CN113151208B

CN113151208B - 一种短链脱氢酶blsdr1及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN113151208B
Application number: CN202110660318.2A
Authority: CN
Inventors: 欧阳嘉; 卜重阳; 陶渊明; 付佳铭; 郑兆娟
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2021-06-15
Filing date: 2021-06-15
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2041-06-15
Also published as: CN113151208A

Abstract

本发明公开一种短链脱氢酶BLSDR1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白是由SEQ NO.2所示的氨基酸序列编码的蛋白质。本发明从凝结芽孢杆菌NL01中克隆得到了一个新的短链脱氢酶基因blsdr1，可在宿主细胞中表达该基因以生产此短链脱氢酶，该酶在还原羰基化合物方面具有广泛的底物谱，并且具有一定的有机溶剂耐受能力，可用于多种酮醛类化合物的脱除还原。

Description

一种短链脱氢酶BLSDR1及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种短链脱氢酶及编码基因和应用功能。

背景技术

随着社会和城市化的迅猛发展，室内空气污染已经成为人们关注的问题，在各种污染物中，包括芳香族化合物和甲醛在内的挥发性有机化合物具有复杂性，刺激性和致病性，对人的眼睛、鼻子、皮肤、肺、呼吸道等有强烈的刺激作用，有的可能致癌，因此受到人们的广泛关注。除甲醛外，还有许多会造成污染的挥发性有机化合物，例如，在室内环境通常相对较高浓度的己醛，乙醛，丙酮等，由于其易挥发性和毒性，会对人体的呼吸系统造成潜在的毒性影响。

羰基化合物是大气中的主要污染物之一，它们不仅是一级污染物，更是二级污染物，是光化学烟雾的主要成分。乙醛，丙酮，丁酮及其他羰基化合物在工业上被广泛使用(工业原料，溶剂等)，因而工业生产过程中会释放大量的羰基化合物，我国对于大气羰基化合物研究较晚，多限于低分子醛类化合物的测定，国外检测羰基污染物的方法较多，酮醛类较全。将毒性较强的酮醛类化合物转化为毒性较低相应的醇类是减少其危害的方法之一，报道的虽然存在很多合成途径来还原酮醛生成醇类，但是传统由酮，醛制备醇的化学法还原，通常涉及高温，高压，易燃易爆的氢气及昂贵的金属催化剂，因此生物催化剂技术由于反应条件温和，环境友好，反应速率快，价格低廉等优点成为目前最受瞩目绿色催化剂。

短链脱氢酶(Short-chain dehydrogenase.SDRs)是一类利用NADH或NADPH作为氢供体将羰基化合物还原成相应醇的羰基还原酶。家族成员由250-300个氨基酸残基组成，序列相似度仅有15％～35％，并且蛋白质三位结构具有典型的Rossmann折叠结构域。短链脱氢酶由于其催化底物广，热稳定性好，及有机溶剂耐受性强等特点而备受关注，并且有诸多报道证明某些短链脱氢酶也具有催化浅手性酮制备高光学纯度手性醇的特征。

因此，针对以上各种毒性的酮醛类化合物，寻找一种能够高效还原各种酮醛类化合物转化为相应的醇类是一种简单，快捷的检测和脱除羰基化合物的方法。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种短链脱氢酶及其编码基因和应用，该酶在还原羰基化合物方面具有广泛的底物谱，并且具有一定的有机溶剂耐受能力，可以用于一些酮醛类化合物的脱除及相应醇的生产。

具体地，本发明提出了一种短链脱氢酶BLSDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明进一步提出了编码上述短链脱氢酶的基因blsdr1。

其中，基因blsdr1通过PCR技术从凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans NL01基因组中克隆获得，凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans NL01(亦称为嗜热芽孢杆菌)的保藏号为CCTCC NO：M2011468，其详细信息公开于专利CN 109402093中。

具体制备方法为：根据Genbank中收录的基因序列设计合成引物，所涉及的blsdr1较佳的上游引物为：GGCCTTGGATCCGatgcaaacatttgatttcacaggaaaagttgcaatcgtaa，下游引物为：AATTTTTAAAAGCTTttaggaaaggactgccccgccatcaatgacaaccg，然后以Bacilluscoagulans NL01基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得全长789bp的短链脱氢酶基因序列。

