KR102291199B1 - (ｒ)-3-퀴누클리디놀의 생체촉매적 제조방법 - Google Patents

(ｒ)-3-퀴누클리디놀의 생체촉매적 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 옥시도리덕타제가 아미노산 서열 모티프 MQX1REX2X3WEA(여기서, 각각의 X1, X2, X3은 아미노산 잔기 A(Ala), R(Arg), N(Asn), D(Asp), C(Cys), Q(Gln), E(Glu), G(Gly), H(His), I(lle), L(Leu), K(Lys), M(Met), F(Phe), P(Pro), S(Ser), T(Thr), W(Trp), Y(Tyr) 또는 V(Val) 중 어느 하나이다)를 포함함을 특징으로 하는, 보조인자 및 옥시도리덕타제를 사용하는 퀴누클리딘-3-온의 환원에 의해 (R)-3-퀴누클리디놀을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

(Ｒ)-3-퀴누클리디놀의 생체촉매적 제조방법{BIOCATALYTIC PROCESS FOR THE PRODUCTION OF (R)-3-QUINUCLIDINOL}
본 발명은 보조인자로서 NADH를 사용하여 퀴누클리딘-3-온을 신규 옥시도리덕타제와 반응시킴을 포함하는, 높은 광학 순도의 (R)-3-퀴누클리디놀((3R)-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥탄-3-올, CAS #: 25333-42-0) 또는 이의 염(CAS #: 42437-96-7)의 제조 방법에 관한 것이다.
Figure 112015105446897-pct00001
(R)-3-퀴누클리디놀[(3R)-1-아자바이사이클로[2.2.2]옥탄-3-올]
(R)-3-퀴누클리디놀은 광범위한 약제의 합성을 위한 귀중한 중간체이다. 약제 산업에서, 이는 예를 들면 인지 개선제 탈사클리딘, 요실금제 솔리페나신 또는 천식 치료용 M3 갈항제 레바트로페이트를 위한 키랄 신톤으로서 사용된다. 금속 촉매를 사용하는 화학적 환원 반응[참조: JPH9-194480A], 효소적 가수분해 반응에 의한 (±)-3-퀴누클리디놀 에스테르의 라세미 혼합물의 분해[참조: US5215918B, JPH10-136995A, JPH10-210997A, JPH9-194480A] 및 전세포 생체촉매 또는 단리된 효소를 사용하는 퀴누클리딘-3-온의 효소적 환원[참조: JP10243795, JP11196890, JP2002153293, JP2000245495]과 같은 광학 활성 퀴누클리디놀을 수득하기 위한 상이한 방법들이 공지되어 있다.
금속 촉매를 이용하는 환원을 통한 광학적으로 순수한 (R)-3-퀴누클리디놀의 제조는, 환원 생성물의 광학 순도가 낮고 순수한 에난티오머를 수득하기 위해 추가의 정제 단계가 요구되기 때문에, 산업적 용도에 부적절한 효능을 제공하는 것으로 보고되었다.
프로테아제를 이용하는 (±)-3-퀴누클리디놀 에스테르의 라세미 혼합물의 분해를 통한 광학적으로 순수한 (R)-3-퀴누클리디놀의 제조도 또한, 라세미 혼합물로부터 잔류 에스테르를 제거해야만 하는 필요성 및 이와 연관된 고비용으로 인해 산업적 용도에 적합하지 않다.
전세포 생물전환(whole biotransformation)을 경유하는 퀴누클리딘-3-온의 효소적 환원을 통한 광학적으로 순수한 (R)-3-퀴누클리디놀의 제조가 나카자에와에아(Nakazaewaea) 속, 칸디다(Candida) 속, 프로테우스(Proteus) 속, 로도토룰라(Rhodotorula) 속, 스포리디올로부스(Sporidiolobus) 속, 로도스포리듐(Rhodosporidium) 속, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속, 크립토코커스(Cryptococcus) 속, 트리키스포론(Trichisporon) 속, 고르도니아(Gordonia) 속, 노카르디아(Nocardia) 속, 알칼리제네스(Alcaligenes) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 아트로박터(Arthrobacter) 속, 필로바시스듐(Filobasisdium) 속, 아우레오바시듐(Aureobasidium) 속, 야로위아(Yarrowia) 속, 게오트리쿰(Geotrichum) 속, 츠카무렐라(Tsukamurella) 속, 쿠르티아(Kurthia) 속, 마이크로박테리움(Microbacterium) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 아크레모늄(Acremonium) 속 및 무코르(Mucor) 속의 세포에 대해 보고된 바 있다[참조: JP10243795, JP11196890, JP2002153293, JP2000245495]. 미생물 세포로부터 초래된 불순물 및/또는 미생물 내에 함유된 다른 효소에 의해 발생한 부작용은 광학 순도 및 생산 수율을 저하시킨다.
단리된 효소를 사용하는 산화환원 과정을 통한 (R)-3-퀴누클리디놀의 제조도 또한 당업계에 공지되어 있으며 다투라(Datura) 속 및 히요스키아무스(Hyoscyamus) 속(특허 JP2003230398)의 식물로부터의 효소 뿐만 아니라 로도토룰라 (JP2007124922), 부르콜데리아(Burkholderia)(WO2010123062) 및 마이코박테리움 루테올룸(Microbacterium luteolum)[참조: Int J Mol Sci. 2012 Oct 19;13(10):13542-53]으로부터의 효소에 대해 보고된 바 있다. 최근에, 퀴누클리딘-3-온을 환원시키는 알코올 데하이드로게나제가 아그로박테리움 투메르파시엔스(Agrobacterium tumerfacience)[참조: Acta crystallografica 10(2012) 68(Pt 10): 1237-1239]으로부터 결정화되었다.
식물 기원으로 인해, 다투라 및 히요스키아무스로부터 유래된 효소들은 산업적으로 제조하기 어렵다. 로도토룰라 및 부르콜데리아로부터 기원하는 효소는 보조인자로서 값비싼 NADPH 및 NADPH 재생을 위한 글루코스 데하이드로게나제를 필요로 하고 따라서 제조 방법이 매우 고비용이 된다.
지금까지, (R)-3-퀴누클리디놀의 가장 효율적인 제조 방법은 마이크로박테리움 루테올룸으로부터의 효소를 사용하는 환원 방법에 대해 이소타니(Isotani) 등[참조: Int J Mol Sci. 2012 Oct 19;13(10):13542-53]에 의해 보고되었다. 마이크로박테리움 루테올룸으로부터 유래된 효소는 보조인자로서의 NADH 및 보조인자 재생을 위한 2차 알코올 데하이드로게나제와 함께 보조기질로서 2-프로판올을 필요로 한다. 그러나, 상기 효소적 환원 방법에서는, 추정상 효소 활성에 미치는 퀴누클리딘-3-온의 저해 효과로 인해서 기질 부하가 제한된다. 기질을 반응 뱃치에 연속적으로 첨가하여 반응 용기 중의 퀴누클리딘-3-온 농도 및 수반되는 효소 저해를 적절한 수준으로 유지시킴으로써 10%(w/v)의 최대 기질 부하가 달성될 수 있다. 고정화된 효소를 사용하여 15%(w/v) 기질 부하에서 100%의 전환 수율이 달성되었다. 그러나, 효소의 고정화는 정교하고 고비용이며 반응 용적을 제한하여, 이는 산업적 제조 방법의 요건에 적합하지 않다.
퀴누클리딘-3-온의 환원을 위한 공지된 효소의 수는 한정되어 있다. 게다가, 이러한 효소들은 시중에서 구입가능하지 않으며, 상응하는 환원 방법은 큰 결점을 갖고 있다. 따라서, 효율적이고 산업적으로 적용가능한, 신규한 재조합 옥시도리덕타제를 환원 반응에서 생체촉매로서 사용하는 (R)-3-퀴누클리디놀의 제조 방법이 필요하다.
3-퀴누클리디논을 위한 산업적 환원 방법에 적합한 옥시도리덕타제는 하기 요건들을 충족시켜야 한다:
1) 재조합 균주(예를 들어, 에스케르키아 콜라이(Escherichia coli))에서의 적합한 발현;
2) 유기 용매, 특히 2-프로판올 및 2-부탄올과 같은 수혼화성 유기 용매 중에서의 높은 안정성;
3) 기질 또는 생성물 저해에 의해 악영향을 받지 않으면서 고농도의 기질 3-퀴누클리디논에서의 효소 활성;
4) 효소-커플링된 보조인자 재생, 특히 보조기질로서 2차 알코올을 사용하는 알코올 데하이드로게나제를 통한 보조인자 재생에 따름.
