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Technisches Gebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von (R)-3-Chinuclidinol ((3R)-1-Azabicyclo[2.2.2]octan-3-ol, CAS-Nr.: 25333-42-0) oder ein Salz davon (CAS-Nr.: 42437-96-7) mit hoher optischer Reinheit,
(R)-3-Chinuclidinol [(3R)-1-Azabicyclo[2.2.2]octan-3-ol] umfassend das Umsetzen von Chinuclidin-3-on mit neuen Oxidoreduktasen unter Verwendung von NADH als Cofaktor.
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Stand der Technik
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(R)-3-Chinuclidinol ist ein wertvolles Zwischenprodukt für die Synthese eines breiten Spektrums von Pharmazeutika. In der pharmazeutischen Industrie wird es beispielsweise als chirales Synthon für den Kognitionsverstärker Talsaclidin, das Harninkontinenzmittel Solifenacin und den M
3-Antagonisten Revatropat für die Behandlung von Asthma verwendet. Es gibt mehrere bekannte Verfahren für die Herstellung von optisch aktivem Chinuclidinol, wie z. B. eine chemische Reduktionsreaktion unter Verwendung eines Metallkatalysators (vgl.
JPH9-194480A ), die Auftrennung racemischer Gemische von (+)-3-Chinuclidinolestern durch eine enzymatische Hydrolysereaktion (vgl.
US5215918B ,
JPH10-136995A ,
JPH10-210997A ,
JPH9-194480A ) und die enzymatische Reduktion von Chinuclidin-3-on unter Verwendung von Gesamtzellen-Biokatalysatoren oder isolierten Enzymen (vgl.
JP10243795 ,
JP11196890 ,
JP2002153293 ,
JP2000245495 ).
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Es wird berichtet, dass die Herstellung von optisch reinem (R)-3-Chinuclidinol durch Reduktion mit Metallkatalysatoren eine ungenügende Wirksamkeit für die industrielle Anwendung aufweist, da die optische Reinheit des Reaktionsprodukts niedrig ist und zusätzliche Reinigungsschritte erforderlich sind, um reine Enantiomere zu erhalten.
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Die Herstellung von optisch reinem (R)-3-Chinuclidinol durch Auftrennen racemischer Gemische von (+)-3-Chinuclidinolestern mit Protease ist aufgrund der Notwendigkeit zum Entfernen zurückbleibender Ester aus dem Reaktionsgemisch und der damit verbundenen hohen Kosten ebenfalls für die industrielle Anwendung ungeeignet.
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Die Herstellung von optisch reinem (R)-3-Chinuclidinol durch enzymatische Reduktion von Chinuclidin-3-on über Gesamt-Biotransformation wurde für Zellen der Gattungen Nakazaewaea, Candida, Proteus, Rhodotorula, Sporidiolobus, Rhodosporidium, Schizosaccharomyces, Cryptococcus, Trichisporon, Gordonia, Nocardia, Alcaligenes, Corynebacterium, Arthrobacter, Filobasisdium, Aureobasidium, Yarrowia, Geotrichum, Tsukamurella, Kurthia, Microbacterium, Kluyveromyces, Acremonium und Mucor beschrieben (vgl.
JP10243795 ,
JP11196890 ,
JP2002153293 ,
JP2000245495 ). Verunreinigungen durch mikrobielle Zellen und/oder Nebenreaktionen, die von anderen in den Mikroorganismen enthaltenen Enzymen verursacht werden, verringern die optische Reinheit und die Produktausbeute.
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Auch die Herstellung von (R)-3-Chinuclidinol durch Oxidoreduktionsverfahren mithilfe isolierter Enzyme ist im Fachgebiet bekannt und wurde für Enzyme aus Pflanzen der Gattungen Datura und Hyoscyamus (Patent
JP2003230398 ) und Enzyme aus Rhodotorula (
JP2007124922 ), Burkholderia (
WO2010123062 ) und
Microbacterium luteolum (Int. J. Mol. Sci., 19. Okt. 2012; 13(10): 13542–53) beschrieben. Kürzlich wurde eine Alkoholdehydrogenase, die Chinuclidin-3-on reduziert, aus Agrobacterium tumerfaciens kristallisiert (
Acta crystallografica 10 (2012) 68 (Teil 10): 1237–1239).
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Aufgrund ihres pflanzlichen Ursprungs sind die aus Datura und Hyoscyamus stammenden Enzyme schwierig industriell herzustellen. Die aus Rhodotorula und Burkholderia stammenden Enzyme benötigen kostspieliges NADPH als Cofaktor und Glucosedehydrogenase für die NADPH-Regeneration, wodurch das Herstellungsverfahren sehr kostspielig wird.
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Das bislang wirkungsvollste Verfahren für die Herstellung von (R)-3-Chinuclidinol wird von Isotani et al. (Int. J. Mol. Sci., 19. Okt. 2012; 13 (10): 13542–53) als Reduktionsverfahren unter Verwendung von Enzymen aus Microbacterium luteolum beschrieben. Aus Microbacterium luteolum stammende Enzyme benötigen NADH als Cofaktor und eine sekundäre Alkoholdehydrogenase für die Cofaktor-Regeneration in Verbindung mit 2-Propanol als Cosubstrat. Allerdings ist bei diesem enzymatischen Reduktionsverfahren die Substratbeladung beschränkt, vermutlich aufgrund der Inhibitorwirkung von Chinuclidin-3-on auf die enzymatische Aktivität.
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Durch kontinuierliches Zugeben von Substrat zu der Reaktionscharge, um die Konzentration von Chinuclidin-3-on in dem Reaktionsgefäß und die begleitende Enzymhemmung auf einem geeigneten Niveau zu halten, konnte eine maximale Substratbeladung von 10% (w/v) erzielt werden. Unter Verwendung immobilisierter Enzyme konnte eine Umwandlungsausbeute von 100% bei einer Substratbeladung von 15% (w/v) erzielt werden. Allerdings ist die Immobilisierung von Enzymen aufwändig und kostspielig und bedingt Beschränkungen für das Reaktionsvolumen, die den Erfordernissen eines industriellen Herstellungsverfahrens nicht entsprechen.
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Die Anzahl bekannter Enzyme für die Reduktion von Chinuclidin-3-on ist beschränkt. Ferner sind diese Enzyme nicht im Handel erhältlich und die entsprechenden Reduktionsverfahren haben schwere Nachteile. Somit besteht Bedarf an einem wirkungsvollen und industriell anwendbaren Verfahren für die Herstellung von (R)-3-Chinuclidinol mit neuen rekombinanten Oxidoreduktasen, die als Biokatalysatoren bei der Reduktionsreaktion verwendet werden.