所述的短链脱氢酶BLSDR1和其他已知的羰基还原酶的同源性(即氨基酸序列相似性)见表1，其氨基酸序列如序列表中序列2所示，和已知的羰基还原酶氨基酸序列相似性低于50％，具有显著性差异。

本发明还提供一种包含上述短链脱氢酶的基因的核苷酸序列的各种重组表达载体。这些重组载体通过将包含本发明的短链脱氢酶核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒，粘粒，噬菌体或病毒载体等，优选pETDuet-1。较佳的，可通过下述方法获得本发明的重组表达载体；将通过PCR扩增所得的短链脱氢酶基因产物blsdr1与载体pETDuet-1连接构建本发明的短链脱氢酶基因重组表达质粒pETDuet-blsdr1。

本发明还提出了包含上述重组表达载体的重组表达转化体，通过将上述重组表达载转化至宿主细胞中得到。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的短链脱氢酶基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。将重组质粒pETDuet-blsdr1转化至E.coli BL21(DE3)中，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-blsdr1。

本发明还提出了上述短链脱氢酶的制备方法，通过培养上述的重组表达转化体，诱导获得重组短链脱氢酶。

具体地，所述的培养重组表达转化体所用的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2。培养方法和培养条件没有限制，只要使转化体能够生长并产生短链脱氢酶即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-BLSDR1，接种至含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，当培养液中光密度OD₆₀₀达到0.5-0.8时，在终浓度为0.1-1.0mM的异丙基-D-硫代吡喃半乳糖糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组短链脱氢酶。

本发明还提出了上述短链脱氢酶在催化还原羰基化合物形成相应醇上的应用。利用本发明的短链脱氢酶或者包含此酶的重组表达转化体催化还原多种羰基化合物(主要包括苯甲醛，己醛，糠醛，乙偶姻，苯乙酮等，但不限于此)。其中，短链脱氢酶或者包含该酶的重组表达转化体作为生物催化剂，可以以全细胞、粗酶粉、酶溶液、固定化酶等多种形式参与催化反应，且此方法可在0％-30％的有机溶剂，其中，所述有机溶剂主要包括甲醇，乙醇，丙酮等有机溶剂。

上述应用中，所述的还原羰基化合物的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下：所述的蛋白质优选具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的短链脱氢酶(命名为BLSDR1)，所述的菌体优选包含此酶的重组表达转化体，所述的羰基化合物较佳的为含有醛基或者酮基的烃类或芳香类化合物，优选己醛，糠醛，乙偶姻，苯甲醛，苯乙酮。在PH 4.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液中，优选pH7.0，在NADH或NADPH或葡萄糖作为氢供体，优选NADH和葡萄糖，在所述的酶或包含此酶的重组表达转化体作为催化剂的条件下进行羰基化合物的还原反应。上述反应还可以在0％-30％的有机溶剂条件下进行的应用，优选体积比10％甲醇，10％乙醇，10％丙酮。

有益效果：本发明从凝结芽孢杆菌克隆得到了一个新的短链脱氢酶基因blsdr1，可在宿主细胞中表达这种基因以生产这种短链脱氢酶，此短链脱氢酶或重组表达转化体可在一定浓度的有机溶剂下保持活力，并且可以用于酮醛类化合物的还原。

附图说明

图1为基因blsdr1的PCR扩增电泳图谱；

图2为重组短链脱氢酶BLSDR1的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中，泳道1为标准分子量蛋白，泳道5为包含空质粒pETDuet的E.coli BL21(DE3)对照菌株粗酶液，泳道3和4为包含重组质粒pETDuet-blsdr1的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株诱导表达后的粗酶液，泳道2为重组短链脱氢酶BLSDR1使用HisTrap^TMHP亲和层析柱进一步纯化结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：Bacillus coagulans NL01短链脱氢酶基因的获得、重组质粒构建及转化大肠杆菌。

采用常规的方法制备凝结芽孢杆菌NL01的基因组DNA，该过程可参照TakaraMiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒说明书步骤，提取凝结芽孢杆菌NL01基因组DNA。

设计引物，引入能插入质粒pETDuet-1的BamHI和HindIII的限制酶切位点，所设计的blsdr1的引物序列如下：

上游引物5’-GGCCTTGGATCCGatgcaaacatttgatttcacaggaaaagttgcaatcgtaa-3’(Bam HI)

下游引物5’-AATTTTTAAAAGCTTttaggaaaggactgccccgccatcaatgacaaccg-3’(HindIII)