본 발명은 보조인자 및 단리된 옥시도리덕타제를 사용하여 퀴누클리딘-3-온 또는 이의 염을 환원시킴으로써 (R)-3-퀴누클리디놀을 제조하는 방법, 상기 옥시도리덕타제를 발현하는 재조합 유기체 또는 상기 옥시도리덕타제를 발현하는 유기체, 예를 들면, 이의 투과성화된, 용해된 또는 동결건조된 세포의 제조를 제공하는 것을 목적으로 한다. 상기 옥시도리덕타제는 다음으로부터 선택된다:
a) 서열목록의 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드;
b) 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 첨가된 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9로부터 유래된 아미노산 서열을 갖고 보조인자와 함께 퀴누클리딘-3-온을 환원시킬 수 있는 폴리펩타이드;
c) 적어도 51%의 아미노산이 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 9의 아미노산과 동일한, 바람직하게는 적어도 55%의 아미노산이 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 9의 아미노산과 동일하거나 적어도 60%의 아미노산이 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 9의 아미노산과 동일하거나 적어도 65%의 아미노산이 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 9의 아미노산과 동일하거나 적어도 70%의 아미노산이 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 9의 아미노산과 동일하거나 바람직하게는 적어도 75%의 아미노산이 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 9의 아미노산과 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 아미노산이 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 9의 아미노산과 동일한, 가장 바람직하게는 적어도 90%의 아미노산이 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 9의 아미노산과 동일한 아미노산 서열을 갖고 보조인자와 함께 퀴누클리딘-3-온을 환원시킬 수 있는 폴리펩타이드;
d) 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 75% 또는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 가장 바람직하게는 적어도 90%의 아미노산이 서열번호 7의 아미노산과 동일한 아미노산 서열을 갖고 보조인자와 함께 퀴누클리딘-3-온을 환원시킬 수 있는 폴리펩타이드;
e) 서열목록의 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드;
f) 엄중한(stringent) 조건하에 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열의 전체길이 상보체와 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되고 보조인자와 함께 퀴누클리딘-3-온을 환원시킬 수 있는 폴리펩타이드; 또는
g) 아미노산 서열 모티프 MQX1REX2X3WEA(여기서, 각각의 X1, X2, X3은 아미노산 잔기 A(Ala), R(Arg), N(Asn), D(Asp), C(Cys), Q(Gln), E(Glu), G(Gly), H(His), I(lle), L(Leu), K(Lys), M(Met), F(Phe), P(Pro), S(Ser), T(Thr), W(Trp), Y(Tyr) 또는 V(Val) 중 어느 하나이다)를 추가로 포함하는 a), b), c), d), e) 또는 f)에 따르는 폴리펩타이드.
바람직하게는, 옥시도리덕타제는 보조인자 NADH 또는 NADPH와 함께 사용된다.
a), b), c), d), e), f) 또는 g)에 따르는 본 발명의 폴리펩타이드가 퀴누클리딘-3-온을 이의 상응하는 (R)-알코올로 효율적으로 환원시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 놀랍게도, 본 발명의 폴리펩타이드들간의 서열 상동성(동일성)(표 1 참조)은 48% 내지 72%로 다양하다. 그러나, 본 발명의 폴리펩타이드들은 퀴누클리딘-3-온의 환원에서 이들 단백질의 효소 활성을 위한 특징이 되는 특정한 아미노산 서열 모티프 MQX1REX2X3WEA를 공통적으로 갖는다.
Figure 112015105446897-pct00002
서열 모티프 MQX1REX2X3WEA는 단백질의 C-말단 가까이에 위치한다. 이러한 발견은 공지된 단쇄 알코올 데하이드로게나제의 결정 구조 및 이에 기초한 상동성 모델링과 일치하며, 상기 모델링은 상기 모티프가 상기 데하이드로게나제의 기질 결합 포켓의 테일을 형성하고 아미노 잔기 M, Q, R, E, W, E 및 A가 기질과 상호작용한다는 것을 보여준다. 따라서, 상기 모티프 MQX1REX2X3WEA를 포함하는 단쇄 알코올 데하이드로게나제는 퀴누클리딘-3-온의 환원에 적합하다고 가정된다.
퀴누클리딘-3-온의 바람직하게는 상응하는 R-알코올로의 환원에 적합한 옥시도리덕타제는 최적화된 반응 조건 하에 적어도 50%의 R-알코올의 에난티오머 과량(enantiomeric excess)을 산출하는 폴리펩타이드인 것으로 이해된다. 본원에서, 최적화된 반응 조건은 폴리펩타이드가 R-알코올의 최대 에난티오머 과량을 산출하도록 하는 반응 조건인 것으로 이해된다.
본 발명의 폴리펩타이드는 적절한 옥시도리덕타제 활성을 제공하고 퀴누클리딘-3-온을 바람직하게는 (R)-3-퀴누클리디놀로 환원시키는데 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. R-알코올의 달성가능한 에난티오머 과량은 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상 및 특히 바람직하게는 95% 이상에 달한다. 서열번호 1을 사용하는 경우, 99% 이상의 에난티오머 과량이 달성될 수 있다.
퀴누클리딘-3-온을 상응하는 (R)-3-퀴누클리디놀로 환원시킬 수 있는 옥시도리덕타제는 마이코박테리움 속의 세균, 특히 마이코박테리움 반발레니 또는 마이코박테리움 스메그마티스, 칼딜리네아 속의 세균, 특히 칼딜리네아 아에로필라, 스타르케야 속의 세균, 특히 스타르케야 노벨라, 오셔니테르무스 속의 세균, 특히 오셔니테르무스 프로펀덤으로부터 단리될 수 있다.
본 발명의 옥시도리덕타제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 공지된 분자생물학 기술을 사용하여 예를 들면, 세균 마이코박테리움 반발레니 균주 PYR-1의 게놈 DNA 또는 마이코박테리움 스메그마티스 균주 ATCC 700084, 칼딜리네아 속의 세균, 특히 칼딜리네아 아에로필라 균주 DSM 14535, 스타르케야 속의 세균, 특히 스타르케야 노벨라 균주 DSM 506, 오셔니테르무스 속의 세균, 특히 오셔니테르무스 프로펀덤으로부터 수득될 수 있다.
옥시도리덕타제를 생산하는 유기체는 바람직하게는 옥시도리덕타제를 과발현하는 재조합 유기체이다. 바람직하게는, 이에 제한되지는 않지만, 이러한 재조합 유기체는 에스케리키아 콜라이이다. 재조합 유기체에 의해 발현되는 옥시도리덕타제는 완전히 정제된 상태로, 부분적으로 정제된 상태로 또는 상기 폴리펩타이드를 함유하는 세포로서 이용될 수 있다. 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세포는 본래의, 투과성화된, 용해된 또는 동결건조된 상태로 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양상은 보조인자를 사용하여 퀴누클리딘-3-온을 이의 상응하는 알코올로 에난티오머선택적으로(enantioselectively) 환원시킬 수 있는 옥시도리덕타제, 상기 옥시도리덕타제를 생산하는 유기체 또는 상기 옥시도리덕타제를 발현하는 유기체, 예를 들면, 이의 투과성화된, 용해된 또는 동결건조된 세포의 제조이다. 이러한 옥시도리덕타제는 다음으로부터 선택된다:
a) 서열목록의 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드;
b) 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 첨가된 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드;
c) 적어도 51%의 아미노산이 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드;
d) 적어도 55%의 아미노산이 서열번호 5 또는 서열번호 9의 아미노산과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드;
e) 적어도 70%의 아미노산이 서열번호 7의 아미노산과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드;
f) 서열목록의 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드;
g) 엄중한(stringent) 조건하에 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 전체길이 상보체와 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드; 또는
h) 아미노산 서열 모티프 MQX1REX2X3WEA(여기서, 각각의 X1, X2, X3은 아미노산 잔기 A(Ala), R(Arg), N(Asn), D(Asp), C(Cys), Q(Gln), E(Glu), G(Gly), H(His), I(lle), L(Leu), K(Lys), M(Met), F(Phe), P(Pro), S(Ser), T(Thr), W(Trp), Y(Tyr) 또는 V(Val) 중 어느 하나이다)를 추가로 포함하는 a), b), c), d), e) 또는 f)에 따르는 폴리펩타이드.