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Eine Oxidoreduktase, die für ein industrielles Reduktionsverfahren für 3-Chinuclidinon geeignet ist, muss folgenden Bedingungen entsprechen:
- 1) geeignete Expression in einem rekombinanten Stamm (beispielsweise in Escherichia coli);
- 2) hohe Stabilität in organischen Lösungsmitteln, insbesondere in wassermischbaren organischen Lösungsmitteln, wie z. B. 2-Propanol und 2-Butanol;
- 3) enzymatische Aktivität bei hoher Konzentration des Substrats 3-Chuinuclidinon ohne Beeinträchtigung durch Substrat- oder Produkthemmung;
- 4) Eignung für eine enzymgekoppelte Cofaktor-Regeneration, insbesondere Cofaktor-Regeneration durch Alkoholdehydrogenase unter Verwendung sekundärer Alkohole als Cosubstrate.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Herstellen von (R)-3-Chinuclidinol durch Reduzieren von Chinuclidin-3-on oder eines Salzes davon unter Verwendung eines Cofaktors und einer isolierten Oxidoreduktase, eines rekombinanten Organismus, der die Oxidoreduktase exprimiert, oder eines Präparats eines Organismus, der die Oxidoreduktase exprimiert, wie z. B. permeabilisierte, lysierte oder lyophilisierte Zellen davon. Die Oxidoreduktase ist ausgewählt aus
- a) Polypeptiden mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 der Sequenzliste; oder
- b) Polypeptiden mit einer Aminosäuresequenz abgeleitet von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 durch Substitution, Deletion oder Addition von einem, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf, zwölf, dreizehn, vierzehn, fünfzehn, sechzehn, siebzehn, achtzehn, neunzehn, zwanzig, einundzwanzig, zweiundzwanzig, dreiundzwanzig, vierundzwanzig, fünfundzwanzig, sechsundzwanzig oder mehr Aminosäureresten und die zum Reduzieren von Chinuclidin-3-on in Verbindung mit einem Cofaktor fähig sind; oder
- c) Polypeptiden mit einer Aminosäuresequenz, bei der wenigstens 51% der Aminosäuren mit den Aminosäuren von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 9 identisch sind, vorzugsweise wobei wenigstens 75% der Aminosäuren mit den Aminosäuren von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 9 identisch sind, bevorzugter wobei wenigstens 85% der Aminosäuren mit den Aminosäuren von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 9 identisch sind, höchst bevorzugt wobei wenigstens 90% der Aminosäuren mit den Aminosäuren von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 9 identisch sind, und die zum Reduzieren von Chinuclidin-3-on in Verbindung mit einem Cofaktor fähig sind; oder
- d) Polypeptiden mit einer Aminosäuresequenz, bei der wenigstens 65%, vorzugsweise wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 85%, höchst bevorzugt wenigstens 90% der Aminosäuren mit den Aminosäuren von SEQ ID NO: 7 identisch sind, und die zum Reduzieren von Chinuclidin-3-on in Verbindung mit einem Cofaktor fähig sind; oder
- e) Polypeptiden, die von einem Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 der Sequenzliste kodiert werden; oder
- f) Polypeptiden, die von einem Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz kodiert werden, die mit dem Komplement voller Länge der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 unter stringenten Bedingungen hybridisiert, und die zum Reduzieren von Chinuclidin-3-on in Verbindung mit einem Cofaktor fähig sind; oder
- g) Polypeptiden gemäß a) oder b) oder c) oder d) oder e) oder f), die ferner ein Aminosäure-Sequenzmotiv MQX1REX2X3WEA umfassen, wobei jedes von X1, X2, X3 ein beliebiger der Aminosäurereste A (Ala), R (Arg), N (Asn), D (Asp), C (Cys), Q (Gln), E (Glu), G (Gly), H (His), I (Ile), L (Leu), K (Lys), M (Met), F (Phe), P (Pro), S (Ser), T (Thr), W (Trp), Y (Tyr) oder V (Val) ist.
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Vorzugsweise wird die Oxidoreduktase in Verbindung mit dem Cofaktor NADH oder NADPH verwendet.
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Es wurde gefunden, dass die Polypeptide der vorliegenden Erfindung gemäß a) oder b) oder c) oder d) oder e) oder f) oder g) fähig sind, Chinuclidin-3-on wirkungsvoll zu seinem entsprechenden (R)-Alkohol zu reduzieren. Überraschenderweise variiert die Sequenzhomologie (Identität) zwischen den Polypeptiden gemäß der vorliegenden Erfindung (siehe Tabelle 1) von 48% bis 72%. Die Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung weisen aber ein gemeinsames spezifisches Aminosäure-Sequenzmotiv MQX
1REX
2X
3WEA auf, das für die enzymatische Aktivität dieser Proteine bei der Reduktion von Chinuclidin-3-on charakteristisch ist.
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Das Sequenzmotiv MQX1ReX2X3WEA ist nahe dem C-Terminus der Proteine angeordnet. Diese Beobachtung steht in Einklang mit der Kristallstruktur und einer darauf basierenden Homologiemodellierung bekannter kurzkettiger Alkoholdehydrogenasen, die zeigt, dass dieses Motiv einen Schwanz einer Substratbindungstasche der Dehydrogenase bildet, wobei die Aminosäurereste M, Q, R, E, W, E und A mit dem Substrat wechselwirken. Daher wird postuliert, dass kurzkettige Alkoholdehydrogenasen, die das Motiv MQX1REX2X3WEA enthalten, für die Reduktion von Chinuclidin-3-on geeignet sind.
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Eine für die Reduktion von Chinuclidin-3-on, vorzugsweise zu dem entsprechenden R-Alkohol, geeignete Oxidoreduktase soll ein Polypeptid sein, das unter optimierten Reaktionsbedingungen einen enantiomeren Überschuss des R-Alkohols von wenigstens 50% liefert. Hierin sollen optimierte Reaktionsbedingungen Reaktionsbedingungen sein, bei denen ein Polypeptid den maximalen enantiomeren Überschuss des R-Alkohols liefert.
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Es wurde gefunden, dass die Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung geeignete Oxidoreduktase-Aktivitäten bereitstellen und zum Reduzieren von Chinuclidin-3-on, vorzugsweise zu (R)-3-Chinuclidinol, verwendet werden können. Der erzielbare enantiomere Überschuss des R-Alkohols beträgt > 50%, vorzugsweise > 80%, besonders bevorzugt > 95%. Bei Verwendung von SEQ ID NO: 1 kann ein enantiomerer Überschuss von > 99% erzielt werden.