以提取的凝结芽孢杆菌NL01的基因组为模板，利用上述引物进行扩增，扩增得到短链脱氢酶基因序列blsdr1。短链脱氢酶基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果见附图1。

PCR产物由BamHI/HindIII进行双酶切，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，然后用T4连接酶将该片段同用相同限制性内切酶处理的商业化载体pETDuet-1连接，构建重组表达质粒pETDuet-blsdr1。

将上述构建的重组表达转化体pETDuet-blsdr1分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-blsdr1，涂布于氨苄青霉素的平板，37℃培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR验证，阳性克隆测序验证，结果表明重组表达载体pETDuet-blsdr1各自都成功转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)中，且短链脱氢酶基因成功克隆至pETDuet-1的BamHI和HindIII位点。

实施例2：重组短链脱氢酶的诱导表达。

实施例1构建的工程菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-blsdr1接种至含50ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以1％接种量(v/v)接种到含50ug/mL氨苄青霉素的50mL LB培养基中，37℃，200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.6-0.8左右，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃诱导培养5h后，4℃，8000rpm离心5min收集菌体，于-20℃储存备用。

实施例3：重组短链脱氢酶的分离纯化。

实施例2收集的菌体细胞悬浮于10mL Na₂HPO4-NaH₂PO₄缓冲液(100mM，pH 7.4)中，振荡摇匀后置超声波下破碎(有效时间8min)。破碎液于12000 rpm离心20min去除细胞碎片，收集上清液(粗酶液)用于酶的分离纯化。纯化柱为HisTrap^TMHP，装柱体积为5mL，先用上样平衡缓冲液(20mM磷酸钠，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 7.4)洗脱收集目标蛋白，最后用洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，500mM NaCl和500mM咪唑，pH 7.4)洗脱收集目标蛋白。酶液用20KDa超滤管进行脱盐，脱盐缓冲液为Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(100mM，pH 7.4)缓冲液，所得纯酶液于4℃贮存备用。纯化后的酶液为SDS-PAGE进行分析，SDS-PAGE电泳见图2，结果表明经分离纯化以后，得到电泳纯的重组短链脱氢酶BLSDR1。表1为本发明的短链脱氢酶与其他已知的羰基还原酶的同源性。

表1本发明的短链脱氢酶与其他已知的羰基还原酶的同源性

实施例4：重组短链脱氢酶BLSDR1还原酮醛类物质的酶活测定。

以各类酮醛类物质为底物，重组短链脱氢酶的活力测定根据NAD(P)H的减少来计算，酶活力(U)定义为：在测定条件下，每分钟催化氧化1μmol的NAD(P)H所需的酶量。

酶活测定体系及计算方法如下：

1mL反应体系中含有5mM酮醛底物，0.4mM NADH，50uL的酶液，磷酸钠缓冲液(100mMpH7.0)。室温条件下，1min内，每隔5s读取340nm处吸光值的变化来计算酶活。其酶活公式如下：

酶活U＝(ΔΑ×V×10³)/(6220×l)

ΔΑ为1min内吸光值的变化，V为反应液的体积，6220为NADH在340nm处的摩尔消光系数，L·mol^-1·cm^-1，l为光程距离，cm。

比酶活计算公式：

比酶活(U/mg)＝酶活(U/mL)/蛋白浓度(mg/mL)

所计算出的BLSDR1对各类酮醛类物质酶活如表2所示。其中，BLSDR1对苯甲醛，己醛，糠醛，苯乙酮，乙偶姻有酶活。

表2NADH作为辅酶，短链脱氢酶BLSDR1的酶活

实施例5：重组短链脱氢BLSDR1有机溶剂酶活保留。

分别选用不同体积浓度(10％，20％，30％)的甲醇，乙醇，丙酮作为反应压力，以己醛作为底物，测试方法同实施例4，测试BLSDR1的酶活，得到的保留的酶活如下表3所示。

表3BLSDR1的有机溶剂耐受性(底物：己醛)

本发明提供了一种短链脱氢酶及其编码基因和应用，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种短链脱氢酶BLSDR1及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 789

<212> DNA

<213> 短链脱氢酶编码基因(Artificial Sequence)