바람직하게는, 옥시도리덕타제는 보조인자 NADH 또는 NADPH와 함께 사용된다.
본 발명에서, "(P)% 백분율의 아미노산이 서열번호 (N)의 아미노산 서열 중 아미노산과 동일한 아미노산 서열 (A)"이란 용어는 아미노산 서열 (A) 및 서열번호 (N)이 이들의 전체길에 걸쳐서 정렬되고 정렬된 아미노산 서열 (A) 및 정렬된 서열번호 (N) 중 어느 하나가 이들 각각의 비정렬된 서열과 비교해 갭(gap) 삽입을 포함할 수 있는 것을 의미한다. 동일성 %는 정렬된 아미노산 서열 (A) 및 정렬된 서열번호 (N) 둘 다에서 동일한 아미노산 잔기가 발생한 위치의 수를 측정하고 매치된 위치의 수를 기준 서열 내의 잔기의 총수로 나눠 계산한다. 그 결과에 100을 곱하면 동일성 %가 산출된다. 서열들의 정렬은 문헌[참조: Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402 and Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410]에 기술되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘을 사용하여 실시될 수 있다.
본 발명에서 b), c), d), f) 또는 g)에 따르는 폴리펩타이드, 즉 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 아미노산 서열과 상동성이거나 이로부터 유래된 아미노산 서열을 갖거나, 엄중한 조건하에 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 전체길이 상보체와 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 인공 또는 천연발생 폴리펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9와 비교해 "결실된 아미노산"(결실), "치환된 아미노산"(치환) 또는 "삽입된 아미노산"(삽입)을 포함하는 폴리펩타이드이다.
"결실된 아미노산" 또는 "결실"이란 용어는 하나 이상의 아미노산의 제거에 의한 폴리펩타이드의 변형을 지칭한다. 결실은 효소 활성을 유지하면서 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 내부 및/또는 말단 부분 둘 다에서 아미노산의 총수의 10% 이하까지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개 또는 그 이상의 아미노산이 제거됨을 포함할 수 있다.
"삽입"이란 용어는 하나 이상의 아미노산의 첨가에 의한 폴리펩타이드의 변형을 지칭한다. 삽입은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 내부 및/또는 말단 부분의 다양한 위치에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개 또는 그 이상의 아미노산이 폴리펩타이드에 첨가됨을 포함할 수 있다.
치환은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9에서의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개 또는 그 이상의 아미노산의 대체를 지칭하며 보존적 및/또는 비보존적일 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖거나 동일한 아미노산 부류에 속하는 아미노산 잔기로 대체되는 것, 예를 들면, 친수성 아미노산 잔기에서 친수성 아미노산 잔기로, 소수성 아미노산 잔기에서 소수성 아미노산 잔기로, 비극성 아미노산 잔기에서 비극성 아미노산 잔기로, 극성 아미노산 잔기에서 극성 아미노산 잔기로, 산성 아미노산 잔기에서 산성 아미노산 잔기로, 염기성 아미노산 잔기에서 염기성 아미노산 잔기로, 방향족 아미노산 잔기에서 방향족 아미노산 잔기로 대체되는 것을 지칭한다. 보존적 치환의 예는 하기 표에 언급되어 있다.
Figure 112015105446897-pct00003
비보존적 치환은 폴리펩타이드 내의 아미노산이 현저하게 상이한 측쇄 및/또는 물리화학적 특성을 갖는 아미노산으로 대체되는 것을 지칭한다. 비보존적 아미노산 치환은 폴리펩타이드의 구조, 이의 소수성 및/또는 이의 순전하에 영향을 줄 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 각각의 1번 내지 282번 위치에 꺽쇠괄호 안의 상응하는 선택 그룹 [...]로부터 선택된 하나의 아미노산을 포함하는 이하 언급되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 관한 것이고, 여기서 "-"는 갭을 나타낸다:
Figure 112015105446897-pct00004
Figure 112015105446897-pct00005
Figure 112015105446897-pct00006
Figure 112015105446897-pct00007
Figure 112015105446897-pct00008
Figure 112015105446897-pct00009
Figure 112015105446897-pct00010
폴리펩타이드 서열 내의 아미노산 변형의 수는 폴리펩타이드의 촉매 활성을 유지하거나 개선시키면서 아미노산의 총수의 최대 10% 또는 20% 또는 심지어 30%까지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
엄중한 조건 하에, 예를 들면, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 전체길체 상보체와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드는 하이브리드화 프로브로서 서열번호 2의 상보적 전체길이 DNA를 사용함으로써 콜로니 하이브리드화, 플라크 하이브리드화, 서던 하이브리드화와 같은 다양한 하이브리드화 기술을 통해 검출가능한 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 적합한 하이브리드화 방법은 문헌[참조: Molecular Cloning, A laboratory manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기술되어 있다.
하이브리드화를 위해, 조사 중인 폴리뉴클레오타이드를 필터 상에 고정시키고 60℃에서 0.7 내지 1M NaCl 용액 중에서 예를 들면 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 상보체에 하이브리드시킨다. 이어서, 상기 필터를 65℃에서 0.1배 내지 2배 SSC 용액으로 세척하고, 여기서 1배 SSC 용액은 150mM NaCl 및 15mM 시트르산나트륨으로 이루어진 혼합물인 것으로 이해된다.
엄중한 조건하에 예를 들면 서열번호 2의 상보체에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 70%의 뉴클레오타이드가 서열번호 2의 뉴클레오타이드와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시형태는 본 방법에서 사용되는 보조인자가 2차 알코올의 존재하에 옥시도리덕타제의 작용에 의해 연속적으로 재생됨을 특징으로 한다. 바람직하게는, NADH가 보조인자로서 사용되고 환원시에 형성된 NAD는 NADH로 다시 환원된다.
NADH에 대한 옥시도리덕타제의 보조인자 선호는 NADPH에 대한 선호로 변화될 수 있으며, 보존인자 결합 부위를 돌연변이시키는 돌연변이유발 기술을 사용함으로써 역전될 수 있다.
본 발명에 따르는 방법에서, 옥시도리덕타제/데하이드로게나제에 의해 형성된 산화된 보조인자 NAD 또는 NADP는 바람직하게는 연속적으로 재생된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따라서, 산화된 보조인자 NAD 또는 NADP는 알코올의 산화에 의해 재생된다.
바람직하게는, 화학식 RxRyCHOH의 2차 알코올이 보조인자 재생을 위해 사용되며, 여기서 Rx 및 Ry는 독립적으로 수소, 분지된 또는 비분지된 C1-C8-알킬 그룹으로부터 선택되고, 탄소 원자의 총수는 C총>=3이다.
2-프로판올, 2-부탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-헵탄올, 2-옥탄올 또는 사이클로헥산올과 같은 2차 알코올이 바람직하게는 보조기질로서 사용된다. 특히 바람직한 실시형태에 따라서, 2-프로판올 또는 4-메틸-2-펜탄올이 조효소 재생을 위해 사용된다. 재생을 위한 보조기질의 양은, 수혼화성 2차 알코올의 경우, 반응 뱃치(reaction batch)의 총 용적을 기준으로 5 내지 70용적%, 바람직하게는 5 내지 50용적%, 보다 바람직하게는 5 내지 40용적%, 가장 바람직하게는 5 내지 20용적%의 범위일 수 있는 반면에, 메틸-2-펜탄올과 같은 수불혼화성 2차 알코올의 경우, 바람직한 농도는 반응 뱃치의 총 용적을 기준으로 5 내지 80%, 보다 바람직하게는 20 내지 80%, 가장 바람직하게는 40 내지 80%의 범위이다.
