aacgttgctg tggccctgga cccgatcccg ccggaggaac tgatcctgat tggcatggac 1680

ccgtttgcgg gctccacgga gaatctgtat ttccaatccg gcgcg 1725

<210> 8

<211> 1725

<212> DNA

<213> （编码2号FLS突变体的核苷酸分子）

<400> 8

atggctatga ttactggtgg tgaactggtt gttcgtaccc tgattaaagc tggcgtagaa 60

catctgtttg gcctgcatgg cattcatatt gacaccattt ttcaggcttg cctggaccac 120

gacgtcccaa tcattgatac tcgccacgaa gcggcggcag gccacgctgc ggaaggttat 180

gcccgcgcgg gcgctaaact gggtgttgcc ctggtgaccg ctggcggtgg ctttaccaat 240

gccgttacgc cgatcgcgaa cgctcggacc gatcgcactc cggttctgtt cctgaccggt 300

tctggtgctc ttcgtgatga cgaaaccaac accctgcagg ccggtattga tcaggtggcc 360

atggcggccc cgatcacgaa atgggctcat cgtgttatgg caactgaaca catcccgcgt 420

ctggttatgc aggccattcg tgccgctctg agcgccccac gtggcccggt gctgctggat 480

ctgccatggg acatcctgat gaaccaaatc gatgaagatt ccgttatcat cccagacctg 540

gtgctgtctg ctcacggtgc ccatccagac ccggctgacc tggaccaggc tctggcactg 600

ctgcgtaaag ccgaacgccc agttatcgta ctgggctccg aggcgtcccg caccgcacgc 660

aagaccgcac tgagcgcatt cgtagcggcg accggtgtac cggttttcgc tgactatgaa 720

ggcctgtcca tgctgagcgg cctgccggac gctatgcgtg gcggcctggt gcagaacctg 780

tactcctttg caaaagctga tgcagctccg gacctggtac tgatgctggg tgctcgtttc 840

ggtctgaaca ccggtcatgg ttccggtcaa ctgatcccgc attctgctca ggtgatccag 900

gtggatccag acgcgtgtga actgggtcgc ctgcaaggca tcgcgctggg tatcgtggct 960

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gaccgcggcg actggtgcgc caaggtaact gacctggccc aggagcgtta cgcttccatc 1080