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Oxidoreduktasen, die zum Reduzieren von Chinuclidin-3-on zu dem entsprechenden (R)-3-Chinuclidinol fähig sind, können aus Bakterien der Gattung Mycobacterium isoliert werden, insbesondere aus Mycobacterium vanbaalenii oder aus Mycobacterium smegmatis, aus Bakterien der Gattung Caldilinea, insbesondere aus Caldilinea aerophila, aus Bakterien der Gattung Starkeya, insbesondere aus Starkeya novella, aus Bakterien der Gattung Oceanithermus, insbesondere aus Oceanithermus profundum.
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Die Polynukleotide, die die Oxidoreduktase gemäß der vorliegenden Erfindung kodieren, sind beispielsweise aus der genomischen DNA des Bakteriums Mycobacterium vanbaalenii, Stamm PYR-1, oder aus Mycobaterium smegmatis, Stamm ATCC 700084, aus Bakterien der Gattung Caldilinea, insbesondere aus Caldilinea aerophila, Stamm DSM 14535, aus Bakterien der Gattung Starkeya, insbesondere aus dem Starkeya-novella-Stamm DSM 506, aus Bakterien der Gattung Oceanithermus, insbesondere aus Oceanithermus profundum, unter Verwendung bekannter molekularbiologischer Verfahren erhältlich.
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Der Organismus, der die Oxidoreduktase herstellt, ist vorzugsweise ein rekombinanter Organismus, der die Oxidoreduktase überexprimiert. Vorzugsweise, aber nicht darauf beschränkt, ist ein derartiger rekombinanter Organismus Escherichia coli. Die von einem rekombinanten Organismus exprimierte Oxidoreduktase kann in einem vollständig gereinigten Zustand, in einem teilgereinigten Zustand oder als Zellen, die das Polypeptid enthalten, verwendet werden. Die Zellen, die das Polypeptid exprimieren, können in einem nativen, permeabilisierten, lysierten oder lyophilisierten Zustand verwendet werden.
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Eine weitere Erscheinungsform der Erfindung ist die Oxidoreduktase, der Organismus, der diese Oxidoreduktase herstellt, oder ein Präparat eines Organismus, der die Oxidoreduktase exprimiert, wie z. B. permeabilisierte, lysierte oder lyophiliserte Zellen davon, das fähig ist, unter Verwendung eines Cofaktors Chinuclidin-3-on enantioselektiv zu seinem entsprechenden Alkohol zu reduzieren. Diese Oxidoreduktase ist ausgewählt aus
- a) Polypeptiden mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 der Sequenzliste; oder
- b) Polypeptiden mit einer Aminosäuresequenz abgeleitet von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 durch Substitution, Deletion oder Addition von einem, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf, zwölf, dreizehn, vierzehn, fünfzehn, sechzehn, siebzehn, achtzehn, neunzehn, zwanzig, einundzwanzig, zweiundzwanzig, dreiundzwanzig, vierundzwanzig, fünfundzwanzig, sechsundzwanzig oder mehr Aminosäureresten; oder
- c) Polypeptiden mit einer Aminosäuresequenz, bei der wenigstens 51% der Aminosäuren mit den Aminosäuren von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 9 identisch sind; oder
- d) Polypeptiden mit einer Aminosäuresequenz, bei der wenigstens 65% der Aminosäuren mit den Aminosäuren von SEQ ID NO: 7 identisch sind; oder
- e) Polypeptiden, die von einem Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 der Sequenzliste kodiert werden; oder
- f) Polypeptiden, die von einem Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz kodiert werden, die mit dem Komplement voller Länge eines Polynukleotids mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 unter stringenten Bedingungen hybridisiert; oder
- g) Polypeptiden gemäß a) oder b) oder c) oder d) oder e) oder f), die ferner ein Aminosäure-Sequenzmotiv MQX1REX2X3WEA umfassen, wobei jedes von X1, X2, X3 ein beliebiger der Aminosäurereste A (Ala), R (Arg), N (Asn), D (Asp), C (Cys), Q (Gln), E (Glu), G (Gly), H (His), I (Ile), L (Leu), K (Lys), M (Met), F (Phe), P (Pro), S (Ser), T (Thr), W (Trp), Y (Tyr) oder V (Val) ist.
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Vorzugsweise wird die Oxidoreduktase in Verbindung mit dem Cofaktor NADH oder NADPH verwendet.
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Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Aminosäuresequenz (A), wobei (P) % der Aminosäuren mit den Aminosäuren der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: (N) identisch sind”, dass die Aminosäuresequenz (A) und SEQ ID NO: (N) über ihre gesamte Länge abgeglichen sind, wobei sowohl die abgeglichene Aminosäuresequenz (A) als auch die abgeglichene SEQ ID NO: (N) Lückeninsertionen bezogen auf die jeweilige nichtabgeglichene Sequenz umfassen kann. Die prozentuelle Identität wird durch Bestimmen der Anzahl der Positionen, bei denen in der abgeglichenen Aminosäuresequenz (A) und der abgeglichenen SEQ ID NO: (N) identische Aminosäurereste auftreten, und Teilen der Anzahl der Positionen mit Übereinstimmung durch die Gesamtzahl der Reste der Bezugssequenz berechnet. Das Ergebnis, multipliziert mit 100, ergibt die prozentuelle Identität. Der Sequenzabgleich kann mithilfe der BLAST- und BLAST-2.0-Algorithmen durchgeführt werden, die in Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389–3402 und Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403–410 beschrieben werden.
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Bei der vorliegenden Erfindung sind Polypeptide gemäß b) oder c) oder d) oder f) oder g), d. h. künstliche oder natürlich vorkommende Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz, die zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 homolog oder davon abgeleitet ist; oder die von einem Polynukleotid kodiert werden, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die unter stringenten Bedingungen mit einem Komplement voller Länge von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 10 hybridisiert, Polypeptide, die „deletierte Aminosäuren” (Deletionen), „substituierte Aminosäuren” (Substitutionen) oder „insertierte Aminosäuren” (Insertionen) bezogen auf SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 aufweisen.
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Der Begriff „deletierte Aminosäure” oder „Deletion” bezeichnet die Modifizierung eines Polypeptids durch Entfernen einer oder mehrerer Aminosäuren. Deletionen können das Entfernen von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 oder mehr Aminosäuren bis zu 10% der Gesamtzahl der Aminosäuren in einem internen und/oder einem terminalen Teil von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 umfassen, wobei die enzymatische Aktivität erhalten bleibt.