본 발명에 따르는 방법의 추가의 바람직한 실시형태에 따라서, 추가의 옥시도리덕타제/데하이드로게나제가 보조인자의 재생을 위해 첨가된다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 추가의 알코올 데하이드로게나제가 보조인자의 재생을 위해 또한 첨가될 수 있다. 적합한 NADH-의존적 알코올 데하이드로게나제는 예를 들면, 빵 효모, 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis)(CPCR)[참조: 미국 특허 제5,523,223호 및 제5,763,236호, 문헌: Enzyme Microb. Technol., 1993, 15(ll):950-8], 피치아 캡슐라타(Pichia capsulata)(EP1633779B1), 로도코커스 에리스로폴리스(Rhodococcus erythropolis)(RECR)(미국 특허 제5,523,223호), 노르카르디아 푸스카(Norcardia fusca)[참조: Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10), 1999, p. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, 62(4):380-6; Epub 2003, Apr. 26] 또는 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber)[참조: J. Org. Chem., 2003, 68(2):402-6]로부터 수득될 수 있다. 이러한 알코올 데하이드로게나제에 적합한 보조기질은, 예를 들면, 이미 언급한 2-프로판올(이소프로판올), 2-부탄올, 2-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-옥탄올 또는 사이클로헥산올과 같은 2차 알코올이다.
NADPH의 재생을 위해 적합한 2차 알코올 데하이드로게나제는 예를 들면, 락토바실라레스(Lactobacillales) 목의 유기체, 예를 들면, 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir)(미국 특허 제5,200,335호), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)(DE 19610984 A1; 문헌: Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000 December; 56 Pt 12:1696-8), 락토바실러스 마이너(Lactobacillus minor)(DE 10119274), 류코노스톡 카르노숨(Leuconostoc carnosum)(A 1261/2005, Kl. C12N)으로부터 단리된 전술한 바와 같은 것들 또는 써모아네로비움 브로키(Thermoanerobium brockii), 써모아네로비움 에타놀리쿠스(Thermoanerobium ethanolicus) 또는 클로스트리듐 베이제린키(Clostridium beijerinckii)로부터 단리된 전술한 바와 같은 것들이다.
그러나, 원칙적으로 다른 효소 시스템을 보조인자 재생을 위해 사용할 수도 있다. 예를 들면, 보조인자 재생은 NAD-의존적 또는 NADP-의존적 포르메이트 데하이드로게나제를 사용하여 수행할 수 있다[참조: Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase]. 포르메이트 데하이드로게나제의 적합한 보조기질은, 예를 들면, 포름산암모늄, 포름산나트륨 또는 포름산칼슘과 같은 포름산의 염이다.
1kg의 기질 퀴누클리딘-3-온의 전환을 위해, 5000 내지 10,000,000유닛(Unit)의 옥시도리덕타제가 적용되어야 한다. 효소 활성 단위(U)는 분당 1μmol의 퀴누클리딘-3-온을 상응하는 알코올로 전환시키기 위해 요구되는 효소의 양으로서 정의된다.
본 발명에 따르는 방법에서, 기질 퀴누클리딘-3-온은 반응 배치에서 바람직하게는 총 용적을 기준으로 10g/l 내지 500g/l, 바람직하게는 25g/l 내지 300g/l, 특히 바람직하게는 50g/l 내지 200g/l의 양으로 사용된다.
효소 환원이 진행되는 반응 혼합물의 수성 부분은 바람직하게는, pH 값이 5 내지 10인, 바람직하게는 pH가 6 내지 9인 완충액, 예를 들면, 인산칼륨, 트리스/HCl 또는 트리에탄올아민 완충액을 함유한다. 또한, 완충액은 예를 들면, 아연 이온 또는 마그네슘 이온과 같은 효소를 안정화시키거나 활성화시키기 위한 이온을 함유할 수 있다.
본 발명에 따르는 방법을 수행하는 경우, 온도는 적합하게는 약 10℃ 내지 70℃, 바람직하게는 20℃ 내지 45℃의 범위이다.
수성 상 중의 보조인자, 특히 각각 NADH 또는 NADPH의 농도는 일반적으로 0.001 mM 내지 10 mM의 범위이다.
본 발명에 따르는 방법에서 달성되는 TTN(총 전환수(total turnover number)=사용된 보조인자의 mol당 환원된 화학식 I의 화합물의 mol)은 통상적으로 102 내지 105의 범위이지만, 바람직하게는 TTN은 103 이상이다.
본 발명에 따르는 방법에서, 옥시도리덕타제/데하이드로게나제의 안정화제가 사용될 수도 있다. 적합한 안정화제는, 예를 들면, 글리세롤, 소르비톨, 1,4-DL-디티오트레이톨(DTT) 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)이다.
본 발명의 다른 가능한 실시형태에 따라서, 산화된 보조기질(예: 아세톤)이 연속적으로 제거될 수 있고/있거나, 보조기질(예: 2-프로판올)이, 반응 평형을 반응 생성물쪽으로 이동시키기 위해 연속적 방식으로 새로이 첨가될 수 있다.
환원의 완료 후, 반응 혼합물을 처리한다. 이러한 목적을 위해, 예를 들면 수성 상을 임의로 유기 상으로부터 분리시키고, 생성물을 함유하는 유기 상을 여과한다. 임의로, 수성 상은 유기 상과 같이 추출되고 추가 처리될 수도 있다. 그 결과로, 용매가 유기 상으로부터 증발되고, 화학식 II 또는 III의 생성물이 조 생성물로서 수득된다. 이어서, 상기 조 생성물을 추가로 정제하거나 수득된 생성물의 합성을 위해 바로 사용할 수 있다.
하기에서 본 발명은 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예 1
마이코박테리움 반발레니로부터 옥시도리덕타제의 단리
마이코박테리움 반발레니로부터 NADH-의존적 옥시도리덕타제를 단리하기 위해, 미생물을 1리터 물당 펩톤 5.0g, 고기 추출물 3.0g(pH 7.0)에서 배양하였다.
정지기에 도달하면, 세포를 수거하고 원심분리에 의해 상기 배지로부터 분리시켰다. 5g의 마이코박테리움 반발레니 세포를 20ml의 완충액(100mM 트리에탄올아민, 1mM MgCl2, pH=7.0)으로 현탁시키고 균질화시켰다. 그 다음, 원심분리(7000 rpm) 후 수득된 조 추출물을 추가 정제하고 FPLC(고속 단백질 액체 크로마토그래피)를 통해 재처리하였다. 옥시도리덕타제는 부틸-세파로스상에서의 이온 교환 크로마토그래피(Messrs. Pharmacia)를 통한 4회의 연속적 단계, Q-세파로스 패스트 플로우(Q-Sepharose Fast Flow)(Messrs. Pharmacia)상에서의 2회의 정제에 이어서 하이드록시아파타이트-크로마토그래피(Bio-Rad)로 정제할 수 있었다. 이러한 목적을 위해, 원심분리 후 수득된 용해물을 50mM의 TEA, 1mM MgCl2, 1M 황산암모늄(pH=7.0)으로 평형화된 부틸-세파로스 컬럼에 직접 적용하고 감소되는 선형 염 구배로 용출시켰다. 이렇게 함으로써 옥시도리덕타제가 0.2 내지 0.3M 황산암모늄에서 용출되었다. 옥시도리덕타제-함유 분획을 합하고 한외여과(배제 한계 10kDa)에 의해 적절한 용적으로 농축시켰다. 이어서, 농축된 옥시도리덕타제의 분획을 재처리하고, 50mM 인산칼륨 완충액과 함께 1mM MgCl2 및 1M NaCl을 사용하여 Q-세파로스를 통해 추가 정제하였다. 이에 따라 상기 효소는 0.7 내지 0.8 M NaCl에서 용출되었다. 이어서, 활성 분획을 농축시키고 10 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0), 1mM MgCl2로 평형화시키고 하이드록시아파타이트-컬럼에 적용하고 200mM 인산칼륨 완충액, 1mM MgCl2로 용출시켰다. 하기 표는 수득된 결과를 요약한 것이다.
Figure 112015105446897-pct00011
단백질 양의 측정을 문헌[참조: Lowry et al. Journal of Biological Chemistry, 193 (1951): 265-275 또는 Peterson et al., Analytical Biochemistry, 100 (1979): 201-220]에 따라서 수행하였다. 단백질 양 대비 효소 활성 비인 특이적 활성을 산출하였으며, 여기서 1분당 1 μmol의 기질의 전환은 1유닛(U)에 상응한다.
실시예 2
본 발명에 따른 옥시도리덕타제의 N-말단 서열의 결정
하이드록시아파타이트-컬럼 정제 단계 후, 실시예 1에 따른 효소 제제를 10% 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 겔에서 분획화시키고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(PVDF-막)으로 이전시켰다.
