CN113151209B

CN113151209B - 一种短链脱氢酶blsdr8及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN113151209B
Application number: CN202110660320.XA
Authority: CN
Inventors: 欧阳嘉; 卜重阳; 郑兆娟; 乔慧; 邹丽花
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2021-06-15
Filing date: 2021-06-15
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2041-06-15
Also published as: CN113151209A

Abstract

本发明公开一种短链脱氢酶BLSDR8及其编码基因及应用。本发明从凝结芽孢杆菌NL01（Bacillus coagulans NL01）中克隆得到了一个新的短链脱氢酶基因blsdr8，可在宿主细胞中表达该基因以生产此短链脱氢酶，此短链脱氢酶或重组表达转化体可在一定浓度的有机溶剂下保持活力，可高效率将S‑乙偶姻不对称还原为（2S，3S）‑2，3‑丁二醇，在生物还原乙偶姻具有很高的工业应用价值。

Description

一种短链脱氢酶BLSDR8及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种短链脱氢酶BLSDR8及其编码基因和应用。

背景技术

2，3-丁二醇广泛用于化工、食品、航空航天燃料等领域还可以用于制备油墨，香水，熏蒸剂，增湿剂，软化剂，增塑剂，炸药及药物手性载体等。2，3-丁二醇化学合成成本高且过程繁琐，工业化生产较困难。生物法制备2，3-丁二醇目的是避免化学合成的困难，实现由传统的石油冶炼向可再生资源为原料的生物炼制转型。乙偶姻广泛存在于苹果、可可、草莓和玉米等物质中，具有特殊的奶油香味。乙偶姻是我国明确规定的食品添加剂，通常被添加到烘培食物、糖果、乳制品和饮料等食品中。

2，3-丁二醇在常温下是一种无色无味透明的液体，有三种同分异构体：meso-2，3-丁二醇，(2R，3R)-2，3-丁二醇和(2S，3S)-2，3-丁二醇，具有光学活性的(2R，3R)-2，3-丁二醇和(2S，3S)-2，3-丁二醇还可用作防冻剂，由于其具有手性碳原子，在不对称合成中也有重要用途。乙偶姻包含两个对映异构体，R-乙偶姻和S-乙偶姻，2，3-丁二醇与乙偶姻的各种异构体是不对称合成中的重要原料，都是极具应用潜力的医药中间体。

短链脱氢酶(Short-chain dehydrogenase.SDRs)是一类利用NADH或NADPH作为氢供体将羰基化合物还原成相应醇的羰基还原酶。家族成员由250-300个氨基酸残基组成，序列相似度仅有15％～35％，并且蛋白质三位结构具有典型的Rossmann折叠结构域。短链脱氢酶由于其催化底物广，热稳定性好，及有机溶剂耐受性强等特点而备受关注，并且有诸多报道证明某些短链脱氢酶具有可逆催化乙偶姻还原丁二醇的特征。Ui等人报道一种将外消旋乙偶姻选择催化生成(2S，3S)-2，3-丁二醇的乙偶姻还原酶，然而细胞所催化的得率仅有0.37g/g，且其比酶活极低，反应时间太长，不利于应用在实际生产，Xiao等人则利用(2R，3R)-2，3-丁二醇脱氢酶来使混合手性的2，3-丁二醇转化为乙偶姻，使不反应的(2S，3S)-2，3-丁二醇分离得到。目前报道中，大多数乙偶姻还原酶都选择催化R型乙偶姻，对S型乙偶姻还原较少，酶存在着反应时间长，比酶活低的缺陷。筛选出能够直接还原S-乙偶姻的高效率还原酶能够直接改变(2S，3S)-丁二醇和S-乙偶姻的生产工艺，在实际应用中具有重要意义。