gcggctaaat ccagctctga acatgcgctg cacccgttcc acgcttctca ggttatcgcg 1140

aaacacgtgg acgcaggcgt gaccgtcgtt gcggatggtg gcctgactta tctgtggctg 1200

tccgaagtta tgtctcgtgt caaaccaggc ggcttcctgt gccacggcta tctgaacagc 1260

atgggtgtag gcttcggtac tgccctgggt gcgcaggttg cggatctgga ggcaggtcgt 1320

cgtaccatcc tggtgaccgg cgacggctct gttggttatt ccattggcga attcgacacc 1380

ctggtacgca aacagctgcc gctgattgta attatcatga acaaccagtc ttggggctgg 1440

accgagcacg cccagcagct ggccgttggt cctaaccgtg tcaccggcac ccgcctggaa 1500

aatggttcct atcacggcgt tgctgcggca ttcggtgctg atggttacca cgtcgactct 1560

gtcgagagct tcagcgccgc tctggctcag gcactggcac acaaccgccc ggcatgcatc 1620

aacgttgctg tggccctgga cccgatcccg ccggaggaac tgatcctgat tggcatggac 1680

ccgtttgcgg gctccacgga gaatctgtat ttccaatccg gcgcg 1725

<210> 9

<211> 1725

<212> DNA

<213> （编码3号FLS突变体的核苷酸分子）

<400> 9

atggctatga ttactggtgg tgaactggtt gttcgtaccc tgattaaagc tggcgtagaa 60

catctgtttg gcctgcatgg cattcatatt gacaccattt ttcaggcttg cctggaccac 120

gacgtcccaa tcattgatac tcgccacgaa gcggcggcag gccacgctgc ggaaggttat 180

gcccgcgcgg gcgctaaact gggtgttgcc ctggtgaccg ctggcggtgg ctttaccaat 240

gccgttacgc cgatcgcgaa cgctcggacc gatcgcactc cggttctgtt cctgaccggt 300

tctggtgctc ttcgtgatga cgaaaccaac accctgcagg ccggtattga tcaggtggcc 360

atggcggccc cgatcacgaa atgggctcat cgtgttatgg caactgaaca catcccgcgt 420

ctggttatgc aggccattcg tgccgctctg agcgccccac gtggcccggt gctgctggat 480

ctgccatggg acatcctgat gaaccaaatc gatgaagatt ccgttatcat cccagacctg 540

gtgctgtctg ctcacggtgc ccatccagac ccggctgacc tggaccaggc tctggcactg 600

ctgcgtaaag ccgaacgccc agttatcgta ctgggctccg aggcgtcccg caccgcacgc 660

aagaccgcac tgagcgcatt cgtagcggcg accggtgtac cggttttcgc tgactatgaa 720

ggcctgtcca tgctgagcgg cctgccggac gctatgcgtg gcggcctggt gcagaacctg 780

tactcctttg caaaagctga tgcagctccg gacctggtac tgatgctggg tgctcgtttc 840

ggtctgaaca ccggtcatgg ttccggtcaa ctgatcccgc attctgctca ggtgatccag 900

gtggatccag acgcgtgtga actgggtcgc ctgcaaggca tcgcgctggg tatcgtggct 960

gatgtaggtg gcaccattga agcgctggct caggcgaccg cacaggacgc cgcgtggccg 1020

gaccgcggcg actggtgcgc caaggtaact gacctggccc aggagcgtta cgcttccatc 1080

gcggctaaat ccagctctga acatgcgctg cacccgttcc acgcttctca ggttatcgcg 1140

aaacacgtgg acgcaggcgt gaccgtcgtt gcggatggtg gcctgactta tctgtggctg 1200

tccgaagtta tgtctcgtgt caaaccaggc ggcttcctgt gccacggcta tctgaacagc 1260

atgggtgtag gcttcggtac tgccctgggt gcgcaggttg cggatctgga ggcaggtcgt 1320

cgtaccatcc tggtgaccgg cgacggctct gttggttatt ccattggcga attcgacacc 1380

ctggtacgca aacagctgcc gctgattgta attatcatga acaaccagtc ttggggctgg 1440

accgaggtct ttttccagct ggccgttggt cctaaccgtg tcaccggcac ccgcctggaa 1500

aatggttcct atcacggcgt tgctgcggca ttcggtgctg atggttacca cgtcgactct 1560

gtcgagagct tcagcgccgc tctggctcag gcactggcac acaaccgccc ggcatgcatc 1620

aacgttgctg tggccctgga cccgatcccg ccggaggaac tgatcctgat tggcatggac 1680

ccgtttgcgg gctccacgga gaatctgtat ttccaatccg gcgcg 1725

<210> 10

<211> 1725

<212> DNA

<213> （编码4号FLS突变体的核苷酸分子）

<400> 10

atggctatga ttactggtgg tgaactggtt gttcgtaccc tgattaaagc tggcgtagaa 60

catctgtttg gcctgcatgg cactcatatt gacaccattt ttcaggcttg cctggaccac 120

gacgtcccaa tcattgatac tcgccacgaa gcggcggcag gccacgctgc ggaaggttat 180

gcccgcgcgg gcgctaaact gggtgttgcc ctggtgaccg ctggcggtgg ctttaccaat 240