약 30kDa에서의 뚜렷한 밴드를 에드만 분해법(Procise 492 (PE-Biosystems)) 및 두드러진 내부 펩타이드의 서열결정을 통해 N-말단 서열결정하였다. 하기 N-말단 서열이 수득되었다.
TRTVVVTGAGSGIGR
내부 펩타이드의 서열
LEQADDVAR
실시예 3
a) 마이코박테리움 반발레니로부터 옥시도리덕타제의 클로닝
마이코박테리움 반발레니 PYR-1의 세포로부터 단리된 게놈 DNA를, 에드만-분해법으로부터 단백질 단편 서열을 기준으로 디자인된 축퇴된 프라이머(degenerated primer)를 이용하는 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용하였다. 이렇게 함으로써, 주형으로서 50ng의 게놈 DNA를 사용하여 PCR 완충액[16mM (NH4)2S04; 67mM Tris-HCl pH 8.3(25℃에서); 1.5m MgCl2; 0.01% Tween 20; 0.2 mM dNTP 믹스; 각 경우에 30 pMol의 프라이머 및 1.25U의 BioTherm Star 폴리머라제(Genecraft)]에서 증폭을 수행하였다.
사이클 1: 95℃, 7분
사이클 2×28: 94℃, 40초
온도 강하 시작 63℃-0.5℃/단계, 30초
68℃, 60초
사이클 3×20: 94℃, 40초
53℃, 40초
72℃, 60초
사이클 4: 70℃, 7분
4℃, [무한대]
1% 아가로스 겔 중에서 전체 PCR 뱃치를 분획화한 후, 약 650 by의 밴드를 동정하고, 돌출 아데노신 모이어티를 통해 DNA 서열 결정용 Topo-TA 벡터(Invitrogen)로 클로닝하였다.
스크리닝 반응으로부터 생성된 DNA 밴드는 227개 아미노산 잔기의 옥시도리덕타제의 단편에 상응하는 오픈 리딩 프레임을 나타냈다.
옥시도리덕타제를 암호화하는 전체 서열의 결정은 역 PCR(iPCR) 방법으로 달성하였다.
옥시도리덕타제를 암호화하는 유전자 서열은 771개 염기쌍을 포함하였고 256개 아미노산 잔기의 길이에 상당하였다.
b) PCR에 의한 마이코박테리움 반발레니로부터 단쇄 ADH를 암호화하는 전체길이 DNA 단편의 합성
특이적 프라이머를 후속적인 전체길이 전사체의 적절한 발현 시스템으로의 클로닝을 위해 작제하였다. 이렇게 함으로써 5'-프라이머는 Nde I에 대한 인식 서열을 갖도록 변형되고 3'-프라이머는 Hind III에 대한 인식 서열을 갖도록 변형되었다. 마이코박테리움 반발레니의 세포로부터 단리된 게놈 DNA를 폴리머라제 연쇄 반응용 주형으로서 사용하였다. 증폭을 50ng의 주형 및 하기 온도 사이클을 사용하여 PCR 완충액[10mM Tris-HCl (pH 8.0); 50mM KCl; 10mM MgS04; 1mM dNTP 믹스; 각각의 경우 20pMol의 프라이머 및 2.5U의 플래티늄(Platinum) Pfx DNA 폴리머라제(Invitrogen)]에서 수행하였다:
사이클 1: 94℃, 2분
사이클 2×30: 94℃, 15초
58℃, 30초
68℃, 75초
사이클 3: 68℃, 7분
4℃, [무한대]
생성된 PCR 생성물을 1% 아가로스 겔상에서 정제한 후 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Hind III의 도움으로 제한시키고 동일한 엔도뉴클레아제들로 처리된 pET21a 벡터(Novagen)의 골격에 연결시켰다. 2㎕의 연결 뱃치를 이. 콜라 Top 10 F' 세포(Invitrogen)로 형질전환시킨 후, 암피실린-(또는 카나마이신) 내성 콜로니의 플라스미드 DNA를 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Hind를 이용하는 제한 분석에 의해 750의 크기를 갖는 삽입체의 존재에 대해 시험하였다. 발현 작제물 pET21-Myc를 서열결정하였다. 단쇄 옥시도리덕타제를 암호화하는 마이코박테리움 반발레니로부터의 유전자는 256개 아미노산의 단백질(서열번호 1)에 상응하는 총 771 by의 오픈 리딩 프레임(서열번호 2)을 가졌다.
실시예 4.
이. 콜라이 세포에서 재조합 옥시도리덕타제의 발현
적격한 에스케리키아 콜라이 Star BL21(De3) 세포(Invitrogen)를 옥시도리덕타제를 암호화하는 발현 작제물 pET21-MIX로 형질전환시켰다. 이어서, 상기 발현 작제물로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 세포를 550 nm에서 측정된 0.5의 광학밀도가 달성될 때까지 각각 50㎍/ml의 암피실린 또는 40㎍/ml의 카나마이신을 갖는 200ml의 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl)에서 배양하였다. 재조합 단백질의 발현을 농도가 0.1mM인 이소프로필티오갈락토사이드(IPTG)를 첨가하여 유도하였다. 25℃ 및 220rpm에서 16시간의 유도 후, 세포를 수거하고 -20℃에서 동결시켰다. 활성 시험을 위해, 10mg의 세포를 500㎕의 100mM TEA 완충액(pH 7.0), 1mM MgCl2 및 500㎕ 유리 비이드와 혼합하고 유리 밀을 사용하여 10분 동안 파괴시켰다. 이어서, 수득된 용해물을 희석된 상태로 각각의 측정을 위해 사용하였다.
활성 시험은 다음과 같이 구성되었다: 870㎕의 100 mM TEA 완충액(pH 7.0), 1 mM MgCl2, 160㎍ NADH, 10㎕의 희석된 세포 용해물. 100㎕의 100mM 기질 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가하여 반응을 개시하였다.
대량의 효소 회수를 위해, 30g의 세포를 150ml의 트리에탄올아민(TEA) 완충액(100mM, pH 7, 2mM MgCl2, 10% 글리세롤)에 재현탁시키고 고압 균질화기를 사용하여 파괴시켰다. 이어서, 효소 용액을 150ml 글리세롤과 혼합하고 -20℃에서 저장하였다.
실시예 5
측광 검정에 의한 옥시도리덕타제의 퀴누클리딘 -3-온 환원 활성의 측정
기질 3-퀴누클리디논(10mM), 조효소 NADH(0.25 mM)를 1mM MgCl2가 보충된 1ml 100mM TEA 완충액(pH 7.0) 중의 10㎕의 효소 용액에 첨가하여, 실시예 4에서 기술한 바와 같이 제조된 효소의 활성을 1분 안에 1μmol의 NADH를 NAD로 산화시키는 활성으로서 측정하였다. NADH에 대한 흡광 계수(6.22M-1cm-1)를 통해 나눠진 분당 340nm에서의 흡광도 감소율은 퀴누클리딘-3-온의 상응하는 알코올로의 환원에 대한 효소 활성(U)에 비례한다.
Figure 112015105446897-pct00012
실시예 6
퀴누클리딘 -3-온의 환원 특성에 관한 옥시도리덕타제의 특징 규명
서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9의 폴리펩타이드 서열의 옥시도리덕타제를, 퀴누클리딘-3-온의 상응하는 알코올로의 환원에 따른 에난티오머선택성 및 전환값의 측정을 위해 하기 과정에 의해 검사하였다:
서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9의 옥시도리덕타제의 유전자를 보유한 재조합 에스케리키아 콜라이를 실시예 4에서 기술한 바와 같이 배양하였다. 유도 후 18시간에, 2g의 각각의 재조합 균주 세포를 2mM MgCl2가 보충된 10ml 100mM 트리에탄올아민 완충액(pH 7.0)에 재현탁시키고 10분 동안 유리 밀을 사용하여 파괴시켰다. 수득된 효소 용액을 원심분리하여 청정화시키고 동일 용적의 글리세롤과 혼합하였다. 반응 설정을 위해, 56㎕의 효소 용액을, 0.15mg NAD, 75㎕(10%) 피키아 캡슐라타로부터의 옥시도리덕타제, 250㎕ 메틸-2-펜탄올 및 2mM MgCl2가 보충된 119㎕ 100mM TEA(pH 6.5)을 첨가함으로써 75mg 퀴누클리딘-3-온의 전환에 사용하였다. 샘플을 30℃에서 24시간 동안 항온배양한 후, 10㎕의 반응물을 1ml MeOH에 첨가하고 GC 분석하였다. 에난티오머 검출을 위해, 하이드로덱스(Hydrodex) β-6TBDM 컬럼(25m×0.25mm×0.25㎛)(제조원: Masherey-Nagel(독일))을 사용하였다.