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Der Begriff „Insertion” bezeichnet die Modifizierung eines Polypeptids durch Addition einer oder mehrerer Aminosäuren. Insertionen können die Addition von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 oder mehr Aminosäuren zu dem Polypeptid an verschiedenen Positionen in einem internen und/oder einem terminalen Teil von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 umfassen.
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Substitutionen bezeichnen das Ersetzen von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 oder mehr Aminosäuren in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 und können konservativ und/oder nichtkonservativ sein. Konservative Aminosäuresubstitution bezeichnet das Ersetzen eines Aminosäurerests durch einen Aminosäurerest mit ähnlichen Seitenketten oder aus der gleichen Klasse von Aminosäuren, beispielsweise von hydrophil zu hydrophil, von hydrophob zu hydrophob, von nichtpolar zu nichtpolar, polar zu polar, sauer zu sauer, basisch zu basisch, aromatisch zu aromatisch. In der folgenden Tabelle werden Beispiele von konservativen Substitutionen genannt:
| Rest | Konservative Substitutionen |
| Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Gly | Ala,Val, Leu, Ile, Ser, Gly |
| Asp, Glu | Asp, Glu |
| Gly, Met | Ala, Gly, Met |
| Lys, Arg | Lys, Arg |
| Asn, Gln, His | Asn, Gln, His |
| Trp, Phe, Tyr | Trp, Phe, Tyr |
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Nichtkonservative Substitution bezeichnet das Ersetzen einer Aminosäure des Polypeptids durch eine Aminosäure mit einer wesentlich verschiedenen Seitenkette und/oder wesentlich verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften. Eine nichtkonservative Aminosäuresubstitution kann die Struktur des Polypeptids, seine Hydrophobizität und/oder Nettoladung beeinflussen.
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Demgemäß betrifft die Erfindung auch Polypeptide mit der nachstehend aufgeführten Aminosäuresequenz, umfassend an jeder der Positionen 1–282 eine Aminosäure, die aus der entsprechenden, von eckigen Klammern umschlossenen Auswahlgruppe [...] ausgewählt ist, wobei „-” eine Lücke bezeichnet:
| Position | Aminosäure |
| 1 | [M] |
| 2 | [-FKLMRST] |
| 3 | [-L] |
| 4 | [-FM] |
| 5 | [-IPY] |
| 6 | [-AEP] |
| 7 | [-ADGQV] |
| 8 | [-DGQST] |
| 9 | [-ALMTV] |
| 10 | [-AGPQT] |
| 11 | [-AEHPST] |
| 12 | [-KNPQ] |
| 13 | [-IKQRSV] |
| 14 | [-FGHLTY] |
| 15 | [-APT] |
| 16 | [-DEGN] |
| 17 | [-LST] |
| 18 | [-AEKPRS] |
| 19 | [-DEGKST] |
| 20 | [-L] |
| 21 | [-KLPQR] |
| 22 | [-IKLNRSTV] |
| 23 | [-AIV] |
| 24 | [AFGILMV] |
| 25 | [ILV] |
| 26 | [T] |
| 27 | [G] |
| 28 | [AG] |
| 29 | [AG] |
| 30 | [AGRST] |
| 31 | [G] |
| 32 | [I] |
| 33 | [G] |
| 34 | [AKLRW] |
| 35 | [AG] |
| 36 | [ACIMV] |
| 37 | [AC] |
| 38 | [ADEHKLNQRST] |
| 39 | [ARST] |
| 40 | [LMY] |
| 41 | [AHSTV] |
| 42 | [AEGHKLQR] |
| 43 | [DEHQR] |
| 44 | [ADEGN] |
| 45 | [AFIRVW] |
| 46 | [AGKQRTW] |
| 47 | [ILV] |
| 48 | [AITVW] |
| 49 | [AIV] |
| 50 | [ACGIT] |
| 51 | [-D] |
| 52 | [-FILRV] |
| 53 | [-DN] |
| 54 | [-AEFGIKLPV] |
| 55 | [ADEGKRT] |
| 56 | [AFGLSW] |
| 57 | [AK] |
| 58 | [ADEKNQRS] |
| 59 | [ADEKNQRST] |
| 60 | [ATVW] |
| 61 | [ASV] |
| 62 | [ADEGHQS] |
| 63 | [ADEGS] |
| 64 | [ILV] |
| 65 | [-EGPRS] |
| 66 | [-ADEGKNQS] |
| 67 | [-A] |
| 68 | [-AEPQST] |
| 69 | [-DGLPST] |
| 70 | [-AEGRST] |
| 71 | [DEGHIMQR] |
| 72 | [-AHPST] |
| 73 | [-AEHILRTV] |
| 74 | [AGHLPS] |
| 75 | [-AHILRVW] |
| 76 | [AEGKPQRT] |
| 77 | [AILMV] |
| 78 | [D] |
| 79 | [V] |
| 80 | [RT] |
| 81 | [DEKNRS] |
| 82 | [APQR] |
| 83 | [ADENST] |
| 84 | [ADEGNQS] |
| 85 | [AILV] |
| 86 | [AEKQS] |
| 87 | [AKQRST] |
| 88 | [ALTV] |
| 89 | [ACFILRT] |
| 90 | [ADEQRS] |
| 91 | [ADEQRSTV] |
| 92 | [AILV] |
| 93 | [AILSTY] |
| 94 | [ADEG] |
| 95 | [AEIKLR] |
| 96 | [DFILMRY] |
| 97 | [GP] |
| 98 | [-GR] |
| 99 | [CILVY] |
| 100 | [DEGH] |
| 101 | [AILV] |
| 102 | [CLMVW] |
| 103 | [CHIV] |
| 104 | [ANS] |
| 105 | [N] |
| 106 | [A] |
| 107 | [G] |
| 108 | [IV] |
| 109 | [S] |
| 110 | [AFST] |
| 111 | [M] |
| 112 | [AEHNQR] |
| 113 | [AHKPR] |
| 114 | [AF] |
| 115 | [ILV] |
| 116 | [DE] |
| 117 | [AILV] |
| 118 | [PST] |
| 119 | [ADEIPV] |
| 120 | [DEGKQR] |
| 121 | [DEQR] |
| 122 | [FLWY] |
| 123 | [ADENQ] |
| 124 | [FQRY] |
| 125 | [NST] |
| 126 | [FLMV] |
| 127 | [ADNQS] |
| 128 | [IV] |
| 129 | [N] |
| 130 | [AILT] |
| 131 | [KR] |
| 132 | [AG] |
| 133 | [ITV] |
| 134 | [F] |
| 135 | [FILVY] |
| 136 | [ACSTV] |
