CN114058601A - 具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶，其为乙醇脱氢酶GOX1067、乙醇脱氢酶GOX1068、乙醛脱氢酶GOX2018和乙醇脱氢酶GOX0313中的一种或几种。本发明还涉及上述酶在以乙醇醛或甲醛或CO₂为底物合成乙二醇途径中的应用。与现有技术相比，本发明所提供的具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶可以快速合成大量的乙二醇，实现了双酶将甲醛转化为乙二醇，开辟了以CO₂为原料合成乙二醇的新途径。该发明为CO₂合成高附加值化合物途径提供了新思路，为实现碳中和开辟新的生物化学途径，具有潜在的应用前景。

Description

具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶及其应用

技术领域

本发明属于酶的定向进化改造和生物催化应用技术领域，涉及具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶及其应用。

背景技术

乙二醇又名甘醇、1，2-亚乙基二醇，是最简单的二元醇，是一种重要的有机化工原料，广泛应用于生产聚酯、醇酸树脂、润滑剂、油漆、胶粘剂、表面光活性剂等领域。乙二醇可被生物降解，其聚合物也具有生物可降解性，以乙二醇为单体合成聚合物解决了传统塑料制品存在的难以降解的问题。

目前乙二醇制备方法主要有以下几种：(1)催化水合法：以环氧乙烷和水为底物，在催化剂和一定温度、压力条件下合成。此法工艺流程长、设备复杂、耗能高。(2)碳酸乙烯酯法：首先利用催化剂将CO2和环氧乙烷反应生产碳酸乙烯酯，然后通过水解得到乙二醇，选择性高但耗能高、条件苛刻。(3)合成气法：通过高温高压和贵金属催化剂作用合成乙二醇，条件苛刻。在专利(CN102649686A)中公开了以草酸酯和氢气为原料，以贵金属为催化剂先合成乙醇酸酯再水解得到乙二醇的方法，提高了乙二醇的选择性。

目前，通过酶法合成乙二醇的方法少有报道。以CO₂为原料，通过多酶级联合成乙二醇的途径也几乎没有报道。开发一个绿色高效的乙二醇合成途径是一直以来需要解决而由尚未解决的难题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对制备乙二醇的方法条件苛刻，对环境污染大，酶法合成乙二醇方法几乎没有报道等问题，提供了具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶，所述酶能够催化乙醇醛快速合成大量的乙二醇。本发明还提供了上述酶在以乙醇醛或甲醛或CO₂为底物多酶级联反应合成乙二醇途径中的应用，实现了双酶将甲醛转化为乙二醇，开辟了以CO₂为原料合成乙二醇的新途径。

为此，本发明第一方面提供了一种具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶，其为乙醇脱氢酶GOX1067、乙醇脱氢酶GOX1068、乙醛脱氢酶GOX2018和乙醇脱氢酶GOX0313中的一种或几种。

所述乙醇脱氢酶GOX1067、乙醇脱氢酶GOX1068、乙醛脱氢酶GOX2018和乙醇脱氢酶GOX0313均来源于氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans 621H。

根据本发明的一些实施方式，所述乙醇脱氢酶GOX1067为以下GOX1067蛋白质中的任一种：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一种蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

本发明中，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的乙醇脱氢酶GOX1067为野生乙醇脱氢酶GOX1067，其基因来源于氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans 621H(GenBank登录号：AAW60836.1)，在不改变GOX1067氨基酸序列的前提下，将其基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其核苷酸序列为SEQ ID No.5，亦即，经密码子优化的编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的GOX1067蛋白(野生乙醇脱氢酶GOX1067)的基因GOX1067的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示。

根据本发明的另一些实施方式，所述乙醇脱氢酶GOX1068为以下GOX1068蛋白质中的任一种：

(B1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

(B2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(B3)与(B1)或(B2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(B4)在(B1)-(B3)中任一种蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

本发明中，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的乙醇脱氢酶GOX1068为野生乙醇脱氢酶GOX1068，其基因来源于氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans 621H(GenBank登录号：AAW60837.1)，在不改变GOX1068氨基酸序列的前提下，将其基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其核苷酸序列为SEQ ID No.6，亦即，经密码子优化的编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的GOX1068蛋白(野生乙醇脱氢酶GOX1068)的基因GOX1068的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。

根据本发明的又一些实施方式，所述乙醛脱氢酶GOX2018为以下GOX2018蛋白质中的任一种：

(C1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；

(C2)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(C3)与(C1)或(C2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(C4)在(C1)-(C3)中任一种蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

本发明中，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的乙醛脱氢酶GOX2018为野生乙醇脱氢酶GOX2018，其基因来源于氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans 621H(GenBank登录号：AAW61754.1)，在不改变GOX2018氨基酸序列的前提下，将其基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后GOX2018基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其核苷酸序列为SEQ ID No.7，亦即，经密码子优化的编码氨基酸序列如SEQID No.3所示的GOX2018蛋白(野生乙醇脱氢酶GOX2018)的基因GOX2018的核苷酸序列如SEQID No.7所示。

根据本发明的有一些实施方式，所述乙醇脱氢酶GOX0313为以下GOX0313蛋白质中的任一种：

(D1)氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；

(D2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(D3)与(D1)或(D2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(D4)在(D1)-(D3)中任一种蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

本发明中，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的乙醇脱氢酶GOX0313为野生乙醇脱氢酶GOX0313，其基因来源于氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans 621H(GenBank登录号：AAW60096.1)，在不改变GOX2018氨基酸序列的前提下，将上述GOX0313基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后GOX0313基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其核苷酸序列为SEQ ID No.8，亦即，经密码子优化的编码氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的GOX0313蛋白(野生乙醇脱氢酶GOX0313)的基因GOX0313的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶的相关生物材料，其为能够表达所述GOX1067蛋白、GOX1068蛋白质、GOX2018蛋白质或GOX0313蛋白质的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

本发明中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述表达盒可由能够启动所述核酸分子转录的启动子，所述核酸分子，以及转录终止序列组成。

在本发明的一些实施例中，编码所述GOX1067蛋白的核酸分子具体地为以下任一所示：

(E1)编码区包括如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的DNA分子；

(E2)核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的DNA分子；

(E3)与(E1)或(E2)中所述的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码本发明第一方面中的所述的GOX1067蛋白质的DNA分子；