Figure 112015105446897-pct00013
실시예 7
메틸-2-펜탄올을 보조기질로서 사용하는 10ml 규모에서의 퀴누클리딘-3-온의 상응하는 (R)-3-퀴누클리디놀로의 전환
서열번호 1의 옥시도리덕타제의 유전자를 보유한 재조합 에스케리키아 콜라이를 실시예 4에서 기술한 바와 같이 배양하였다. 유도 후 18시간에, 30g의 수거된 세포를 2mM MgCl2가 보충된 100ml의 100mM 트리에탄올아민(TEA) 완충액(pH 7.0)에 재현탁시키고 프렌치 프레스를 사용하여 파괴시켰다. 수득된 용해물을 4℃에서 6000g로 10분 동안 원심분리하여 청정화시켰다. 1.5g 3-퀴누클리디논의 환원을 위해, 250㎕의 효소 용액(1125 U)을 2mM MgCl2, 3mg NAD, 225 U의 피치아 캡슐라타로부터의 알코올 데하이드로게나제 및 5ml 메틸-2-펜탄올이 보충된 4.05ml의 100 mM TEA 완충액(pH 6.5)에 첨가하였다. 반응물을 교반하에 30℃에서 항온배양하였다. 21시간 후, 반응을 3ml의 5M NaOH, 5ml의 메탄올을 첨가하여 중단시키고 기체 크로마토그래피로 분석하였다. 측정된 (R)-3-퀴누클리디놀로의 전환율은 98%였으며, 생성물의 광학 순도는 > 99%였다.
실시예 8
이소프로판올을 보조기질로서 사용하는 10ml 규모에서의 퀴누클리딘-3-온의 상응하는 (R)-3-퀴누클리디놀로의 전환
서열번호 1의 옥시도리덕타제의 유전자를 보유한 재조합 에스케리키아 콜라이를 실시예 4에서 기술한 바와 같이 배양하였다. 유도 후 18시간에, 30g의 수거된 세포를 2mM MgCl2가 보충된 100ml의 100mM 트리에탄올아민(TEA) 완충액(pH 7.0)에 재현탁시키고 프렌치 프레스를 사용하여 파괴시켰다. 1.5g 퀴누클리딘-3-온의 환원을 위해, 525 U의 효소를 1mM ZnCl2, 1.5mg NAD, 525U의 칸디다 네모덴드라(Candida nemodendra)로부터의 알코올 데하이드로게나제(WO2007012428, 서열번호 8) 및 1ml의 이소프로판올이 보충된 5.25ml의 100mM TEA 완충액(pH 7.0)에 첨가하였다. 반응물을 교반하에 30℃에서 항온배양하였다. 24시간의 항온배양 후, 반응을 3ml의 5M NaOH, 5ml의 메탄올을 첨가하여 중단시키고 기체 크로마토그래피로 분석하였다. 측정된 (R)-3-퀴누클리디놀로의 전환율은 100%였으며, 생성물의 광학 순도는 > 99%였다.
<110> Cambrex IEP GmbH <120> Biocatalytic process for the production of (R)-3-Quinuclidinol <130> MB <150> DE 10 2013 104 418.2 <151> 2013-04-30 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 256 <212> PRT <213> Mycobacterium vanbaalenii <400> 1 Met Thr Arg Thr Val Val Val Thr Gly Ala Gly Ser Gly Ile Gly Arg 1 5 10 15 Ala Ile Ala Asn Thr Leu Ala Gln Arg Asn Trp Arg Val Val Val Thr 20 25 30 Asp Val Asn Ala Ala Ala Ala Ser Glu Val Ala Ala Ala Leu Pro Asn 35 40 45 Pro Pro Ala Gly His Glu Ser Ala Gln Leu Asp Val Thr Ser Pro Glu 50 55 60 Asn Ala Ala Ala Val Ala Ser Asp Val Ser Glu Arg Leu Gly Leu Asp 65 70 75 80 Ala Trp Val Ser Asn Ala Gly Ile Ser Phe Met Arg Arg Phe Leu Asp 85 90 95 Ala Pro Ile Glu Arg Tyr Glu Gln Thr Met Asp Val Asn Leu Lys Gly 100 105 110 Val Phe Val Cys Gly Gln Ala Ala Ala Arg Glu Met Val Arg Ala Gly 115 120 125 Ile Pro Gly Met Ile Val Asn Thr Ala Ser Met Ala Gly Lys Gln Gly 130 135 140 Arg Val Pro Phe Leu Ser Asp Tyr Val Ala Ser Lys Phe Gly Val Val 145 150 155 160 Gly Leu Thr Gln Ala Met Ala Tyr Glu Leu Gly Glu His Gly Ile Thr 165 170 175 Val Asn Cys Val Cys Pro Gly Phe Val Glu Thr Pro Met Gln Ser Arg 180 185 190 Glu Leu Gln Trp Glu Ala Glu Leu Arg Gly Thr Thr Pro Asp Gly Val 195 200 205 Arg Ala Met Met Ile Ala Asp Thr Pro Leu Gly Arg Leu Glu Gln Ala 210 215 220 Asp Asp Val Ala Arg Ala Val Ala Phe Leu Leu Ser Asp Asp Ala Arg 225 230 235 240 Phe Ile Thr Gly Glu Ala Leu Ala Val Asn Gly Gly Ala Tyr Met Asp 245 250 255 <210> 2 <211> 771 <212> DNA <213> Mycobacterium vanbaalenii <400> 2 atgacgagaa ctgtggtcgt gaccggagcg ggatccggta tcggacgagc gatcgccaac 60 acactggcgc aacgaaattg gcgggtggtg gtcaccgacg tcaatgccgc cgccgcaagc 120 gaggtcgcag cggcactgcc gaatccgccc gcaggccatg aatccgcaca actggacgtc 180 acctcccccg agaacgcggc cgccgtggca tccgacgtct cggagcggct cgggctcgac 240 gcgtgggtga gcaacgccgg catctcgttc atgcgccgct tcctcgacgc ccccatcgag 300 cgctacgagc agaccatgga cgtgaatctc aagggcgtgt tcgtgtgcgg gcaggccgcg 360 gcgcgggaga tggtgcgcgc cggcattccc gggatgatcg tgaacaccgc ctcgatggcg 420 ggcaagcagg gccgggtgcc gttcctgtcg gactacgtcg cctcgaaatt cggggtggtc 480 gggttgaccc aggcgatggc ctacgaactc ggcgagcatg gcatcacagt caactgcgtg 540 tgccctggct ttgtcgaaac ccccatgcag tcaagggaat tgcagtggga ggccgagctg 600 cgtggcacca cccccgacgg tgtccgcgcc atgatgatcg ccgacacgcc gctgggtcgc 660 cttgagcagg ccgacgacgt cgcccgcgcc gtggccttcc tgctctccga cgacgcccgt 720 ttcatcaccg gcgaagcgct cgccgtcaac ggcggcgcct acatggactg a 771 <210> 3 <211> 264 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <400> 3 Met Ser Thr Pro Ala Asn Ser Thr Pro Asp Thr Pro Ser Thr Val Val 1 5 10 15 Val Thr Gly Ala Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Ile Ala Thr Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Arg Gly Trp Arg Val Val Ala Thr Asp Val Asp Val Ala Ala 35 40 45 Ala Asp Glu Thr Ala Ser Ser Leu Ser Gly Ser Gly His Glu Ser Ala 50 55 60 Arg Leu Asp Val Thr Asp Pro Ala Gln Ala Ser Ala Leu Ala Asp Asp 65 70 75 80 Val Ala Asp Arg Ile Gly Leu Gly Ala Trp Val Ser Asn Ala Gly Ile 85 90 95 Ser Ala Met Ala His Phe Val Asp Ile Ser Ala Glu Gln Leu Asp Arg 100 105 110 Ser Leu Asp Val Asn Leu Lys Gly Val Phe Phe Cys Gly Gln Ala Ala 115 120 125 Ala Arg Ala Met Ile Arg Thr Gly Val Arg Gly Thr Ile Val Asn Thr 130 135 140 Ala Ser Met Ala Ala Lys Gln Gly Arg Val Pro Phe Leu Ala Asp Tyr 145 150 155 160 Val Ala Ser Lys Phe Gly Val Leu Gly Leu Thr Gln Ala Met Ala Phe 165 170 175 Glu Leu Ala Ala His Gly Ile Thr Val Asn Ser Val Cys Pro Gly Phe 180 185 190 Val Ala Thr Pro Met Gln Thr Arg Glu Leu Glu Trp Glu Ala Lys Leu 195 200 205 Ser Gly Ser Thr Pro Asp Gly Val Arg Gln Ser Trp Ile Asp Ala Thr 210 215 220 Pro Leu Gly Arg Leu Gln Thr Pro Asp Asp Val Ala Arg Ala Val Ala 225 230 235 240 Phe Leu Val Ser Glu Asp Ala Arg Phe Ile Thr Gly Glu Ala Leu Ser 245 250 255 Val Asn Gly Gly Ala Tyr Met Asp 260 <210> 4 <211> 795 