因此，筛选一种短链脱氢酶高效率将乙偶姻不对称还原为(2S，3S)-2，3-丁二醇在实际应用当中具有重要意义。

发明内容

发明目的：本发明提供了一种短链脱氢酶BLSDR8及其应用，该酶在还原S-乙偶姻方面具有极高的活力，并且生成单一手性的(2S，3S)-2，3-丁二醇，对R-乙偶姻的活力较低，生成meso-2，3-丁二醇，且对其他的羰基化合物也具有活力(包括苯甲醛，己醛，苯乙酮，乙醛等，但不限于此)。

为实现上述目的，本发明提出了一种短链脱氢酶BLSDR8，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明进一步提供了编码所述短链脱氢酶BLSDR8的基因blsdr8。其基因通过PCR克隆凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans NL01基因组所得。凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans NL01(亦称为嗜热芽孢杆菌)的保藏号为CCTCC NO：M2011468，其详细信息公开于专利CN 109402093中。具体地，在设计引物上，blsdr8的上游引物为TTAATTGGATCCGatgtctaaagttgcaattgtaacaggttcagctgg，下游引物为CCGGCCAAGCTTttatctatatacaagtccaccatctgttaagattgctt，然后以Bacllus coagulans NL01基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应进行基因扩增，获得短链脱氢酶基因序列。

本发明进一步提出了包含所述基因的重组表达载体，这些重组载体提供一种包含本发明的短链脱氢酶核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒，粘粒，噬菌体或病毒载体等，优选pETDuet-1。较佳的，可通过下述方法获得本发明的重组表达载体；将通过PCR扩增所得的短链脱氢酶基因产物blsdr8与载体pETDuet-1连接构建本发明的短链脱氢酶基因重组表达质粒pETDuet-blsdr8。

本发明还提出了包含上述重组表达载体的重组表达转化体，通过将上述重组表达载体转化至宿主细胞中得到。所述的宿主细胞可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的短链脱氢酶基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。将重组质粒pETDuet-blsdr8分别转化至E.coli BL21(DE3)中，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-blsdr8。

进一步地，本发明还提出了上述短链脱氢酶BLSDR8的制备方法，即培养所述重组表达转化体，诱导获得重组短链脱氢酶。具体地，包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，诱导获得重组短链脱氢酶。其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2。培养方法和培养条件没有限制，只要使转化体能够生长并产生短链脱氢酶即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-BLSDR8，接种至含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，当培养液中光密度OD₆₀₀达到0.5-0.8时，在终浓度为0.1-1.0mM的异丙基--D-硫代吡喃半乳糖糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组短链脱氢酶。

本发明的另一个方面还提供了所述短链脱氢酶BLSDR8所述的重组表达转化体在还原羰基化合物(主要包括苯甲醛，己醛，苯乙酮，乙醛，乙偶姻等，但不限于此)生成相应醇上的应用，特别是催化还原乙偶姻生成丁二醇的应用。

上述应用中，所述的还原羰基化合物的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下：

所述的蛋白质优选本发明所述的短链脱氢酶，所述的菌体优选包含此酶的重组表达转化体，所述的羰基化合物较佳的为乙偶姻，同时也包括苯甲醛，己醛，苯乙酮，乙醛等。在PH 4.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液中，优选pH 7.0，在NADH和NADPH或葡萄糖作为氢供体，优选NADH和葡萄糖，在所述的酶或包含此酶的重组表达转化体作为催化剂的条件下进行乙偶姻或者其他羰基化合物的还原反应。

上述反应在0％-30％的有机溶剂条件下进行的应用，优选体积比10％甲醇，10％乙醇，10％丙酮，也是本发明保护的范围。

本发明的实验证明，本发明从凝结芽孢杆菌克隆得到了一个新的短链脱氢酶基因blsdr8，可在宿主细胞中表达这种基因以生产这种短链脱氢酶，此短链脱氢酶或重组表达转化体可在一定浓度的有机溶剂下保持活力，并且可以用于乙偶姻和其他酮醛类化合物的还原。

附图说明

图1为基因blsdr8的PCR扩增电泳图谱；

图2为重组短链脱氢酶BLSDR8的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中，泳道4为标准分子量蛋白，泳道5为包含空质粒pETDuet的E.coli BL21(DE3)对照菌株粗酶液，泳道1和泳道2为包含重组质粒pETDuet-blsdr8的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株诱导表达后的粗酶液，泳道3为重组短链脱氢酶Blsdr1使用HisTrap^TMHP亲和层析柱进一步纯化结果；