(E4)在严格条件下与(E1)或(E2)中所述的核苷酸序列杂交，且编码本发明第一方面中的所述的GOX1067蛋白质的DNA分子。

在本发明的一些实施例中，编码所述GOX1068蛋白的核酸分子具体地为以下任一所示：

(F1)编码区包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的DNA分子；

(F2)核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的DNA分子；

(F3)与(F1)或(F2)中所述的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码本发明第一方面中的所述的GOX1068蛋白质的DNA分子；

(F4)在严格条件下与(F1)或(F2)中所述的核苷酸序列杂交，且编码本发明第一方面中的所述的GOX1068蛋白质的DNA分子。

在本发明的一些实施例中，编码所述GOX2018蛋白的核酸分子具体地为以下任一所示：

(G1)编码区包括如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的DNA分子；

(G2)核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的DNA分子；

(G3)与(G1)或(G2)中所述的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码本发明第一方面中的所述的GOX2018蛋白质的DNA分子；

(G4)在严格条件下与(G1)或(G2)中所述的核苷酸序列杂交，且编码本发明第一方面中的所述的GOX2018蛋白质的DNA分子。

在本发明的一些实施例中，编码所述GOX0313蛋白的核酸分子具体地为以下任一所示：

(H1)编码区包括如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的DNA分子；

(H2)核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的DNA分子；

(H3)与(H1)或(H2)中所述的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码本发明第一方面中的所述的GOX0313蛋白质的DNA分子；

(H4)在严格条件下与(H1)或(H2)中所述的核苷酸序列杂交，且编码本发明第一方面中的所述的GOX0313蛋白质的DNA分子。

本发明第三方面提供了一种以乙醇醛为底物合成乙二醇的方法，其包括利用具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶或相关生物材料，以乙醇醛为底物反应产生乙二醇；

所述具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶为如本发明第一方面所述述的酶；所述具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶的相关生物材料为本发明第二方面所述的相关生物材料；

优选地，所述合成乙二醇的反应温度为4-80℃。

本发明第四方面提供了一种以甲醛为底物多酶级联合成乙二醇的方法，其包括以下步骤：(1)利用乙醇醛合成酶GALS将甲醛转化为乙醇醛；(2)利用具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶或相关生物材料将乙醇醛转化为乙二醇；

所述具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶为如本发明第一方面所述述的酶；所述具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶的相关生物材料为本发明第二方面所述的相关生物材料；

优选地，所述合成乙二醇的反应温度为4-80℃。

本发明第五方面提供了一种以CO₂为底物多酶级联合成乙二醇的方法，其包括以下步骤：(1)利用多酶将CO₂转化为甲醛；(2)利用乙醇醛合成酶GALS将甲醛转化为乙醇醛；(3)利用具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶或相关生物材料将乙醇醛转化为乙二醇；

所述具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶为如本发明第一方面所述述的酶；所述具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶的相关生物材料为本发明第二方面所述的相关生物材料；

优选地，所述合成乙二醇的反应温度为4-80℃。

本发明所述用语“TPP”是指焦磷酸硫胺素，“NADH”是指还原型辅酶Ⅰ，“PQQ”是指吡咯喹啉醌。

本发明中所述用语“酶活力”(enzymeactivity)也称酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力；本发明中酶活力以比活力表示，是指每g酶蛋白所具有的酶活力，单位为U/g。

本发明中所述“野生型”是指由野生菌发酵培养获得的酶蛋白，以及氨基酸或碱基序列未进行改变所翻译表达得到的酶蛋白。

本发明中所述用语“蛋白”与“蛋白质”可以互相使用

本发明中所述用语“野生”与“野生型”可以互相使用

本发明中的检测方法及仪器：

(1)采用10mL规格镍琼脂糖凝胶FF亲和层析柱填料预装柱(中国bersee)进行蛋白纯化。

(2)采用HPLC U3000型高效液相色谱仪(Thermo Fisher Scientific)测定产物。

(3)采用870型酶标仪(Thermo Fisher Scientific)进行纯化后蛋白质浓度测定。

本发明提供了一种具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶，该酶为来源于氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans 621H的具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的乙醇脱氢酶GOX1067、乙醇脱氢酶GOX1068、乙醛脱氢酶GOX2018和乙醇脱氢酶GOX0313中的一种或几种。本发明还提供了该酶在以乙醇醛或甲醛或CO₂为底物合成乙二醇途径中的应用。与现有技术相比，本发明所提供的具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶可以快速合成大量的乙二醇，实现了双酶将甲醛转化为乙二醇，开辟了以CO₂为原料合成乙二醇的新途径。该发明为CO₂合成高附加值化合物途径提供了新思路，为实现碳中和开辟新的生物化学途径，具有潜在的应用前景。

附图说明

下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：

图1为4种酶的质粒图谱；其中，(a)为pET-22b-GOX1067质粒图谱；(b)为pET-22b-GOX1068质粒图谱；(c)为pET-22b-GOX2018质粒图谱；(d)为pET-22b-GOX0313质粒图谱。

图2示出酶催化反应体系的HPLC结果，其中产物乙醇酸出峰时间为15.4min左右。

图3示出4种酶催化乙醇醛合成乙二醇的比酶活。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将结合附图和实施例详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

实施例

以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明均可由商业渠道获得。

以下实施例中涉及到的培养基配方如下：

LB液体培养基：蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％；

LB固体培养基：琼脂1.5％、蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％；

培养基中的单位为％(W/V)。

实施例1：酶蛋白的获得

本发明中，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的乙醇脱氢酶GOX1067的基因来源于氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans 621H(GenBank登录号：AAW60836.1)，在不改变GOX1067氨基酸序列的前提下，将其基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其核苷酸序列为SEQID No.5。

本发明中，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的乙醇脱氢酶GOX1068的基因来源于氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans 621H(GenBank登录号：AAW60837.1)，在不改变GOX1068氨基酸序列的前提下，将其基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其核苷酸序列为SEQID No.6。

本发明中，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的乙醛脱氢酶GOX2018的基因来源于氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans 621H(GenBank登录号：AAW61754.1)，在不改变GOX2018氨基酸序列的前提下，将其基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后GOX2018基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其核苷酸序列为SEQ ID No.7。