gccgttacgc cgatcgcgaa cgctcggacc gatcgcactc cggttctgtt cctgaccggt 300

tctggtgctc ttcgtgatga cgaaaccaac accctgcagg ccggtattga tcaggtggcc 360

atggcggccc cgatcacgaa atgggctcat cgtgttatgg caactgaaca catcccgcgt 420

ctggttatgc aggccattcg tgccgctctg agcgccccac gtggcccggt gctgctggat 480

ctgccatggg acatcctgat gaaccaaatc gatgaagatt ccgttatcat cccagacctg 540

gtgctgtctg ctcacggtgc ccatccagac ccggctgacc tggaccaggc tctggcactg 600

ctgcgtaaag ccgaacgccc agttatcgta ctgggctccg aggcgtcccg caccgcacgc 660

aagaccgcac tgagcgcatt cgtagcggcg accggtgtac cggttttcgc tgactatgaa 720

ggcctgtcca tgctgagcgg cctgccggac gctatgcgtg gcggcctggt gcagaacctg 780

tactcctttg caaaagctga tgcagctccg gacctggtac tgatgctggg tgctcgtttc 840

ggtctgaaca ccggtcatgg ttccggtcaa ctgatcccgc attctgctca ggtgatccag 900

gtggatccag acgcgtgtga actgggtcgc ctgcaaggca tcgcgctggg tatcgtggct 960

gatgtaggtg gcaccattga agcgctggct caggcgaccg cacaggacgc cgcgtggccg 1020

gaccgcggcg actggtgcgc caaggtaact gacctggccc aggagcgtta cgcttccatc 1080

gcggctaaat ccagctctga acatgcgctg cacccgttcc acgcttctca ggttatcgcg 1140

aaacacgtgg acgcaggcgt gaccgtcgtt gcggatggtg gcctgactta tctgtggctg 1200

tccgaagtta tgtctcgtgt caaaccaggc ggcttcctgt gccacggcta tctgaacagc 1260

atgggtgtag gcttcggtac tgccctgggt gcgcaggttg cggatctgga ggcaggtcgt 1320

cgtaccatcc tggtgaccgg cgacggctct gttggttatt ccattggcga attcgacacc 1380

ctggtacgca aacagctgcc gctgattgta attatcatga acaaccagtc ttggggcttt 1440

agcctgcact ttcagcagct ggccgttggt cctaaccgtg tcaccggcac ccgcctggaa 1500

aatggttcct atcacggcgt tgctgcggca ttcggtgctg atggttacca cgtcgactct 1560

gtcgagagct tcagcgccgc tctggctcag gcactggcac acaaccgccc ggcatgcatc 1620

aacgttgctg tggccctgga cccgatcccg ccggaggaac tgatcctgat tggcatggac 1680

ccgtttgcgg gctccacgga gaatctgtat ttccaatccg gcgcg 1725

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> （Hind Ⅲ引物）

<400> 11

atggctatga ttactggtgg tgaactggtt g 31

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> （XhoⅠ引物）

<400> 12

cgcgccggat tggaaataca gattctcc 28

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> （引物I28T -F）

<400> 13

gcatggcact catattgaca ccatttttca ggcttg 36

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> （引物I28T -R）

<400> 14

tggtgtcaat atgagtgcca tgcaggccaa ac 32

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物W480F -F）

<400> 15

ttggggcttt accctgcact ttcagcag 28

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> （引物W480F -R）

<400> 16

agtgcagggt aaagccccaa gactggttg 29

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物T481S -F）

<400> 17

gggctggagc ctgcactttc agcagctg 28

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物T481S -R）

<400> 18

gaaagtgcag gctccagccc caagactg 28

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物L482E -F）

<400> 19

ctggacccga gactttcagc agctggcc 28

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物L482E -R）

<400> 20

ggccagctgc tgaaagtgct cggtccag 28

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物H483V -F）

<400> 21

gaccctggtc tttcagcagc tggccgtt 28

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> （引物H483V -R）

<400> 22

ccaacggcca gctgctgaaa gaccagggtc c 31

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物F484A -F）