| 137 | [GLNS] |
| 138 | [Q] |
| 139 | [AEIQTV] |
| 140 | [AFV] |
| 141 | [AGLT] |
| 142 | [R] |
| 143 | [AEHQR] |
| 144 | [FM] |
| 145 | [IKLSTV] |
| 146 | [ADEKNRS] |
| 147 | [AEQST] |
| 148 | [AEGNPQ] |
| 149 | [-IKPQRTV] |
| 150 | [-ADGKMPQRV] |
| 151 | [-P] |
| 152 | [-GNS] |
| 153 | [-ERS] |
| 154 | [-GS] |
| 155 | [-LV] |
| 156 | [-GR] |
| 157 | [-G] |
| 158 | [CKMSTV] |
| 159 | [IL] |
| 160 | [IV] |
| 161 | [AN] |
| 162 | [ITV] |
| 163 | [A] |
| 164 | [S] |
| 165 | [LM] |
| 166 | [A] |
| 167 | [AG] |
| 168 | [KR] |
| 169 | [IQRV] |
| 170 | [AG] |
| 171 | [-NR] |
| 172 | [AV] |
| 173 | [P] |
| 174 | [FLW] |
| 175 | [L] |
| 176 | [AST] |
| 177 | [DH] |
| 178 | [V] |
| 179 | [SV] |
| 180 | [A] |
| 181 | [S] |
| 182 | [K] |
| 183 | [F] |
| 184 | [AG] |
| 185 | [V] |
| 186 | [ILV] |
| 187 | [G] |
| 188 | [LW] |
| 189 | [TV] |
| 190 | [Q] |
| 191 | [AG] |
| 192 | [AFLM] |
| 193 | [A] |
| 194 | [CFGKRY] |
| 195 | [E] |
| 196 | [FL] |
| 197 | [AG] |
| 198 | [ADEPSV] |
| 199 | [DFHKQRSY] |
| 200 | [GHKQRS] |
| 201 | [I] |
| 202 | [LRT] |
| 203 | [V] |
| 204 | [N] |
| 205 | [ACS] |
| 206 | [IV] |
| 207 | [CN] |
| 208 | [P] |
| 209 | [G] |
| 210 | [FY] |
| 211 | [V] |
| 212 | [AEKR] |
| 213 | [T] |
| 214 | [GPS] |
| 215 | [M] |
| 216 | [Q] |
| 217 | [EST] |
| 218 | [R] |
| 219 | [E] |
| 220 | [AILV] |
| 221 | [ADEGQSV] |
| 222 | [W] |
| 223 | [E] |
| 224 | [A] |
| 225 | [AEHKMQRST] |
| 226 | [L] |
| 227 | [RST] |
| 228 | [GNQS] |
| 229 | [ILMSTV] |
| 230 | [ST] |
| 231 | [EPST] |
| 232 | [ADEQ] |
| 233 | [AEGQRV] |
| 234 | [V] |
| 235 | [FIKLQRV] |
| 236 | [ADENQ] |
| 237 | [ADELMS] |
| 238 | [MWY] |
| 239 | [ILV] |
| 240 | [ADGKQRS] |
| 241 | [ADQ] |
| 242 | [T] |
| 243 | [P] |
| 244 | [L] |
| 245 | [AGR] |
| 246 | [R] |
| 247 | [IL] |
| 248 | [EQ] |
| 249 | [AELQRT] |
| 250 | [AP] |
| 251 | [DE] |
| 252 | [D] |
| 253 | [IV] |
| 254 | [A] |
| 255 | [DGKNRT] |
| 256 | [ALSV] |
| 257 | [AIV] |
| 258 | [AFISV] |
| 259 | [F] |
| 260 | [L] |
| 261 | [ACLV] |
| 262 | [GS] |
| 263 | [DEGNPS] |
| 264 | [ADLQS] |
| 265 | [AS] |
| 266 | [DGNR] |
| 267 | [F] |
| 268 | [IM] |
| 269 | [T] |
| 270 | [G] |
| 271 | [EQ] |
| 272 | [AG] |
| 273 | [ILV] |
| 274 | [AENS] |
| 275 | [V] |
| 276 | [NT] |
| 277 | [G] |
| 278 | [G] |
| 279 | [AV] |
| 280 | [FWY] |
| 281 | [IMT] |
| 282 | [DFT] |
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Die Anzahl der Aminosäure-Modifizierungen in der Polypeptidsequenz kann 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 oder mehr Aminosäuren, bis zu 10% oder 20% oder sogar 30% der Gesamtzahl der Aminosäuren umfassen, wobei die katalytische Aktivität des Polypeptids bewahrt oder verbessert wird.
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Polynukleotide, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement voller Länge von beispielsweise Polynukleotiden mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 hybridisieren, umfassen Polynukleotide, die durch verschiedene Hybridisierungsverfahren, wie z. B. Koloniehybridisierung, Plaquehybridisierung, Southern-Hybridisierung, unter Verwendung der Komplement-DNA voller Länge von SEQ ID NO: 2 als Hybridisierungssonde nächweisbar sind. Ein geeignetes Hybridisierungsverfahren wird in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Auflage (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) beschrieben.
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Zur Hybridisierung wird das untersuchte Polynukleotid auf einem Filter immobilisiert und an das Polynukleotid-Komplement von beispielsweise SEQ ID NO: 2 in einer 0,7-1 M NaCl-Lösung bei 60°C hybridisiert. Anschließend wird das Filter mit einer 0,1- bis 2-fachen SSC-Lösung bei 65°C gewaschen, wobei eine 1-fache SSC-Lösung ein Gemisch sein soll, das aus 150 mM NaCl und 15 mM Natriumcitrat besteht.
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Ein Polynukleotid, das unter stringenten Bedingungen beispielsweise an das Komplement von SEQ ID NO: 2 hybridisiert, weist eine Nukleotidsequenz auf, bei der wenigstens 65%, vorzugsweise wenigstens 70% der Nukleotide mit den Nukleotiden von SEQ ID NO: 2 identisch sind.
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Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass der bei dem Verfahren verwendete Cofaktor durch die Wirkung einer Oxidoreduktase in Gegenwart eines sekundären Alkohols kontinuierlich regeneriert wird. Vorzugsweise wird NADH als Cofaktor verwendet, wobei das bei der Reduktion gebildete NAD zu NADH zurück reduziert wird.