本发明中，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的乙醇脱氢酶GOX0313的基因来源于氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans 621H(GenBank登录号：AAW60096.1)，在不改变GOX2018氨基酸序列的前提下，将上述GOX0313基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后GOX0313基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其核苷酸序列为SEQ ID No.8。

实施例2：表达载体的构建

将SEQ ID No.5所示的优化后GOX1067基因替换pET-22b载体(Novagen，Amp，见图1a)酶切位点NdeI和XhoI之间的DNA片段，得到重组质粒，命名为pET-22b-GOX1067。

将SEQ ID No.6所示的优化后GOX1068基因替换pET-22b载体(Novagen，Amp，见图1b)酶切位点NdeI和XhoI之间的DNA片段，得到重组质粒，命名为pET-22b-GOX1068。

将SEQ ID No.7所示的优化后GOX2018基因替换pET-22b载体(Novagen，Amp，见图1c)酶切位点NdeI和XhoI之间的DNA片段，得到重组质粒，命名为pET-22b-GOX2018。

将SEQ ID No.8所示的优化后GOX0313基因替换pET-22b载体(Novagen，Amp，见图1d)酶切位点NdeI和XhoI之间的DNA片段，得到重组质粒，命名为pET-22b-GOX0313。

实施例3：酶蛋白的表达

(1)将大肠杆菌表达型重组质粒pET-22b-GOX1067、pET-22b-GOX1068、pET-22b-GOX2018和pET-22b-GOX0313分别转入E.coli BL21(DE3)(TransGen)中，获得重组菌。采用氨苄抗性平板进行阳性克隆筛选(Amp，100mg/mL)，37℃过夜培养；

(2)将挑单克隆至4mL LB液体培养基中(Amp，100mg/mL)，在37℃、180rpm的恒温培养箱中培养12-16h；

(3)将步骤(2)培养的菌液接菌到50mL LB液体培养基中(Amp，100mg/mL)，在37℃、150rpm的恒温培养箱中培养至OD600为0.6-0.8后，加入IPTG诱导剂(终浓度为0.4mM)，在30℃、150rpm的恒温培养箱中诱导培养24h；

(4)培养结束，4℃、12000rpm离心10min收集菌体，加入10mL含有10mM咪唑和100mMNaCl的PBS溶液(0.05M，pH＝7.5)重悬菌体，超声破碎15min；

(5)细胞破碎后4℃、12000rpm离心20min，所得上清为实验所需粗酶液；

(6)粗酶液过镍琼脂糖凝胶FF亲和层析柱调料预装柱纯化得到纯化酶1；使用30KDa的超滤膜超滤纯化溶液1得到最终纯化酶液，使用SDS凝胶电泳验证蛋白表达正确；

(7)使用G250考马斯亮蓝与酶液进行反应，然后使用870型酶标仪(Thermo FisherScientific)检测595nm的吸光度，从而计算蛋白浓度。

实施例4：酶活测定

反应体系：20mM乙醇醛，20mM辅酶(NADH或PQQ)，上述具有催化乙醇醛合成乙二醇的酶100μg，反应体系总体积为1mL，缓冲液为0.05M，pH＝8.0的PBS。30～50℃中反应1-6h后，利用HPLC检测产物乙二醇的生成量计算酶活。

HPLC检测乙二醇方法：带有示差检测器的U3000高效液相色谱仪，

HPX-87H有机酸柱子(BIO-RAD，300×7.8mm)，65℃，0.6mL/min，流动相为5mM硫酸。

1个酶活力单位定义为：在特定条件下，在1min内转化1μmol底物(甲醛)生成产物(乙二醇)的产量的酶量，故比酶活的计算公式为：

U/g＝(C_乙二醇(μmol)/(时间(min)))/蛋白质量(g)

使用HPLC检测产物乙二醇的生成，HPLC结果如图2所示，乙二醇的出峰时间为15.4min左右。

4种酶在45℃反应3h的比酶活如表1所示(图3)

表1 4种GOX的比活力

酶	比活力(U/g)
		GOX1067	723.8287
GOX1068	615.6123
		GOX2018	138.1179
GOX0313	812.6866

实施例5：催化乙醇醛合成乙二醇的应用

反应体系：20mM乙醇醛，20mM辅酶(NADH或PQQ)，上述具有催化乙醇醛合成乙二醇的酶100μg，反应体系总体积为1mL，缓冲液为0.05M，pH＝8.0的PBS。30～50℃中反应1-6h后，利用HPLC检测产物乙二醇的生成量计算酶活。

反应方程式如式(1)所示：

在反应体系中加入20mM乙醇醛，20mM NADH,100μgGOX0313蛋白，反应体系总体积为1mL，缓冲液为0.05M，pH＝8.0的PBS，45℃反应3h后，检测得到1.36g/L乙二醇。

实施例6：催化甲醛合成乙二醇的应用

反应体系：底物甲醛，无水硫酸镁，TPP,NADH，PQQ，上述具有催化乙醇醛合成乙二醇的酶，乙醇醛合成酶GLAS，反应体系总体积为1mL，缓冲液为0.05M，pH＝8.0的PBS。4～80℃中反应后，利用HPLC检测产物乙二醇的生成量计算酶活。

反应方程式(2)所示：

在反应体系中加入50mM甲醛，25mM NADH,2mM无水硫酸镁，0.1mM TPP，2mg乙醇醛合成酶GLAS，0.5mgGOX0313蛋白，反应体系总体积为1mL，缓冲液为0.05M，pH＝8.0的PBS，45℃反应6h后，检测得到0.78g/L乙二醇。

乙醇醛合成酶GALS基因由文献(该文献的DOI号：10.1038/s41467-019-09095)获得(基于该文献由华大基因合成获得)。

实施例7：催化CO₂合成乙二醇的应用

反应体系：底物碳酸氢钠，无水硫酸镁，TPP,NADH，PQQ，上述具有催化乙醇醛合成乙二醇的酶，乙醇醛合成酶GLAS，反应体系总体积为1mL，缓冲液为0.05M，pH＝8.0的PBS。4～80℃中反应后，利用HPLC检测产物乙二醇的生成量计算酶活。