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <400> 4 atgagcaccc ccgcgaacag cactcccgac acccccagca ccgtcgtcgt caccggcgcc 60 ggatccggca tcggccgcgc gatcgccacc acgctcgccg aacgcggctg gcgtgtggtc 120 gccaccgacg tcgacgtcgc cgcggccgac gagacggcct catccctgag cggcagcggc 180 cacgagtcgg cgcgtctcga cgtcaccgat cccgcgcagg cgtccgcact ggccgacgac 240 gtcgccgacc gcatcgggct gggggcctgg gtcagcaacg cgggcatctc cgcgatggcg 300 cacttcgtcg acatctccgc cgaacaactc gaccgcagtc tcgacgtcaa cctcaagggc 360 gtgttcttct gtggtcaggc cgcggcccgc gccatgatcc gcaccggtgt gcgcggcacg 420 atcgtcaaca ccgcatcgat ggcggcaaag cagggccggg taccgttcct cgcggactat 480 gtcgcgtcca agttcggcgt gctgggactc acccaggcga tggccttcga acttgccgca 540 cacggcatca cggtcaacag tgtctgcccc ggtttcgtgg caacaccgat gcagacacga 600 gaattggagt gggaggcgaa actcagcggc tcgacgcccg acggcgtacg ccagtcctgg 660 atcgacgcga cgccgctggg ccgcctgcaa actcccgacg acgtcgcccg cgcggtggcg 720 ttcctggtct ccgaagatgc ccgcttcatc accggagagg cgctgtcggt caacggcggt 780 gcctacatgg actga 795 <210> 5 <211> 259 <212> PRT <213> Caldilinea aerophila <400> 5 Met Arg Leu Arg Gly Lys Ile Ile Gly Ile Thr Gly Ala Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ile Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ala Arg Glu Gly Ala Ala Leu 20 25 30 Ala Val Thr Asp Phe Asn Leu Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ala Ala Asp 35 40 45 Ile Arg Ser Gln Gly Gly Glu Ala Thr Ala Trp Arg Leu Asp Val Thr 50 55 60 Asp Gln Ala Glu Ala Glu Arg Val Leu Gln Ala Leu Ile Asp Arg Tyr 65 70 75 80 Gly Arg Leu Asp Val Trp Val Asn Asn Ala Gly Val Ser Thr Met Asn 85 90 95 Arg Phe Val Asp Leu Thr Glu Arg Asp Trp Asp Tyr Asn Met Asn Val 100 105 110 Asn Ala Lys Gly Val Phe Leu Cys Ser Gln Val Ala Ala Arg Arg Met 115 120 125 Ile Ala Gln Gly Gly Gly Lys Ile Ile Asn Val Ala Ser Met Ala Gly 130 135 140 Lys Arg Gly Asn Ala Pro Phe Leu Ala His Tyr Val Ala Ser Lys Phe 145 150 155 160 Ala Val Ile Gly Leu Thr Gln Ala Met Ala Gly Glu Leu Ala Pro Tyr 165 170 175 His Ile Thr Val Asn Ala Val Cys Pro Gly Tyr Val Arg Thr Ser Met 180 185 190 Gln Glu Arg Glu Val Glu Trp Glu Ala Met Leu Arg Gly Val Thr Pro 195 200 205 Glu Ala Val Arg Gln Leu Tyr Ile Gln Asp Thr Pro Leu Arg Arg Leu 210 215 220 Glu Thr Pro Glu Asp Val Ala Lys Val Ile Val Phe Leu Ala Ser Glu 225 230 235 240 Asp Ala Asp Phe Ile Thr Gly Glu Ala Ile Asn Val Asn Gly Gly Ala 245 250 255 Trp Met Asp <210> 6 <211> 780 <212> DNA <213> Caldilinea aerophila <400> 6 atgcgactca ggggcaaaat tatcggcatc accggcgctg gttcaggcat tggcaaggcg 60 gcggctctag cgctggcgcg ggagggcgcc gcattggccg tgacggactt caacctggat 120 tgggcgcagc aaacagccgc agacatccgc agccagggcg gcgaggcgac agcatggcgg 180 cttgacgtga ccgaccaggc cgaggcagag cgcgtgctgc aggcgctgat cgaccgttac 240 ggccggctcg acgtctgggt gaacaacgca ggcgtctcga ccatgaaccg ctttgttgac 300 ctcactgagc gggactggga ctataacatg aacgtcaacg ccaaaggcgt ttttctctgc 360 agccaggtcg ccgcccgacg catgatcgcc caaggaggtg ggaagatcat caacgtcgcc 420 tccatggcag gcaaacgagg caacgcacct ttcctggctc attatgttgc cagcaaattt 480 gctgtaatcg ggctgacgca agcgatggcg ggcgaactgg cgccttatca catcaccgtc 540 aacgccgttt gccctggcta tgtgcgcaca tctatgcaag agcgagaggt ggagtgggag 600 gcaatgctgc gtggggttac acccgaagcg gtgcgacaac tgtatatcca ggatacacct 660 ctgcgacgcc tcgaaacacc cgaagatgtg gcgaaagtca ttgtttttct tgcttcagag 720 gacgcagact tcatcacggg cgaagcgatt aacgtcaacg gcggcgcgtg gatggattaa 780 <210> 7 <211> 266 <212> PRT <213> Starkea novella <400> 7 Met Ile Pro Ala Thr Ala Pro Thr Pro Val Tyr Pro Glu Leu Ser Gly 1 5 10 15 Arg Leu Ala Phe Val Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ile Gly Arg Ala Ile 20 25 30 Ala Thr Ala Leu Ala Arg Gln Gly Val Arg Val Ala Ile Gly Asp Ile 35 40 45 Asn Leu Gly Ala Ala Glu Asp Ala Ala Ala Ala Ile Gly Gly Gly Ala 50 55 60 Val Ala Val Glu Val Asp Val Arg Arg Arg Ala Ser Val Glu Ala Ala 65 70 75 80 Phe Ala Arg Val Leu Glu Leu Leu Gly Gly Cys Asp Leu Leu Val Ala 85 90 95 Asn Ala Gly Val Ser Thr Met Gln Ala Ala Leu Glu Ile Thr Asp Gln 100 105 110 Glu Trp Asp Phe Asn Phe Asp Val Asn Thr Arg Gly Val Phe Leu Thr 115 120 125 Asn Gln Ile Val Ala Arg His Phe Val Ala Thr Gly Lys Gly Cys Ile 130 135 140 Val Asn Thr Ala Ser Leu Ala Ala Lys Val Gly Ala Pro Leu Leu Ala 145 150 155 160 His Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Val Leu Gly Trp Thr Gln Ala Leu 165 170 175 Ala Arg Glu Leu Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Ala Val Cys Pro 180 185 190 Gly Phe Val Ala Thr Gly Met Gln Ser Arg Glu Val Gln Trp Glu Ala 195 200 205 Thr Leu Arg Gly Val Thr Pro Gln Arg Val Ile Asp Asp Tyr Ile Ala 210 215 220 Gln Thr Pro Leu Gly Arg Leu Glu Gln Pro Glu Asp Val Ala Asp Val 225 230 235 240 Val Val Phe Leu Cys Ser Glu Gln Ala Arg Phe Met Thr Gly Gln Gly 245 250 255 Val Asn Val Thr Gly Gly Val Tyr Thr Thr 260 265 <210> 8 <211> 801 <212> DNA <213> Starkea novella <400> 8 atgatccccg cgaccgcccc gacgcccgtc taccccgaac tttccggccg gctggccttc 60 gtgacggggg cggcgacggg catcgggcgt gccatcgcca cggctctggc gcgccagggc 120 gtgcgggtcg cgatcggcga catcaatctc ggcgcggccg aggacgcggc ggcggcgatc 180 ggcggcggtg ccgtggcggt cgaggtggat gtgcgccggc gcgcctccgt cgaggcggcg 240 ttcgcccgcg tgctggagtt