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Die Cofaktor-Präferenz einer Oxidoreduktase für NADH könnte unter Verwendung von Mutageneseverfahren durch Mutieren der Cofaktor-Bindungsstelle zu einer Präferenz für NADPH verändert werden und umgekehrt.
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Bei den Verfahren gemäß der Erfindung wird der durch die Oxidoreduktase/Dehydrogenase gebildete oxidierte Cofaktor NAD oder NADP vorzugsweise kontinuierlich regeneriert.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der oxidierte Cofaktor NAD oder NADP durch Oxidation eines Alkohols regeneriert.
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Vorzugsweise wird für die Cofaktor-Regeneration ein sekundärer Alkohol der allgemeinen Formel RXRYCHOH verwendet, wobei RX und RY unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, einer verzweigten oder nichtverzweigten C1-C8-Alkylgruppe mit einer Gesamtzahl der Kohlenstoffatome von Cgesamt >= 3.
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Als Cosubstrate werden vorzugsweise sekundäre Alkohole verwendet, wie z. B. 2-Propanol, 2-Butanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 4-Methyl-2-pentanol, 2-Heptanol, 2-Octanol oder Cyclohexanol. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird 2-Propanol oder 4-Methyl-2-pentanol für die Coenzym-Regeneration verwendet. Die Menge an Cosubstrat für die Regeneration kann bei wassermischbaren sekundären Alkoholen von 5 bis 70 Vol.-% betragen, vorzugsweise von 5 bis 50%, bevorzugter von 5 bis 40%, höchst bevorzugt von 5 bis 20%, während die bevorzugte Konzentration bei nicht wassermischbaren sekundären Alkoholen, wie z. B. Methyl-2-pentanol, im Bereich von 5 bis 80% liegt, bevorzugter von 20 bis 80%, höchst bevorzugt von 40 bis 80%, bezogen. auf das Gesamtvolumen der Reaktionschargen.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Verfahren gemäß der Erfindung wird eine zusätzliche Oxidoreduktase/Dehydrogenase für die Regeneration des Cofaktors zugegeben.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann zusätzlich eine weitere Alkoholdehydrogenase für die Regeneration des Cofaktors zugegeben werden. Geeignete NADH-abhängige Alkoholdehydrogenasen sind beispielsweise aus Backhefe, Candida parapsilosis (CPCR) (
U.S.-Pat. Nr. 5,523,223 und
U.S.-Pat. Nr. 5,763,236 ,
Enzyme Microb. Technol., 1993, 15 (11): 950–8), Pichia capsulata (
EP1633779B1 ), aus Rhodococcus erythropolis (RECR) (
U.S.-Pat. Nr. 5,523,223 ),
Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10), 1999, S. 1721–1729;
Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, 62(4): 380–6;
Epub 2003, 26. Apr.) oder aus Rhodococcus ruber (
J. Org. Chem., 2003, 68(2): 402–6) erhältlich. Geeignete Cosubstrate für diese Alkoholdehydrogenasen sind beispielsweise die bereits genannten sekundären Alkohole wie 2-Propanol (Isopropanol), 2-Butanol, 2-Pentanol, 4-Methyl-2-pentanol, 2-Octanol und Cyclohexanol.
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Geeignete sekundäre Alkoholdehydrogenasen für die Regeneration von NADPH sind beispielsweise die vorstehend beschriebenen, isoliert aus Organismen der Ordnung der Lactobacillae, beispielsweise Lactobacillus kefir (
U.S.-Pat. Nr. 5,200,335 ), Lactobacillus brevis (
DE 19610984 A1 ;
Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., Dezember 2000; 56 Teil 12: 1696–8), Lactobacillus minor (
DE 10119274 ),
Leuconostoc carnosum (A 1261/2005, Kl. C12N), oder, wie beschrieben, jene aus Thermoanerobium brockii, Thermoanerobium ethanolicus oder Clostridium beijerinckii.
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Im Prinzip können auch andere Enzymsysteme für die Cofaktor-Regeneration verwendet werden. Beispielsweise kann die Cofaktor-Regeneration mithilfe von NAD- oder NADP-abhängiger Formiatdehydrogenase durchgeführt werden (Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187–193, Herstellung und Isolation von rekombinanter NAD- und NADP-spezifischer Formiatdehydrogenase auf dem Pilotmaßstab). Geeignete Cosubstrate von Formiatdehydrogenase sind beispielsweise Salze der Ameisensäure, wie z. B. Ammoniumformiat, Natriumformiat und Calciumformiat.
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Für die Umwandlung von 1 kg des Substrats Chinuclidin-3-on sollten 5000 bis 10 Mio. Einheiten Oxidoreduktase verwendet werden. Die Enzym-Aktivitätseinheit (U) ist als die Menge an Enzym definiert, die für die Umwandlung von 1 μmol Chinuclidin-3-on in den entsprechenden Alkohol pro Minute benötigt wird.
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Bei den Verfahren gemäß der Erfindung wird das Substrat Chinuclidin-3-on vorzugsweise in einer Menge von 10 g/l bis 500 g/l, vorzugsweise von 25 g/l bis 300 g/l, besonders bevorzugt von 50 g/l bis 200 g/l, bezogen auf das Gesamtvolumen, in der Reaktionscharge verwendet.
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Der wässrige Teil des Reaktionsgemischs, in dem die enzymatische Reduktion verläuft, enthält vorzugsweise einen Puffer, beispielsweise einen Kaliumphosphat-, Tris/HCl- oder Triethanolamin-Puffer mit einem pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise einem pH-Wert von 6 bis 9. Der Puffer kann zusätzlich Ionen zum Stabilisieren oder Aktivieren der Enzyme enthalten, wie z. B. Zink-Ionen oder Magnesium-Ionen.
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Bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung liegt die Temperatur geeignet im Bereich von 10°C bis 70°C, vorzugsweise von 20°C bis 45°C.
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Die Konzentration des Cofaktors, insbesondere von NADH oder NADPH, in der wässrigen Phase liegt im Allgemeinen im Bereich von 0,001 mM bis 10 mM.
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Die bei den Verfahren gemäß der Erfindung erzielte TTN (Gesamtwechselzahl, „total turnover number” = mol an reduzierter Verbindung der Formel I/mol an verwendetem Cofaktor) liegt gewöhnlich im Bereich von 102 bis 105, beträgt aber vorzugsweise >= 103.
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Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung kann auch ein Stabilisator der Oxidoreduktase/Dehydrogenase verwendet werden. Geeignete Stabilisatoren sind beispielsweise Glycerol, Sorbitol, 1,4-DL-Dithiothreitol (DTT) und Dimethylsulfoxid (DMSO).