反应方程式如式(3)所示：

在反应体系中加入50mM碳酸氢钠，25mM NADH,2mM无水硫酸镁，0.1mM TPP，1mg甲醛脱氢酶，1mg酰基辅酶A合成酶ecACS，1mg乙酰化乙醛脱氢酶ImACDH，2mg乙醇醛合成酶GLAS，0.5mgGOX蛋白，反应体系总体积为1mL，缓冲液为0.05M，pH＝8.0的PBS，45℃反应24h后，检测得到0.029g/L乙二醇。

乙醇醛合成酶GALS基因由文献(该文献的DOI号：10.1038/s41467-019-09095)获得(基于该文献由华大基因合成获得)。

酰基辅酶A合成酶ecACS和乙酰化乙醛脱氢酶ImACDH基因由文献(该文献的DOI号：10.1073/pnas.1500545112)获得(基于该文献由华大基因合成获得)。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶及其应用

<130> RB2102851-FF

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 478

<212> PRT

<213> （野生乙醇脱氢酶GOX1067）

<400> 1

Met Leu Asn Ala Leu Thr Arg Asp Arg Leu Val Ser Glu Met Lys Gln

1 5 10 15

Gly Trp Lys Leu Ala Ala Ala Ile Gly Leu Met Ala Val Ser Phe Gly

20 25 30

Ala Ala His Ala Gln Asp Ala Asp Glu Ala Leu Ile Lys Arg Gly Glu

35 40 45

Tyr Val Ala Arg Leu Ser Asp Cys Ile Ala Cys His Thr Ala Leu His

50 55 60

Gly Gln Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Glu Ile Lys Ser Pro Ile Gly Thr

65 70 75 80

Ile Tyr Ser Thr Asn Ile Thr Pro Asp Pro Glu His Gly Ile Gly Asn

85 90 95

Tyr Thr Leu Glu Asp Phe Thr Lys Ala Leu Arg Lys Gly Ile Arg Lys

100 105 110

Asp Gly Ala Thr Val Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Pro Glu Phe Ala Arg

115 120 125

Leu Ser Asp Asp Asp Ile Arg Ala Met Tyr Ala Phe Phe Met His Gly

130 135 140

Val Lys Pro Val Ala Leu Gln Asn Lys Ala Pro Asp Ile Ser Trp Pro

145 150 155 160

Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Gly Met Trp Arg Ala Met Phe Val Pro

165 170 175

Ser Met Thr Pro Gly Val Asp Lys Ser Ile Ser Asp Pro Glu Val Ala

180 185 190

Arg Gly Glu Tyr Leu Val Asn Gly Pro Gly His Cys Gly Glu Cys His

195 200 205

Thr Pro Arg Gly Phe Gly Met Gln Val Lys Ala Tyr Gly Thr Ala Gly

210 215 220

Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Gly Gly Ala Pro Ile Asp Asn Trp Ile Ala

225 230 235 240

Pro Ser Leu Arg Ser Asn Ser Asp Thr Gly Leu Gly Arg Trp Ser Glu

245 250 255

Asp Asp Ile Val Thr Phe Leu Lys Ser Gly Arg Ile Asp His Ser Ala

260 265 270

Val Phe Gly Gly Met Ala Asp Val Val Ala Tyr Ser Thr Gln His Trp

275 280 285

Ser Asp Asp Asp Leu Arg Ala Thr Ala Lys Tyr Leu Lys Ser Met Pro

290 295 300

Ala Val Pro Glu Gly Lys Asn Leu Gly Gln Asp Asp Gly Gln Thr Thr

305 310 315 320

Ala Leu Leu Asn Lys Gly Gly Gln Gly Asn Ala Gly Ala Glu Val Tyr

325 330 335

Leu His Asn Cys Ala Ile Cys His Met Asn Asp Gly Thr Gly Val Asn

340 345 350

Arg Met Phe Pro Pro Leu Ala Gly Asn Pro Val Val Ile Thr Asp Asp

355 360 365

Pro Thr Ser Leu Ala Asn Val Val Ala Phe Gly Gly Ile Leu Pro Pro

370 375 380

Thr Asn Ser Ala Pro Ser Ala Val Ala Met Pro Gly Phe Lys Asn His

385 390 395 400

Leu Ser Asp Gln Glu Met Ala Asp Val Val Asn Phe Met Arg Lys Gly

405 410 415

Trp Gly Asn Asn Ala Pro Gly Thr Val Ser Ala Ser Asp Ile Gln Lys

420 425 430

Leu Arg Thr Thr Gly Ala Pro Val Ser Thr Ala Gly Trp Asn Val Ser

435 440 445

Ser Lys Gly Trp Met Ala Tyr Met Pro Gln Pro Tyr Gly Glu Asp Trp

450 455 460

Thr Phe Ser Pro Gln Thr His Thr Gly Val Asp Asp Ala Gln

465 470 475

<210> 2

<211> 757

<212> PRT

<213> （野生乙醇脱氢酶GOX1068）

<400> 2

Met Thr Ser Gly Leu Leu Thr Pro Ile Lys Val Thr Lys Lys Arg Leu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Ala Ala Leu Ala Phe Ser Ala Ala Val Pro Val Ala

20 25 30

Phe Ala Gln Glu Asp Thr Gly Thr Ala Ile Thr Ser Ser Asp Asn Gly

35 40 45

Gly His Pro Gly Asp Trp Leu Ser Tyr Gly Arg Ser Tyr Ser Glu Gln

50 55 60

Arg Tyr Ser Pro Leu Asp Gln Ile Asn Thr Glu Asn Val Gly Lys Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ala Trp His Tyr Asp Leu Asp Thr Asn Arg Gly Gln Glu Gly

85 90 95

Thr Pro Leu Ile Val Asn Gly Val Met Tyr Ala Thr Thr Asn Trp Ser

100 105 110

Lys Met Lys Ala Leu Asp Ala Ala Thr Gly Lys Leu Leu Trp Ser Tyr

115 120 125

Asp Pro Lys Val Pro Gly Asn Ile Ala Asp Arg Gly Cys Cys Asp Thr

130 135 140

Val Ser Arg Gly Ala Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Val Tyr Phe Gly Thr