gctcggcggc tgcgacctgc tggtcgccaa tgccggcgtc 300 tcgaccatgc aggcggcgct cgagatcacc gaccaggagt gggacttcaa cttcgacgtc 360 aacacccgcg gcgtgttcct caccaaccag atcgtcgccc ggcatttcgt ggcgaccggc 420 aagggctgca tcgtcaacac cgcctcgctc gccgccaagg tcggggcgcc gctgctggcg 480 cattactcgg cctccaaatt cgccgtcctc ggctggacgc aggcgctggc ccgcgagctc 540 gcccccaagg gcatccgcgt caatgccgtc tgcccgggct tcgtggcgac cggcatgcag 600 tcgcgcgagg tgcagtggga ggcgacgctg cgcggcgtga ccccgcagcg cgtgatcgac 660 gactacatcg cccagacccc gctcggccgg ctggagcagc cggaggacgt cgccgacgtg 720 gtggtgttcc tgtgctcgga gcaggcccgc ttcatgaccg ggcagggcgt caacgtcacc 780 ggcggcgtct acacgacctg a 801 <210> 9 <211> 264 <212> PRT <213> Oceanithermus profundus <400> 9 Met Leu Glu Lys Arg Thr Ala Leu Ile Thr Gly Ala Gly Gly Gly Ile 1 5 10 15 Gly Ala Ala Val Ala His Arg Leu Ala Arg Glu Gly Ala Lys Val Trp 20 25 30 Val Thr Asp Arg Asp Leu Asp Ala Ala Glu Ala Thr Ala Ala Ala Ile 35 40 45 Arg Glu Ala Gly Gly Arg Ala Arg Ala Arg Arg Val Asp Val Thr Arg 50 55 60 Arg Glu Glu Leu Glu Ala Ala Cys Ala Ala Ala Tyr Ala Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Val Asp Leu Val Val Ala Asn Ala Gly Val Ser Thr Met Arg Pro 85 90 95 Phe Leu Glu Leu Thr Asp Glu Asp Trp Ala Phe Asn Phe Asp Val Asn 100 105 110 Ala Arg Gly Thr Phe Tyr Thr Leu Gln Thr Phe Ala Arg Arg Met Lys 115 120 125 Asp Gln Ala Pro Met Pro Gly Ser Ser Leu Arg Gly Lys Leu Ile Ala 130 135 140 Val Ala Ser Met Ala Ala Arg Gln Ala Ala Pro Trp Leu Ala His Tyr 145 150 155 160 Ser Ala Ser Lys Phe Ala Val Leu Gly Leu Val Gln Ala Ala Ala Lys 165 170 175 Glu Leu Ala Pro Phe Arg Ile Thr Val Asn Ala Val Asn Pro Gly Phe 180 185 190 Val Lys Thr Ser Met Gln Glu Arg Glu Ile Ala Trp Glu Ala Arg Leu 195 200 205 Arg Gly Thr Thr Pro Glu Ala Val Val Ala Asp Tyr Leu Ala Gln Thr 210 215 220 Pro Leu Gly Arg Leu Glu Arg Pro Glu Asp Val Ala Gly Val Val Ala 225 230 235 240 Phe Leu Ala Gly Pro Asp Ala Asp Phe Ile Thr Gly Glu Ala Val Glu 245 250 255 Val Asn Gly Gly Ala Trp Ile Phe 260 <210> 10 <211> 795 <212> DNA <213> Oceanithermus profundus <400> 10 atgcttgaga aaagaacggc actgatcacc ggcgccggcg gcggcatcgg cgccgccgtg 60 gcccaccggc tcgcgcgcga aggcgccaag gtctgggtca cggaccgcga cctcgacgcc 120 gcggaggcga cggccgcggc catccgggag gcgggcgggc gcgcccgcgc gcggcgcgtg 180 gacgtcaccc gccgggaaga gctcgaggcc gcctgcgcag cggcctacgc cgaggacggg 240 cgcgtcgacc tggtggtggc gaacgccggc gtgagcacga tgcgcccctt cctggagctg 300 accgacgagg actgggcgtt caacttcgac gtcaacgccc gcgggacctt ctacaccctg 360 cagaccttcg cccggcgcat gaaggaccag gcgccgatgc cgggaagctc gctgcggggg 420 aagctgatcg ccgtggccag catggcggcg cgccaggcgg ccccctggct ggcccactac 480 tccgcctcga agttcgcggt gctggggctg gtgcaggcgg cggcgaagga gctcgccccc 540 ttccggatca ccgtcaacgc ggtgaacccg ggcttcgtca agacctcgat gcaggaacgc 600 gaaatcgcct gggaggcgcg gctgcggggc accacccccg aggcggtcgt cgccgactac 660 ctggcccaga ccccgctggg acggctggaa aggccggagg acgtcgccgg cgtggtggct 720 ttcctggccg gccccgacgc cgacttcatc accggcgagg ccgtggaggt gaacggcggg 780 gcctggatct tctga 795

Claims (16)

  1. 보조인자 NADH 또는 NADPH 및 옥시도리덕타제를 사용하여 퀴누클리딘-3-온의 환원에 의해 (R)-3-퀴누클리디놀을 제조하는 방법으로서,
    상기 옥시도리덕타제는 아미노산 서열 모티프 MQX1REX2X3WEA(여기서, 각각의 X1, X2, X3은 아미노산 잔기 A(Ala), R(Arg), N(Asn), D(Asp), C(Cys), Q(Gln), E(Glu), G(Gly), H(His), I(lle), L(Leu), K(Lys), M(Met), F(Phe), P(Pro), S(Ser), T(Thr), W(Trp), Y(Tyr) 또는 V(Val) 중 어느 하나이다)를 포함하고,
    상기 옥시도리덕타제는
    서열목록의 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드들로부터 선택됨을 특징으로 하는, 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 보조인자가 보조기질과 함께 연속적으로 재생됨을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 2-프로판올, 2-부탄올, 2-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-헵탄올 또는 2-옥탄올이 각각 보조기질로서 또는 2차 알코올로서 사용됨을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 보조기질로서 상기 2차 알코올이, 반응 뱃치(reaction batch)의 총 용적을 기준으로 5 내지 70용적%의 양으로 사용됨을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 보조기질로서 상기 2차 알코올이, 반응 뱃치의 총 용적을 기준으로 5 내지 50용적%의 양으로 사용됨을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제4항에 있어서, 보조기질로서 사용되는 상기 2차 알코올이 수불혼화성(water immiscible)이고, 반응 뱃치의 총 용적을 기준으로 5 내지 80용적%의 양으로 사용됨을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 보조기질로서 사용되는 상기 2차 알코올이 수불혼화성이고, 반응 뱃치의 총 용적을 기준으로 20 내지 80용적%의 양으로 사용됨을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 보조기질로서 사용되는 상기 2차 알코올이 메틸-2-펜탄올임을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 퀴누클리딘-3-온이, 총 반응 용적을 기준으로, 5 내지 50중량%의 양으로 사용됨을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 퀴누클리딘-3-온이, 총 반응 용적을 기준으로, 8 내지 40중량%의 양으로 사용됨을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 총 전환수 TTN(total turnover number)(= 보조인자의 mol당 환원된 퀴누클리딘-3-온의 mol)이 103 초과임을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 수성 유기 2상 시스템에서 수행됨을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 유기 용매가 또한 사용됨을 특징으로 하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 디에틸 에테르, 3급 부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 헵탄, 헥산 또는 사이클로헥산이 유기 용매로서 사용됨을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 추가의 옥시도리덕타제가 보조인자 재생을 위해 상기 환원 반응에 첨가됨을 특징으로 하는, 방법.
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