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Bei einer weiteren möglichen Ausführungsform der Erfindung kann das oxidierte Cosubstrat (beispielsweise Aceton) kontinuierlich entfernt werden und/oder das Cosubstrat (beispielsweise 2-Propanol) kann auf kontinuierliche Weise neu zugegeben werden, um das Reaktionsgleichgewicht zu dem Reaktionsprodukt zu verschieben.
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Nach Abschluss der Reduktion wird das Reaktionsgemisch aufgearbeitet. Zu diesem Zweck wird beispielsweise gegebenenfalls die wässrige Phase von der organischen Phase abgetrennt und die organische Phase, die das Produkt enthält, wird filtriert. Gegebenenfalls kann die wässrige Phase auch extrahiert und wie die organische Phase weiter aufgearbeitet werden. Anschließend wird das Lösungsmittel von der organischen Phase abgedampft und das Produkt der allgemeinen Formel II oder III wird als rohes Produkt erhalten. Das rohe Produkt kann dann weiter gereinigt oder direkt für die Synthese eines Folgeprodukts verwendet werden.
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Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen weiter veranschaulicht.
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BEISPIEL 1
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Isolieren von Oxidoreduktase aus Mycobacterium vanbaalenii
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Zum Isolieren der NADH-abhängigen Oxidoreduktase aus Mycobacterium vanbaalenii wurde der Mikroorganismus in Pepton 5,0 g, Fleischextrakt 3,0 g pro Liter Wasser mit pH-Wert = 7,0 kultiviert. Bei Erreichen der stationären Phase wurden die Zellen geerntet und durch Zentrifugation von dem Medium abgetrennt. 5 g Mycobacterium-vanbaalenii-Zellen wurden mit 20 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, 1 mM MgCl2, pH-Wert = 7,0) suspendiert und homogenisiert. Der nach der Zentrifugation (7000 Upm) erhaltene Rohextrakt wurde weiter gereinigt und durch FPLC (schnelle Protein-Flüssigkeitschromatographie) weiter aufgearbeitet. Die Oxidoreduktase konnte in vier aufeinanderfolgenden Schritten durch Ionenaustauschchromatographie auf Butyl-Sepharose (Messrs. Pharmacia), zweimalige Reinigung auf Q-Sepharose Fast Flow (Messrs. Pharmacia) mit anschließender Hydroxyapatit-Chromatogrophie (Bio-Rad) gereinigt werden. Zu diesem Zweck wurde das nach der Zentrifugation erhaltene Lysat direkt auf eine Butyl-Sepharose-Säule aufgebracht, die mit 50 mM TEA, 1 mM MgCl
2, 1 M Ammoniumsulfat mit pH-Wert = 7,0 äquilibriert war, und mit einem abfallenden linearen Salzgradienten eluiert. Dabei wurde die Oxidoreduktase bei 0,2 bis 0,3 M Ammoniumsulfat eluiert. Die Oxidoreduktase-enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert und durch Ultrafiltration (Ausschlussgrenze 10 kDa) auf ein geeignetes Volumen konzentriert. Anschließend wurden die Oxidoreduktase-Fraktionen, die konzentriert worden sind, durch Q-Sepharose unter Verwendung von 50 mM Kaliumphosphatpuffer mit 1 mM MgCl
2 und 1 M NaCl aufgearbeitet und weiter gereinigt. Dabei wurde das Enzym bei 0,7–0,8 M NaCl eluiert. Anschließend wurden die aktiven Fraktionen konzentriert, mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert = 7,0, 1 mM MgCl
2 äquilibriert, auf die Hydroxyapatit-Säule aufgebracht und mit 200 mM Kaliumphosphatpuffer, 1 mM MgCl
2 eluiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst. TABELLE
| Reinigungsschritt | Proteinkonzentration | Gesamtprotein (mg) | Gesamtaktivität | Spezifische Aktivität |
| Zelllysat | 8,9 | 89 | 250 | 2,8 |
| Butyl-Sepharose | 5 | 7,5 | 115 | 15 |
| Q-Sepharose | 1,4 | 1,68 | 58 | 34 |
| Hydroxyapatit | 0,5 | 0,25 | 23 | 92 |
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Bestimmung der Proteinmenge wurde nach Lowry et al., Journal of Biological Chemistry, 193 (1951): 265–275 oder Peterson et al., Analytical Biochemistry, 100 (1979): 201–220 durchgeführt. Der Quotient der Enzymaktivität zu der Proteinmenge ergibt die spezifische Aktivität, wobei die Umwandlung von 1 μmol pro min 1 Einheit (U) entspricht.
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BEISPIEL 2
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Bestimmung der N-terminalen Sequenz der Oxidoreduktase gemäß der Erfindung
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Nach dem Schritt der Hydroxyapapitsäulenreinigung wurde das Enzympräparat aus Beispiel 1 in einem 10%-Natriumdodecylsulfat(SDS)-Gel fraktioniert und auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran (PVDF-Membran) überführt. Die auffällige Bande bei etwa 30 kDa wurde N-terminaler Sequenzierung über Edman-Abbau (Procise 492 (PE-Biosystems)) und Sequenzierung des markanten internen Peptids unterzogen. Es wurde folgende N-terminale Sequenz erhalten:
Sequenz des internen Peptids:
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BEISPIEL 3
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a) Klonieren der Oxidoreduktase aus Mycobacterium vanbaalenii
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Aus Zellen von Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 isolierte genomische DNA wurde als Templat für eine PCR-Reaktion mit degenerierten Primern verwendet, die auf der Grundlage der Proteinfragment-Sequenzen aus dem Edman-Abbau entworfen waren. Dabei wurde die Vervielfältigung in einem PCR-Puffer [16 mM (NH4)2SO4; 67 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3 (bei 25°C); 1,5 m MgCl2; 0,01% Tween 20; 0,2 mM dNTP Mix; in jedem Fall 30 pMol Primer und 1,25 U BioTherm-Star-Polymerase (Genecraft)] mit 50 ng genomischer DNA als Templat durchgeführt.
Zyklus 1: 95°C, 7 min
Zyklus 2 × 28: 94°C, 40 s
Temperaturabfall Start 63°C, –0,5°C/Schritt, 30 s
68°C, 60 s
Zyklus 3 × 20: 94°C, 40 s
53°C, 40 s
72°C, 60 s
Zyklus 4: 70°C, 7 min
4°C, [Unendlich]
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Nach der Fraktionierung der gesamten PCR-Charge in dem 1%-Agarose-Gel wurde eine Bande von etwa 650 by identifiziert und zur Bestimmung der DNA-Sequenz über überhängende Adenosineinheiten in einen Topo-TA-Vektor (Invitrogen) kloniert.