图3为BLSDR8还原乙偶姻的不同pH下酶活，其中，pH 4.0-6.0醋酸钠缓冲液，pH6.0-7.5磷酸钠缓冲液，25℃；

图4为不同温度下BLSDR8还原乙偶姻的酶活(pH 5.0，醋酸钠缓冲液)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：Bacillus coagulans NL01短链脱氢酶基因的获得，重组质粒构建及转化大肠杆菌。

采用常规的方法制备凝结芽孢杆菌NL01的基因组DNA，该过程可参照TakaraMiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒说明书步骤，提取凝结芽孢杆菌NL01基因组DNA。其中，

设计引物，引入能插入质粒pETDuet-1的BamHI和HindIII的限制酶切位点，所设计的blsdr8的引物序列如下：

上游引物5’-TTAATTGGATCCGATGTCTAAAGTTGCAATTGTAACAGGTTCAGC TGG-3’(BamHI)

下游引物5’-CCGGCCAAGCTTTTATCTATATACAAGTCCACCATCTGTTAAGATT GCTT-3’(HindIII)

以提取的凝结芽孢杆菌NL01的基因组为模板，利用上述引物进行扩增，扩增得到短链脱氢酶基因序列blsdr8。短链脱氢酶基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果见附图1。

PCR产物由BamHI/HindIII进行双酶切，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，然后用T4连接酶将该片段同用相同限制性内切酶处理的商业化载体pETDuet-1连接，构建重组表达质粒pETDuet-blsdr8。

将上述构建的重组表达转化体pETDuet-blsdr8分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-blsdr8，涂布于氨苄青霉素的平板，37℃培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR验证，阳性克隆测序验证，结果表明重组表达载体pETDuet-blsdr8各自都成功转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)中，且短链脱氢酶基因成功克隆至pET-Duet-1的BamHI和HindIII位点。

实施例2：重组短链脱氢酶的诱导表达。

实施例1构建的工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-blsdr8分别接种至含50ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以1％接种量(v/v)接种到含50ug/mL氨苄青霉素的50mL LB培养基中，37℃，200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.6-0.8左右，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃诱导培养5h后，4℃，8000rpm离心5min收集菌体，于-20℃储存备用。

该短链脱氢酶和其他已知的羰基还原酶的同源性(即氨基酸序列相似性)见表1。本发明中短链脱氢酶的氨基酸序列和已知的羰基还原酶氨基酸相似性低于50％，具有显著性差异。

表1本发明的短链脱氢酶与其他已知的乙偶姻还原酶的同源性

实施例3：重组短链脱氢酶的分离纯化。

实施例2收集的菌体细胞悬浮于10mL Na₂HPO4-NaH₂PO₄缓冲液(100mM，pH 7.4)中，振荡摇匀后置超声波下破碎(有效时间8min)。破碎液于12000rpm离心20min去除细胞碎片，收集上清液(粗酶液)用于酶的分离纯化。纯化柱为HisTrap^T ^MHP，装柱体积为5mL，先用上样平衡缓冲液(20mM磷酸钠，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 7.4)洗脱收集目标蛋白，最后用洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，500mM NaCl和500mM咪唑，pH 7.4)洗脱收集目标蛋白。酶液用20KDa超滤管进行脱盐，脱盐缓冲液为Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(100mM，pH 7.4)缓冲液，所得纯酶液于4℃贮存备用。纯化后的酶液为SDS-PAGE进行分析，SDS-PAGE电泳见图2，结果表明经分离纯化以后，得到电泳纯的重组短链脱氢酶BLSDR8。

实施例4：重组短链脱氢酶BLSDR8还原酮醛类物质的酶活测定

以各类酮醛类物质为底物，重组短链脱氢酶的活力测定根据NAD(P)H的减少来计算，酶活力(U)定义为：在测定条件下，每分钟催化氧化1μmol的NAD(P)H所需的酶量。