145 150 155 160

Phe Asp Gly Arg Leu Ile Ala Leu Asp Ala Lys Thr Gly Lys Leu Val

165 170 175

Trp Ser Val Tyr Thr Ile Pro Lys Glu Ala Gln Leu Gly His Gln Arg

180 185 190

Ser Tyr Thr Val Asp Gly Ala Pro Arg Ile Ala Lys Gly Lys Val Leu

195 200 205

Ile Gly Asn Gly Gly Ala Glu Phe Gly Ala Arg Gly Phe Val Ser Ala

210 215 220

Phe Asp Ala Glu Thr Gly Lys Leu Asp Trp Arg Phe Phe Thr Val Pro

225 230 235 240

Asn Pro Glu Asn Lys Pro Asp Gly Ala Ala Ser Asp Asp Ile Leu Met

245 250 255

Ser Lys Ala Tyr Pro Thr Trp Gly Lys Asn Gly Ala Trp Lys Gln Gln

260 265 270

Gly Gly Gly Gly Thr Val Trp Asp Ser Leu Val Tyr Asp Pro Val Thr

275 280 285

Asp Leu Val Tyr Leu Gly Val Gly Asn Gly Ser Pro Trp Asn Tyr Lys

290 295 300

Phe Arg Ser Glu Gly Lys Gly Asp Asn Leu Phe Leu Gly Ser Ile Val

305 310 315 320

Ala Ile Asn Pro Asp Thr Gly Lys Tyr Val Trp His Phe Gln Glu Thr

325 330 335

Pro Met Asp Glu Trp Asp Tyr Thr Ser Val Gln Gln Ile Met Thr Leu

340 345 350

Asp Met Pro Val Asn Gly Glu Met Arg His Val Ile Val His Ala Pro

355 360 365

Lys Asn Gly Phe Phe Tyr Ile Ile Asp Ala Lys Thr Gly Lys Phe Ile

370 375 380

Thr Gly Lys Pro Tyr Thr Tyr Glu Asn Trp Ala Asn Gly Leu Asp Pro

385 390 395 400

Val Thr Gly Arg Pro Asn Tyr Val Pro Asp Ala Leu Trp Thr Leu Thr

405 410 415

Gly Lys Pro Trp Leu Gly Ile Pro Gly Glu Leu Gly Gly His Asn Phe

420 425 430

Ala Ala Met Ala Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Leu Val Tyr Ile Pro Ala

435 440 445

Gln Gln Ile Pro Leu Leu Tyr Asp Gly Gln Lys Gly Gly Phe Lys Ala

450 455 460

Tyr His Asp Ala Trp Asn Leu Gly Leu Asp Met Asn Lys Ile Gly Leu

465 470 475 480

Phe Asp Asp Asn Asp Pro Glu His Val Ala Ala Lys Lys Asp Phe Leu

485 490 495

Lys Val Leu Lys Gly Trp Thr Val Ala Trp Asp Pro Glu Lys Met Ala

500 505 510

Pro Ala Phe Thr Ile Asn His Lys Gly Pro Trp Asn Gly Gly Leu Leu

515 520 525

Ala Thr Ala Gly Asn Val Ile Phe Gln Gly Leu Ala Asn Gly Glu Phe

530 535 540

His Ala Tyr Asp Ala Thr Asn Gly Asn Asp Leu Tyr Ser Phe Pro Ala

545 550 555 560

Gln Ser Ala Ile Ile Ala Pro Pro Val Thr Tyr Thr Ala Asn Gly Lys

565 570 575

Gln Tyr Val Ala Val Glu Val Gly Trp Gly Gly Ile Tyr Pro Phe Leu

580 585 590

Tyr Gly Gly Val Ala Arg Thr Ser Gly Trp Thr Val Asn His Ser Arg

595 600 605

Val Ile Ala Phe Ser Leu Asp Gly Lys Asp Ser Leu Pro Pro Lys Asn

610 615 620

Glu Leu Gly Phe Thr Pro Val Lys Pro Val Pro Thr Tyr Asp Glu Ala

625 630 635 640

Arg Gln Lys Asp Gly Tyr Phe Met Tyr Gln Thr Phe Cys Ser Ala Cys

645 650 655

His Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Val Leu Pro Asp Leu Arg Trp