<400> 1

ttaggaaagg actgccccgc catcaatgac aaccgtttgc ccaatgatat gggaagacag 60

gtctgatgca agatagagca gaacattcgc cacttcttcc ggttgtgtat agcggccagt 120

cggggcggat gcagccattt gctgcctcgt ttgttcagca gctgctgaat cacctccggc 180

aaaaccgctt tcaatttttc tcatcatttc tgtgtccaca acccctggac ataccgcatt 240

gacacggacg ccggacggag ctgcctcaat tcctgccgtt ttcgtcatgc cgatcaccgc 300

atgcttactg gcgccgtatg ccaccatttc cggtgtgccg acgaggccgg caacagaagc 360

cgtattgaca atggtgccgc ttttttggct gatcatatgc ggcaacacat acttcatacc 420

aagaaagacg ccgcgtacat taatgcccat cagtttatca aatacttctt cgggataatc 480

tatgagcggt ttcatctttc cttcccaacc agcattgttt aaaagaatat caatttttcc 540

ataagtatct agcgcagttc ggacgtaatg ttggacatct ttggatttgg aaacatcggt 600

ccggacaaaa atcgcttccc caccattttc acggattttt ccagccgttt cttctcccaa 660

ttcatcagat aaatcagcga ccacgacatt tgctccgccc gcagccagtt tcaagcatgc 720

ttcgcggccg attcctcccc cgccgccggt tacgattgca acttttcctg tgaaatcaaa 780

tgtttgcac 789

<210> 2

<211> 262

<212> PRT

<213> 短链脱氢酶BLSDR1氨基酸序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gln Thr Phe Asp Phe Thr Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ile Gly Arg Glu Ala Cys Leu Lys Leu Ala Ala Gly Gly

20 25 30

Ala Asn Val Val Val Ala Asp Leu Ser Asp Glu Leu Gly Glu Glu Thr

35 40 45

Ala Gly Lys Ile Arg Glu Asn Gly Gly Glu Ala Ile Phe Val Arg Thr

50 55 60

Asp Val Ser Lys Ser Lys Asp Val Gln His Tyr Val Arg Thr Ala Leu

65 70 75 80

Asp Thr Tyr Gly Lys Ile Asp Ile Leu Leu Asn Asn Ala Gly Trp Glu

85 90 95

Gly Lys Met Lys Pro Leu Ile Asp Tyr Pro Glu Glu Val Phe Asp Lys

100 105 110

Leu Met Gly Ile Asn Val Arg Gly Val Phe Leu Gly Met Lys Tyr Val

115 120 125

Leu Pro His Met Ile Ser Gln Lys Ser Gly Thr Ile Val Asn Thr Ala

130 135 140

Ser Val Ala Gly Leu Val Gly Thr Pro Glu Met Val Ala Tyr Gly Ala

145 150 155 160

Ser Lys His Ala Val Ile Gly Met Thr Lys Thr Ala Gly Ile Glu Ala

165 170 175

Ala Pro Ser Gly Val Arg Val Asn Ala Val Cys Pro Gly Val Val Asp

180 185 190

Thr Glu Met Met Arg Lys Ile Glu Ser Gly Phe Ala Gly Gly Asp Ser

195 200 205

Ala Ala Ala Glu Gln Thr Arg Gln Gln Met Ala Ala Ser Ala Pro Thr

210 215 220

Gly Arg Tyr Thr Gln Pro Glu Glu Val Ala Asn Val Leu Leu Tyr Leu

225 230 235 240

Ala Ser Asp Leu Ser Ser His Ile Ile Gly Gln Thr Val Val Ile Asp

245 250 255

Gly Gly Ala Val Leu Ser

260

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> blsdr1上游引物(Artificial Sequence)

<400> 3

ggccttggat ccgatgcaaa catttgattt cacaggaaaa gttgcaatcg taa 53

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> blsdr1下游引物(Artificial Sequence)

<400> 4

aatttttaaa agcttttagg aaaggactgc cccgccatca atgacaaccg 50

Claims

1.短链脱氢酶BLSDR1在以体积比为30%的甲醇作为有机溶剂的条件下催化还原己醛生成相应醇上的应用，其特征在于，所述短链脱氢酶BLSDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，在应用时，以NADH或NADPH或葡萄糖作为氢供体，在所述的短链脱氢酶或包含此酶的重组表达转化体作为催化剂的条件下进行己醛的还原反应。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组表达转化体通过将重组表达载体转化至宿主细胞中得到，所述重组表达载体包括编码所述短链脱氢酶BLSDR1的基因和载体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体中的任意一种。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。