酶活测定体系及计算方法如下：

1mL反应体系中含有5mM酮醛底物，0.4mM NADH，50uL的酶液，磷酸钠缓冲液(100mMpH7.0)。室温条件下，1min内，每隔5s读取340nm处吸光值的变化来计算酶活。其酶活公式如下：

酶活U＝(ΔΑ×V×10³)/(6220×l)

ΔΑ为1min内吸光值的变化，V为反应液的体积，6220为NADH在340nm处的摩尔消光系数，L·mol^-1·cm^-1，l为光程距离，cm。

比酶活计算公式：

比酶活(U/mg)＝酶活(U/mL)/蛋白浓度(mg/mL)

所计算出的BLSDR8对各类酮醛类物质酶活如附表2所示。

表2NADH作为辅酶，短链脱氢酶BLSDR8的酶活

其中，BLSDR8对苯甲醛，乙醛，苯乙酮，乙偶姻，乙醛都有酶活，并且BLSDR8对乙偶姻的酶活很高，比酶活可达到98U/mg。

实施例5：重组短链脱氢酶BLSDR8有机溶剂酶活保留。

分别选用不同体积浓度(10％，20％，30％)的甲醇，乙醇，丙酮作为反应压力，以乙偶姻作为底物，测试方法同实施例4，测试BLSDR8的酶活，得到的保留的酶活如下表3所示，表明此短链脱氢酶可在一定浓度的有机溶剂下保持活力。

表3BLSDR8的有机溶剂耐受性(底物：乙偶姻)

实施例6：重组短链脱氢酶BLSDR8的最适pH和温度。

底物乙偶姻为5mM，NADH浓度为0.4mM，总体积为1ml，加入的酶液为15ul，测定不同的pH时，温度为25℃，测定不同pH的比酶活，其结果如下图3所示。在同样的体系下，测定最适温度时，在最适的pH的条件下，测定不同温度下的酶活，其结果如下图4所示。可以看出，最适的pH为5.0，最适温度为70℃，属于高温酸性条件下易于进行还原反应的酶。

实施例7：包含此酶的大肠杆菌重组表达转化体催化还原外消旋乙偶姻。

使用全细胞催化高效率催化转化乙偶姻生成手性丁二醇，催化体系20ml(pH7.4)，用了6g/L的乙偶姻作为底物，0.2g湿细胞，葡萄糖浓度25g/L，30℃，150rpm条件下反应36h，取样测定乙偶姻和丁二醇的含量如表4所示。可以看出短链脱氢酶BLSDR8对S-乙偶姻比R-乙偶姻有更强的还原力，并且没有(2R，3R)-2，3-丁二醇的生成。

表4重组大肠杆菌BLSDR8不对称还原乙偶姻

(a)：百分数表示手性乙偶姻或手性丁二醇分别占混合手性乙偶姻或混合手性丁二醇的比例

本发明从凝结芽孢杆菌克隆得到了一个新的短链脱氢酶基因blsdr8，可在宿主细胞中表达这种基因以生产这种短链脱氢酶，此短链脱氢酶或重组表达转化体可在一定浓度的有机溶剂下保持活力，并且可以用于乙偶姻和其他酮醛类化合物的还原。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种短链脱氢酶BLSDR8及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 774

<212> DNA

<213> 短链脱氢酶基因(Artificial Sequence)