660 665 670

Ser Gly Ala Pro Arg Gly Arg Glu Ser Phe Tyr Lys Leu Val Gly Arg

675 680 685

Gly Ala Leu Thr Ala Tyr Gly Met Asp Arg Phe Asp Thr Ser Met Thr

690 695 700

Pro Glu Gln Ile Glu Asp Ile Arg Asn Phe Ile Val Lys Arg Ala Asn

705 710 715 720

Glu Ser Tyr Asp Asp Glu Val Lys Ala Arg Glu Asn Ser Thr Gly Val

725 730 735

Pro Asn Asp Gln Phe Leu Asn Val Pro Gln Ser Thr Ala Asp Val Pro

740 745 750

Thr Ala Asp His Pro

755

<210> 3

<211> 371

<212> PRT

<213> （野生乙醛脱氢酶GOX2018）

<400> 3

Met Asp Val Thr Ala Ala Ile Ala Phe Glu Ala Gly Arg Pro Leu Glu

1 5 10 15

Ile Asp Thr Val Gln Leu Glu Gly Pro Arg Asp Gly Glu Val Leu Val

20 25 30

Glu Ile Met Ala Thr Gly Leu Cys His Thr Asp Lys Tyr Thr Leu Ser

35 40 45

Gly Gln Asp Pro Glu Gly Leu Phe Pro Ala Ile Leu Gly His Glu Gly

50 55 60

Ala Gly Ile Val Arg Glu Val Gly Ala Gly Val Lys His Leu Lys Pro

65 70 75 80

Gly Asp His Val Ile Pro Leu Tyr Thr Pro Glu Cys Arg Glu Cys Pro

85 90 95

Ser Cys Leu Ser Arg Lys Thr Asn Leu Cys Thr Ala Ile Arg Ser Thr

100 105 110

Gln Gly Lys Gly Leu Met Pro Asp Gly Thr Ser Arg Phe Ser Tyr Lys

115 120 125

Gly Gln Pro Ile His His Tyr Met Gly Cys Ser Thr Phe Ala Asn Phe

130 135 140

Thr Val Leu Pro Glu Ile Ala Leu Ala Lys Ile Arg Pro Asp Ala Pro

145 150 155 160

Phe Asp Lys Val Cys Tyr Ile Gly Cys Gly Val Thr Thr Gly Ile Gly

165 170 175

Ala Val Leu Phe Thr Ala Lys Val Glu Pro Gly Ser Thr Val Ala Val

180 185 190

Phe Gly Leu Gly Gly Ile Gly Leu Asn Val Ile Gln Gly Ala Lys Met

195 200 205

Val Gly Ala Asn Arg Ile Ile Gly Ile Asp Ile Asn Pro Glu Arg Glu

210 215 220

Ala Ile Ala Arg Lys Phe Gly Met Thr Asp Phe Val Asn Pro Lys Asp

225 230 235 240

Leu Gly Pro Asp Gly Asp Leu Val Gly His Leu Ile Glu Met Thr Gly

245 250 255

Gly Gly Leu Asp Tyr Thr Phe Glu Cys Val Gly Asn Pro Thr Leu Met

260 265 270

Arg Gln Ala Leu Glu Ser Ala His Arg Gly Trp Gly Val Ser Cys Val

275 280 285

Ile Gly Val Ala Gly Ala Gly Gln Glu Ile Ser Thr Arg Pro Phe Gln

290 295 300

Leu Val Thr Gly Arg Arg Trp Ile Gly Ser Ala Phe Gly Gly Ala Arg

305 310 315 320

Gly Arg Thr Asp Val Pro Lys Ile Val Asp Trp Tyr Met Glu Gly Arg

325 330 335

Ile Asp Ile Asp Asp Leu Ile Thr His Lys Leu Lys Leu Ala Asp Ile

340 345 350

Asn Leu Gly Phe Asp Met Met Ser Arg Gly Glu Ser Ile Arg Thr Val

355 360 365

Val Glu Tyr

370

<210> 4

<211> 343

<212> PRT

<213> （野生乙醇脱氢酶GOX0313）

<400> 4

Met Ala Asp Thr Met Leu Ala Ala Val Val Arg Glu Phe Gly Lys Pro

1 5 10 15

Leu Ser Ile Glu Arg Leu Pro Ile Pro Asp Ile Lys Pro His Gln Ile

20 25 30

Leu Val Lys Val Asp Thr Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala

35 40 45

Ala Arg Gly Asp Trp Pro Ser Lys Pro Asn Pro Pro Phe Ile Pro Gly

50 55 60

His Glu Gly Val Gly His Ile Val Ala Val Gly Ser Gln Val Gly Asp

65 70 75 80

Phe Val Lys Thr Gly Asp Val Val Gly Val Pro Trp Leu Tyr Ser Ala

85 90 95

Cys Gly His Cys Glu His Cys Leu Gly Gly Trp Glu Thr Leu Cys Glu

100 105 110

Lys Gln Asp Asp Thr Gly Tyr Thr Val Asn Gly Cys Phe Ala Glu Tyr

115 120 125

Val Val Ala Asp Pro Asn Tyr Val Ala His Leu Pro Ser Thr Ile Asp

130 135 140

Pro Leu Gln Ala Ser Pro Val Leu Cys Ala Gly Leu Thr Val Tyr Lys

145 150 155 160

Gly Leu Lys Met Thr Glu Ala Arg Pro Gly Gln Trp Val Ala Val Ser

165 170 175

Gly Val Gly Gly Leu Gly Gln Met Ala Val Gln Tyr Ala Val Ala Met

180 185 190

Gly Met Asn Val Val Ala Val Asp Ile Asp Asp Glu Lys Leu Ala Thr

195 200 205

Ala Lys Lys Leu Gly Ala Ser Leu Thr Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp

210 215 220

Pro Ala Arg Phe Ile Gln Gln Gln Ile Gly Gly Ala His Gly Ala Leu

225 230 235 240

Val Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Phe Ser Gln Ala Met Gly Tyr Ala