<400> 23

cctgcacgcc cagcagctgg ccgttggt 28

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物F484A -R）

<400> 24

ccagctgctg ggcgtgcagg gtccagcc 28

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物Q485F -F）

<400> 25

gcactttttc cagctggccg ttggtcct 28

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物Q485F -R）

<400> 26

aggaccaacg gccagctgga aaaagtgc 28

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物W480F+ T481S -F）

<400> 27

gggctttagc ctgcactttc agcagctg 28

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物W480F+ T481S -R）

<400> 28

gaaagtgcag gctaaagccc caagactg 28

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物L482E + F484A -F）

<400> 29

ctggaccgag cacgcccagc agctggcc 28

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物L482E + F484A -R）

<400> 30

ggccagctgc tgggcgtgct cggtccag 28

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物L482E + H483V -F）

<400> 31

ctggaccgag gtctttcagc agctggcc 28

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物L482E + H483V -R）

<400> 32

ggccagctgc tgaaagacct gggtccag 28

<210> 33

<211> 32

<212> DNA

<213> （引物L482E+H483V+Q485F -F）

<400> 33

ctggaccgag gtctttttcc agctggccgt tg 32

<210> 34

<211> 32

<212> DNA

<213> （引物L482E+H483V+Q485F -R）

<400> 34

caacggccag ctggaaaaag acctcggtcc ag 32

<210> 35

<211> 563

<212> PRT

<213> （野生荧光假单胞菌苯甲醛裂解酶的氨基酸序列）

<400> 35

Met Ala Met Ile Thr Gly Gly Glu Leu Val Val Arg Thr Leu Ile Lys Ala Gly Val Glu

1 5 10 15 20

His Leu Phe Gly Leu His Gly Ala His Ile Asp Thr Ile Phe Gln Ala Cys Leu Asp His

25 30 35 40

Asp Val Pro Ile Ile Asp Thr Arg His Glu Ala Ala Ala Gly His Ala Ala Glu Gly Tyr

45 50 55 60

Ala Arg Ala Gly Ala Lys Leu Gly Val Ala Leu Val Thr Ala Gly Gly Gly Phe Thr Asn

65 70 75 80

Ala Val Thr Pro Ile Ala Asn Ala Trp Leu Asp Arg Thr Pro Val Leu Phe Leu Thr Gly

85 90 95 100

Ser Gly Ala Leu Arg Asp Asp Glu Thr Asn Thr Leu Gln Ala Gly Ile Asp Gln Val Ala

105 110 115 120

Met Ala Ala Pro Ile Thr Lys Trp Ala His Arg Val Met Ala Thr Glu His Ile Pro Arg

125 130 135 140

Leu Val Met Gln Ala Ile Arg Ala Ala Leu Ser Ala Pro Arg Gly Pro Val Leu Leu Asp

145 150 155 160

Leu Pro Trp Asp Ile Leu Met Asn Gln Ile Asp Glu Asp Ser Val Ile Ile Pro Asp Leu

165 170 175 180

Val Leu Ser Ala His Gly Ala Arg Pro Asp Pro Ala Asp Leu Asp Gln Ala Leu Ala Leu

185 190 195 200

Leu Arg Lys Ala Glu Arg Pro Val Ile Val Leu Gly Ser Glu Ala Ser Arg Thr Ala Arg

205 210 215 220

Lys Thr Ala Leu Ser Ala Phe Val Ala Ala Thr Gly Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Glu

225 230 235 240

Gly Leu Ser Met Leu Ser Gly Leu Pro Asp Ala Met Arg Gly Gly Leu Val Gln Asn Leu

245 250 255 260

Tyr Ser Phe Ala Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu Val Leu Met Leu Gly Ala Arg Phe

265 270 275 280

Gly Leu Asn Thr Gly His Gly Ser Gly Gln Leu Ile Pro His Ser Ala Gln Val Ile Gln

285 290 295 300

Val Asp Pro Asp Ala Cys Glu Leu Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ala Leu Gly Ile Val Ala

305 310 315 320

Asp Val Gly Gly Thr Ile Glu Ala Leu Ala Gln Ala Thr Ala Gln Asp Ala Ala Trp Pro

325 330 335 340

Asp Arg Gly Asp Trp Cys Ala Lys Val Thr Asp Leu Ala Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ile