<400> 1

ttatctatat acaagtccac catctgttaa gattgcttgt cctgttatat aatcagcgtc 60

atctgatgct aagaatgaaa ctaagtttgc tacatcttcc ggggtttgat atcttcctaa 120

tgctatttca gaagaaaact tttcaaatgc ttcaccaggt tttaaatcat cactatattt 180

gaccatttct tcatcaattc gatcccacat tttcgtctta gcaacaccag ggcagtatgc 240

attcactgta atttgatatt tggctaactc tttggcagcg gaatgagtaa aggatttaac 300

tgcgtgtttc gtagctgagt atgtacccaa catttcgtag gattcatgtc cagctatact 360

gcatgcgttg ataattttcc cttttgattt ctggcttata aattgttcgg ctgctgcttg 420

cgttccaaaa acaacgccat ttacattaat actaaagagc ttattcagct gttcttctgt 480

aatttctaag aatggggata ctgcatcaat tccagcatta tttacaaata catctaaatg 540

gccaaacttc tcaacacctt ttttaacaag attaaattgg tcatttcgtt tagacacgtc 600

acctttgacg ccaataacat cataaccttt atttttaaat tcgttgacgg tttcatttaa 660

tagttgttcg ttaatatcat gaacaacaac actaaaacca tctgagcata atctttctgc 720

aatgcctttt cctaacccac cagctgaacc tgttacaatt gcaactttag acat 774

<210> 2

<211> 257

<212> PRT

<213> 短链脱氢酶(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Ser Ala Gly Gly Leu Gly Lys

1 5 10 15

Gly Ile Ala Glu Arg Leu Cys Ser Asp Gly Phe Ser Val Val Val His

20 25 30

Asp Ile Asn Glu Gln Leu Leu Asn Glu Thr Val Asn Glu Phe Lys Asn

35 40 45

Lys Gly Tyr Asp Val Ile Gly Val Lys Gly Asp Val Ser Lys Arg Asn

50 55 60

Asp Gln Phe Asn Leu Val Lys Lys Gly Val Glu Lys Phe Gly His Leu

65 70 75 80

Asp Val Phe Val Asn Asn Ala Gly Ile Asp Ala Val Ser Pro Phe Leu

85 90 95

Glu Ile Thr Glu Glu Gln Leu Asn Lys Leu Phe Ser Ile Asn Val Asn

100 105 110

Gly Val Val Phe Gly Thr Gln Ala Ala Ala Glu Gln Phe Ile Ser Gln

115 120 125

Lys Ser Lys Gly Lys Ile Ile Asn Ala Cys Ser Ile Ala Gly His Glu

130 135 140

Ser Tyr Glu Met Leu Gly Thr Tyr Ser Ala Thr Lys His Ala Val Lys

145 150 155 160

Ser Phe Thr His Ser Ala Ala Lys Glu Leu Ala Lys Tyr Gln Ile Thr

165 170 175

Val Asn Ala Tyr Cys Pro Gly Val Ala Lys Thr Lys Met Trp Asp Arg

180 185 190

Ile Asp Glu Glu Met Val Lys Tyr Ser Asp Asp Leu Lys Pro Gly Glu

195 200 205

Ala Phe Glu Lys Phe Ser Ser Glu Ile Ala Leu Gly Arg Tyr Gln Thr

210 215 220

Pro Glu Asp Val Ala Asn Leu Val Ser Phe Leu Ala Ser Asp Asp Ala

225 230 235 240

Asp Tyr Ile Thr Gly Gln Ala Ile Leu Thr Asp Gly Gly Leu Val Tyr

245 250 255

Arg

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 上游引物(Artificial Sequence)

<400> 3

ttaattggat ccgatgtcta aagttgcaat tgtaacaggt tcagctgg 48

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 下游引物(Artificial Sequence)

<400> 4

ccggccaagc ttttatctat atacaagtcc accatctgtt aagattgctt 50

Claims

1.一种短链脱氢酶BLSDR8在30%乙醇添加下还原乙偶姻生成相应醇上的应用，其中，所述短链脱氢酶BLSDR8的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示，所述短链脱氢酶BLSDR8还原S手性乙偶姻生成（2S，3S）－2，3－丁二醇。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述短链脱氢酶BLSDR8通过重组表达转化体诱导表达得到，其中，所述重组表达转化体通过将重组表达载体转化至大肠杆菌中得到，所述重组表达载体包括编码所述短链脱氢酶BLSDR8的编码基因和载体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体为pETDuet-1，pCDFDuet-1和pRSFDuet-1或衍生自上述载体的任意一种。