245 250 255

Arg Arg Gly Gly Thr Ile Val Leu Asn Gly Leu Pro Pro Gly Asp Phe

260 265 270

Pro Val Ser Ile Phe Asp Met Val Met Asn Gly Thr Thr Ile Arg Gly

275 280 285

Ser Ile Val Gly Thr Arg Leu Asp Met Ile Glu Ala Met Asp Phe Phe

290 295 300

Ala Arg Gly Lys Val Lys Ser Val Val Thr Pro Gly Lys Leu Glu Asn

305 310 315 320

Ile Asn Thr Ile Phe Asp Asp Leu Gln Asn Gly Arg Leu Glu Gly Arg

325 330 335

Thr Val Leu Asp Phe Arg Ser

340

<210> 5

<211> 1434

<212> DNA

<213> （经密码子优化的编码野生乙醇脱氢酶GOX1067的基因GOX1067）

<400> 5

atgctgaatg cgctgacccg cgatcgcttg gtgagcgaaa tgaaacaggg ctggaaactg 60

gcggcggcga ttggcttaat ggcggttagc tttggcgcgg cgcatgcgca agatgcggat 120

gaagcgttaa ttaaacgcgg cgaatatgtg gcgcgcctga gcgattgtat tgcgtgccat 180

accgcgctgc atggccaacc gtatgcgggt ggcttagaaa ttaaaagccc gattggcacc 240

atttacagca ccaatattac cccggatccg gaacatggca ttggcaatta taccctggaa 300

gattttacca aggcgctgcg caaaggcatt cgcaaagatg gcgcgaccgt gtatccggcg 360

atgccgtatc cagaatttgc gcgcttaagc gatgatgata ttcgcgcgat gtatgcgttt 420

tttatgcatg gcgtgaaacc ggtggcgctg cagaataaag cgccggatat tagctggccg 480

ctgagcatgc gttggccgtt aggtatgtgg cgtgcgatgt ttgtgccgag catgaccccg 540

ggtgttgata aaagcattag cgatccggaa gtggcgcgcg gcgaatattt agttaatggc 600

ccgggccatt gcggcgaatg ccatacccca cgtggttttg gcatgcaggt taaagcgtat 660

ggcaccgcgg gcggcaatgc gtatttagcg ggtggcgcgc caattgataa ttggattgcg 720

ccgagcctgc gcagcaatag cgataccggt ttaggtcgct ggagcgaaga tgatattgtg 780

acctttctga aaagcggccg cattgatcat agcgcggtgt ttggcggcat ggcggatgtt 840

gttgcgtata gcactcaaca ttggagcgat gatgatctgc gcgcgaccgc gaaatatctg 900

aaaagcatgc cggcggtgcc ggaaggcaaa aatctgggcc aagatgatgg ccagaccacc 960

gcgttgttaa ataaaggcgg ccaaggtaat gcgggcgcgg aagtttattt gcataattgc 1020

gcgatttgcc acatgaacga tggcaccggc gtgaatcgca tgtttccgcc gttagcgggt 1080

aatccggtgg ttattaccga tgatccgacc agcctggcga atgtggtggc gtttggtggc 1140

attctgccgc cgaccaatag cgcgccaagc gcggttgcga tgccaggttt taaaaatcat 1200

ctgagcgatc aggaaatggc ggatgtggtg aattttatgc gcaaaggctg gggcaataat 1260

gcgccgggca ctgttagcgc gagtgatatt caaaaactgc gcaccaccgg cgcgccggtt 1320

agtactgcgg gttggaatgt tagcagcaaa ggctggatgg cgtatatgcc gcagccgtat 1380

ggcgaagatt ggacctttag cccgcagacc cataccggcg ttgatgatgc gcaa 1434

<210> 6

<211> 2271

<212> DNA

<213> （经密码子优化的编码野生乙醇脱氢酶GOX1068的基因GOX1068）

<400> 6

atgaccagcg gcctgctgac cccgattaaa gtgaccaaaa aacgcctgct gagctgcgcg 60

gcggcgttag cgtttagcgc ggcagttcca gttgcgtttg cgcaagaaga taccggcacc 120

gcgattacca gcagcgataa tggcggccat ccgggcgatt ggttaagcta tggtcgtagc 180

tatagcgaac agcgctatag cccgctggat cagattaata ccgaaaatgt gggcaaactg 240

aaactggcgt ggcattatga tctggatacc aatcgcggcc aggaaggcac cccattgatt 300

gtgaatggcg tgatgtatgc gaccaccaat tggagcaaaa tgaaagcgct ggatgcggcg 360

accggcaaac tgttatggag ctatgatccg aaagtgccgg gcaatattgc ggatcgcggc 420

tgctgtgata ccgtgagccg tggtgcggcg tattggaatg gtaaagtgta ttttggcacc 480

tttgacggcc gcctgattgc gctggatgcg aaaactggta aactggtgtg gagcgtgtat 540

accattccga aagaagcgca gctgggccat cagcgcagct atactgttga tggcgcgcca 600

cgtattgcga aaggcaaagt gttaattggc aatggcggcg cggaatttgg cgcgcgcggt 660

tttgttagcg cgtttgatgc ggaaaccggc aaactggatt ggcgcttttt taccgtgccg 720

aatccggaaa ataaaccgga tggcgcggcg agcgatgata ttctgatgag caaagcgtat 780

ccgacctggg gcaaaaatgg cgcgtggaaa cagcagggcg gcggcggtac cgtttgggat 840

agtttagttt atgatccggt gaccgatctg gtgtatctgg gcgtgggtaa tggcagccca 900

tggaattata aatttcgcag cgaaggcaaa ggcgataatc tgtttctggg cagcattgtg 960

gcgattaatc cggataccgg caaatatgtg tggcattttc aggaaacccc gatggatgaa 1020

tgggattata ccagcgtgca gcagattatg accctggata tgccggtgaa tggcgaaatg 1080

cgccatgtga ttgtgcatgc gccgaaaaat ggcttttttt atattatcga cgcgaagacc 1140

ggcaagttta ttaccggcaa accgtatacc tatgagaatt gggcgaatgg cctggatccg 1200

gtgaccggcc gtccaaatta tgttccagat gcgctgtgga ccctgaccgg caaaccatgg 1260

ttaggtattc cgggcgaact gggcggtcat aattttgcgg cgatggcgta tagcccgaaa 1320

accaaactgg tgtatattcc ggcgcagcag attccgctgc tgtatgatgg ccagaaaggc 1380

ggctttaaag cgtatcatga tgcgtggaat ctgggcctgg atatgaataa aattggcctg 1440

tttgatgaca acgacccgga acatgtggcg gcgaaaaaag attttctgaa agtgctgaaa 1500

ggctggaccg tggcgtggga tccagaaaaa atggcgccgg cgtttaccat taatcataaa 1560

ggcccgtgga atggcggcct gctggcaacc gcgggtaatg tgatttttca gggcctggcg 1620

aatggcgaat ttcatgcgta tgatgcgacc aatggcaatg atctgtatag ctttccggcg 1680

cagagcgcga ttattgcgcc gccagttacc tataccgcga atggcaaaca gtatgtggcg 1740

gtggaagtgg gctggggcgg tatttatccg tttctgtatg gcggcgtggc gcgcaccagc 1800

ggttggaccg ttaatcatag ccgcgtgatt gcgtttagcc tggatggcaa agatagcctg 1860

ccgccgaaaa atgaactggg ctttaccccg gtgaaaccgg tgccgactta tgatgaagcg 1920

cgccagaaag atggctattt tatgtatcag accttctgca gcgcgtgcca tggcgataat 1980

gcgattagcg gcggcgtgct gccagatctg cgttggagcg gtgcgccacg tggtcgtgaa 2040

agcttttata aactggtggg ccgcggcgcg ctgaccgcgt atggtatgga tcgttttgat 2100

accagcatga ccccggaaca gattgaagat attcgcaatt ttatcgtgaa gcgcgcgaat 2160

gaaagctatg atgatgaagt gaaagcgcgc gaaaatagca ccggcgtgcc gaatgatcag 2220

tttctgaatg tgccgcagag caccgcggat gtgccaactg cggatcatcc a 2271

<210> 7

<211> 1113

<212> DNA