345 350 355 360

Ala Ala Lys Ser Ser Ser Glu His Ala Leu His Pro Phe His Ala Ser Gln Val Ile Ala

365 370 375 380

Lys His Val Asp Ala Gly Val Thr Val Val Ala Asp Gly Ala Leu Thr Tyr Leu Trp Leu

385 390 395 400

Ser Glu Val Met Ser Arg Val Lys Pro Gly Gly Phe Leu Cys His Gly Tyr Leu Gly Ser

405 410 415 420

Met Gly Val Gly Phe Gly Thr Ala Leu Gly Ala Gln Val Ala Asp Leu Glu Ala Gly Arg

425 430 435 440

Arg Thr Ile Leu Val Thr Gly Asp Gly Ser Val Gly Tyr Ser Ile Gly Glu Phe Asp Thr

445 450 455 460

Leu Val Arg Lys Gln Leu Pro Leu Ile Val Ile Ile Met Asn Asn Gln Ser Trp Gly Ala

465 470 475 480

Thr Leu His Phe Gln Gln Leu Ala Val Gly Pro Asn Arg Val Thr Gly Thr Arg Leu Glu

485 490 495 500

Asn Gly Ser Tyr His Gly Val Ala Ala Ala Phe Gly Ala Asp Gly Tyr His Val Asp Ser

505 510 515 520

Val Glu Ser Phe Ser Ala Ala Leu Ala Gln Ala Leu Ala His Asn Arg Pro Ala Cys Ile

525 530 535 540

Asn Val Ala Val Ala Leu Asp Pro Ile Pro Pro Glu Glu Leu Ile Leu Ile Gly Met Asp

545 550 555 560

Pro Phe Ala

563

<210> 36

<211> 1692

<212> DNA

<213> （野生荧光假单胞菌苯甲醛裂解酶基因bznB的核苷酸分子）

<400> 36

atggcgatga ttacaggcgg cgaactggtt gttcgcaccc taataaaggc tggggtcgaa 60

catctgttcg gcctgcacgg cgcgcatatc gatacgattt ttcaagcctg tctcgatcat 120

gatgtgccga tcatcgacac ccgccatgag gccgccgcag ggcatgcggc cgagggctat 180

gcccgcgctg gcgccaagct gggcgtggcg ctggtcacgg cgggcggggg atttaccaat 240

gcggtcacgc ccattgccaa cgcttggctg gatcgcacgc cggtgctctt cctcaccgga 300

tcgggcgcgc tgcgtgatga tgaaaccaac acgttgcagg cggggattga tcaggtcgcc 360

atggcggcgc ccattaccaa atgggcgcat cgggtgatgg caaccgagca tatcccacgg 420

ctggtgatgc aggcgatccg cgccgcgttg agcgcgccac gcgggccggt gttgctggat 480

ctgccgtggg atattctgat gaaccagatt gatgaggata gcgtcattat ccccgatctg 540

gtcttgtccg cgcatggggc cagacccgac cctgccgatc tggatcaggc tctcgcgctt 600

ttgcgcaagg cggagcggcc ggtcatcgtg ctcggctcag aagcctcgcg gacagcgcgc 660

aagacggcgc ttagcgcctt cgtggcggcg actggcgtgc cggtgtttgc cgattatgaa 720

gggctaagca tgctctcggg gctgcccgat gctatgcggg gcgggctggt gcaaaacctc 780

tattcttttg ccaaagccga tgccgcgcca gatctcgtgc tgatgctggg ggcgcgcttt 840

ggccttaaca ccgggcatgg atctgggcag ttgatccccc atagcgcgca ggtcattcag 900

gtcgaccctg atgcctgcga gctgggacgc ctgcagggca tcgctctggg cattgtggcc 960

gatgtgggtg ggaccatcga ggctttggcg caggccaccg cgcaagatgc ggcttggccg 1020

gatcgcggcg actggtgcgc caaagtgacg gatctggcgc aagagcgcta tgccagcatc 1080

gctgcgaaat cgagcagcga gcatgcgctc cacccctttc acgcctcgca ggtcattgcc 1140

aaacacgtcg atgcaggggt gacggtggta gcggatggtg cgctgaccta tctctggctg 1200

tccgaagtga tgagccgcgt gaaacccggc ggttttctct gccacggcta tctaggctcg 1260

atgggcgtgg gcttcggcac ggcgctgggc gcgcaagtgg ccgatcttga agcaggccgc 1320

cgcacgatcc ttgtgaccgg cgatggctcg gtgggctata gcatcggtga atttgatacg 1380

ctggtgcgca aacaattgcc gctgatcgtc atcatcatga acaaccaaag ctggggggcg 1440

acattgcatt tccagcaatt ggccgtcggc cccaatcgcg tgacgggcac ccgtttggaa 1500

aatggctcct atcacggggt ggccgccgcc tttggcgcgg atggctatca tgtcgacagt 1560

gtggagagct tttctgcggc tctggcccaa gcgctcgccc ataatcgccc cgcctgcatc 1620

aatgtcgcgg tcgcgctcga tccgatcccg cccgaagaac tcattctgat cggcatggac 1680

cccttcgcat ga 1692

Claims

1.一种甲醛裂合酶的突变体蛋白，其特征在于，所述突变体蛋白为1号FLS突变体蛋白，其序列由原FLS的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第484位Phe突变为Ala构成。

2.根据权利要求1所述的甲醛裂合酶的突变体蛋白，其特征在于，所述1号FLS突变体蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种甲醛裂合酶的突变体蛋白，其特征在于，所述突变体蛋白为如权利要求1或2所述的FLS突变体蛋白的N端或C端连接标签得到的融合蛋白；所述标签包括His标签和/或SUMO标签。

4.根据权利要求3所述的甲醛裂合酶的突变体蛋白，其特征在于，所述突变体蛋白为由1号FLS突变体蛋白的N端或C端连接 His标签或SUMO标签得到的融合蛋白。

5.一种编码权利要求1-4中任意一项所述的突变体蛋白的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子为编码1号FLS突变体蛋白的核苷酸分子，其序列由编码原FLS的如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列从5´端到3´端方向的第1450位T突变为G、第1451位T突变为C、第1452位T突变为C构成。

6.根据权利要求5所述的核苷酸分子，所述编码FLS突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

7.根据权利要求5或6所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子为如下DNA分子：

（a1）编码区包括如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的DNA分子；

（a2）核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的DNA分子。

8.一种含有权利要求5-7中任意一项所述的核苷酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

9.如权利要求1-4中任意一项所述的突变体蛋白或由权利要求5-7中任意一项所述的核苷酸分子或如权利要求8所述的表达盒、重组载体或重组微生物制得的突变体蛋白在催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括催化甲醛合成DHA、提高催化合成DHA产量和提高FLS催化效率。