<213> （经密码子优化的编码野生乙醛脱氢酶GOX2018的基因GOX2018）

<400> 7

atggatgtga ccgcggcgat tgcgtttgaa gcgggcagac cattagaaat tgataccgtt 60

cagctggaag gcccgcgcga tggagaagtt ttagttgaaa ttatggcgac cggcctgtgc 120

cataccgata aatataccct gagcggccag gatccggaag gcttgtttcc ggcaattctg 180

ggccatgaag gcgcgggtat tgttcgcgaa gtgggcgcgg gtgttaaaca tttgaaaccg 240

ggcgatcatg tgattccgct gtataccccg gaatgccgcg aatgcccaag ctgtttaagc 300

cgtaaaacca atctgtgcac cgcgattcgc agcacccagg gcaaaggttt aatgccggat 360

ggcaccagcc gttttagcta taaaggccag ccgattcatc attatatggg ctgcagcacc 420

tttgcgaatt ttaccgtgct gccggaaatt gcgctggcga aaattcgccc ggatgcgccg 480

tttgataaag tgtgctatat tggctgcggc gtgaccaccg gcattggcgc ggtgttgttt 540

accgcgaaag tggaaccggg cagcaccgtg gcggtttttg gtttaggtgg tattggttta 600

aatgtgatcc agggcgcgaa aatggtgggc gcgaatcgca ttattggcat tgatattaat 660

ccggagcgcg aggcgattgc gcgcaaattt ggtatgaccg attttgtgaa tccgaaagac 720

ctgggcccgg atggcgatct ggttggccat ttaattgaaa tgaccggcgg cggcttggat 780

tatacctttg aatgcgtggg caatccgacc ctgatgcgcc aagcgttaga aagcgcgcat 840

cgcggctggg gtgttagctg cgttattggc gttgcgggtg cgggtcaaga aattagcacc 900

cgtccatttc agctggtgac cggccgtcgt tggattggca gcgcgtttgg tggtgcgcgt 960

ggtcgtaccg atgttccaaa aattgtggat tggtatatgg agggccgcat tgatattgat 1020

gatctgatta cccataagct gaagctggcg gatattaacc tgggctttga tatgatgagc 1080

cgcggcgaaa gcattcgcac cgtggttgaa tat 1113

<210> 8

<211> 1029

<212> DNA

<213> （经密码子优化的编码野生乙醇脱氢酶GOX0313的基因GOX0313）

<400> 8

atggcggata ccatgctggc ggcggtggtt cgtgaatttg gcaaaccgct gagcattgaa 60

cgcctgccga ttccggatat taaaccgcat cagattctgg tgaaagtgga tacctgcggc 120

gtgtgccata ccgatctgca tgcggcgcgt ggcgattggc ctagcaaacc taatccgccg 180

tttattccgg gccatgaagg cgtgggccat attgtggcgg tgggcagcca agtgggcgat 240

tttgtgaaaa ccggcgatgt ggtgggcgtg ccgtggttat atagcgcgtg tggtcattgt 300

gaacattgcc tgggcggctg ggaaaccctg tgcgaaaaac aggatgatac cggctatacc 360

gtgaacggct gctttgcgga atatgtggtg gcggatccga actatgtggc gcatctgccg 420

agcaccattg atccgctgca ggcgagccct gtgctgtgcg cgggcttaac cgtgtataaa 480

ggcctgaaaa tgaccgaagc ccgcccgggc caatgggtgg cggttagcgg tgttggtggt 540

ttaggccaga tggcggttca atatgcggtg gcgatgggca tgaacgtggt ggcggttgat 600

attgatgatg aaaaactggc gaccgcgaag aaactgggcg cgagcttaac cgtgaacgcg 660

aaagataccg atccggcccg ctttattcag cagcagattg gcggtgcgca tggcgcgtta 720

gttaccgcgg ttggtcgtac cgcgtttagc caggcgatgg gctatgcgcg tcgtggtggt 780

accattgttc tgaacggctt accgcctggc gattttccgg ttagcatttt tgatatggtg 840

atgaacggca ccaccattcg cggcagcatt gtgggcactc gcttagatat gattgaagcg 900

atggacttct ttgcccgcgg caaagtgaaa agcgtggtga cgccgggcaa actggaaaac 960

attaacacca tttttgacga tctgcagaac ggccgcctgg aaggccgtac cgttttagat 1020

tttcgcagc 1029

Claims (9)

1.一种具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶，其为乙醇脱氢酶GOX1067、乙醇脱氢酶GOX1068、乙醛脱氢酶GOX2018和乙醇脱氢酶GOX0313中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的酶，其特征在于，所述乙醇脱氢酶GOX1067为以下GOX1067蛋白质中的任一种：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一种蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

3.根据权利要求1所述的酶，其特征在于，所述乙醇脱氢酶GOX1068为以下GOX1068蛋白质中的任一种：

(B1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

(B2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(B3)与(B1)或(B2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(B4)在(B1)-(B3)中任一种蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

4.根据权利要求1所述的酶，其特征在于，所述乙醛脱氢酶GOX2018为以下GOX2018蛋白质中的任一种：

(C1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；

(C2)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(C3)与(C1)或(C2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(C4)在(C1)-(C3)中任一种蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

5.根据权利要求1所述的酶，其特征在于，所述乙醇脱氢酶GOX0313为以下GOX0313蛋白质中的任一种：

(D1)氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；

(D2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(D3)与(D1)或(D2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(D4)在(D1)-(D3)中任一种蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

6.一种如权利要求1-5中任意一项所述的具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶的相关生物材料，其为能够表达所述GOX1067蛋白、GOX1068蛋白质、GOX2018蛋白质或GOX0313蛋白质的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

7.一种以乙醇醛为底物合成乙二醇的方法，其包括利用具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶或相关生物材料，以乙醇醛为底物反应产生乙二醇；

所述具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶为如权利要求1-5中任意一项所述述的酶；所述具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶的相关生物材料为权利要求6所述的相关生物材料；

优选地，所述合成乙二醇的反应温度为4-80℃。

8.一种以甲醛为底物多酶级联合成乙二醇的方法，其包括以下步骤：(1)利用乙醇醛合成酶GALS将甲醛转化为乙醇醛；(2)利用具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶或相关生物材料将乙醇醛转化为乙二醇；

所述具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶为如权利要求1-5中任意一项所述的酶；所述具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶的相关生物材料为权利要求6所述的相关生物材料；

优选地，所述合成乙二醇的反应温度为4-80℃。

9.一种以CO₂为底物多酶级联合成乙二醇的方法，其包括以下步骤：(1)利用多酶将CO₂转化为甲醛；(2)利用乙醇醛合成酶GALS将甲醛转化为乙醇醛；(3)利用具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶或相关生物材料将乙醇醛转化为乙二醇；

所述具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶为如权利要求1-5中任意一项所述述的酶；所述具有催化乙醇醛合成乙二醇功能的酶的相关生物材料为权利要求6所述的相关生物材料；

优选地，所述合成乙二醇的反应温度为4-80℃。

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