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Die DNA-Bande aus der Screening-Reaktion zeigte einen offenen Leserahmen, entsprechend einem Fragment einer Oxidoreduktase mit 227 Aminosäureresten.
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Die Bestimmung der gesamten Sequenz, die die Oxidoreduktase kodiert, wurde durch das invertierte PCR-Verfahren (iPCR) durchgeführt.
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Die Gensequenz, die die Oxidoreduktase kodiert, enthielt 771 Basenpaare und war einer Länge von 256 Aminosäureresten äquivalent.
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b) Synthese eines DNA-Fragments voller Länge, das eine kurzkettige ADH aus Mycobacterium vanbaalenii kodiert, durch PCR
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Für das anschließende Klonieren des Transkripts voller Länge in die geeigneten Expressionssysteme wurden spezifische Primer konstruiert. Dabei wurden ein 5'-Primer mit einer Erkennungssequenz für NdeI und ein 3'-Primer mit einer Erkennungssequenz für HindIII modifiziert. Genomische DNA, isoliert aus Zellen von Mycobacterium vanbaalenii, diente als Templat für die Polymerase-Kettenreaktion. Die Vervielfältigung wurde in einem PCR-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH-Wert = 8,0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO4; 1 mM dNTP-Mix; in jedem Fall 20 pMol Primer und 2,5 U Platinum Pfx DNA Polymerase (Invitrogen)] mit 50 ng Templat und folgenden Temperaturzyklen durchgeführt:
Zyklus 1: 94°C, 2 min
Zyklus 2 × 30: 94°C, 15 s
58°C, 30 s
68°C, 75 s
Zyklus 3: 68°C, 7 min
4°C, [Unendlich]
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Das erhaltene PCR-Produkt wurde nach Reinigung auf einem 1%-Agarose-Gel mithilfe der Endonukleasen NdeI und HindIII Restriktion unterworfen und in das Rückgrat des Vektors pET21a (Novagen) ligiert, welches Rückgrat mit den gleichen Endonukleasen behandelt worden war. Nach Transformation von 2 [mu]l der Ligationscharge in E.-coli-Top-10-F'-Zellen (Invitrogen) wurden Plasmid-DNAs von Ampicillin-(oder Kanamycin)-resistenten Kolonien durch Restriktionsanalyse mit den Endonukleasen NdeI und Hind auf das Vorhandensein eines Inserts mit einer Größe von 750 by geprüft. Das Expressionskonstrukt pET21-Myc wurde sequenziert. Das Gen aus Mycobacterium vanbalenii, das eine kurzkettige Oxidoreduktase kodiert, zeigte einen offenen Leserahmen von insgesamt 771 by (SEQ ID NO: 2), entsprechend einem Protein mit 256 Aminosäuren (SEQ ID NO: 1).
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BEISPIEL 4
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Expression von rekombinanter Oxidoreduktase in E.-coli-Zellen
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Kompetente Escherichia-coli-Star-BL21-(De3)-Zellen (Invitrogen) wurden mit den Expressionskonstrukten pET21-MIX, die die Oxidoreduktase kodieren, transformiert. Die mit den Expressionskonstrukten transformierten Escherichia-coli-Zellen wurden in 200 ml LB-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl) mit 50 μg/ml Ampicillin bzw. 40 μg/ml Kanamycin kultiviert, bis eine optische Dichte von 0,5, gemessen bei 550 nm, erreicht war. Die Expression von rekombinantem Protein wurde durch Zugeben von Isopropylthiogalactosid (IPTG) mit einer Konzentration von 0,1 mM induziert. Nach 16 Stunden Induktion bei 25°C und 220 Upm wurden die Zellen geerntet und bei – 20°C eingefroren. Für die Aktivitätsprüfung wurden 10 mg Zellen mit 500 μl 100 mM TEA-Puffer, pH-Wert = 7,0, 1 mM MgCl2 und 500 μl Glaskügelchen gemischt und 10 min unter Verwendung einer Glasmühle aufgebrochen. Das erhaltene Lysat wurde in einem verdünnten Zustand für die entsprechenden Messungen verwendet.
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Die Aktivitätsprüfung wurde folgendermaßen durchgeführt: 870 μl 100 mM TEA-Puffer, pH-Wert = 7,0, 1 mM MgCl2, 160 μg NADH, 10 μl verdünntes Zelllysat. Die Reaktion wurde durch Zugeben von 100 μl einer 100 mN-Substratlösung zu dem Reaktionsgemisch gestartet.
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Für die Enzymgewinnung in großen Mengen wurden 30 g Zellen in 150 ml Triethanolamin(TEA)-Puffer (100 mM, pH-Wert = 7, 2 mM MgCl2, 10% Glycerol) resuspendiert und mithilfe eines Hochdruckhomogenisators aufgebrochen. Anschließend wurde die Enzymlösung mit 150 ml Glycerol gemischt und bei –20°C aufbewahrt.
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BEISPIEL 5
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Bestimmung der Oxidoreduktaseaktivität für die Reduktion von Chinuclidin-3-on durch ein photometrisches Assay.
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Die Aktivität von wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellten Enzymen wurde als Aktivität der Oxidation von 1 μmol NADH zu NAD in einer Minute durch Zugeben des Substrats 3-Chinuclidinon (10 mM) und des Coenzyms NADH (0,25 mM) zu den 10 μl Enzymlösung in 1 ml 100 mM TEA-Puffer, pH-Wert = 7,0, ergänzt mit 1 mM MgCl
2, bestimmt. Die Abnahmerate der Extinktion bei 340 nm pro Minute geteilt durch den Absorptionskoeffizienten von NADH (6,22 M
–1cm
–1) ist proportional zu der Enzymaktivität (U) für die Reduktion von Chinuclidin-3-on zu dem entsprechenden Alkohol.
| Oxidoreduktase: | Aktivität (U/g Nassgewicht) |
| SEQ ID NO: 1 | 9000 U/g |
| SEQ ID NO: 3 | 281 U/g |
| SEQ ID NO: 5 | 1088 U/g |
| SEQ ID NO: 7 | 413 U/g |
| SEQ ID NO: 9 | 5000 U/g |
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BEISPIEL 6
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Charakterisierung von Oxidoreduktasen bezüglich der Reduktionseigenschaften für Chinuclidin-3-on Die Oxidoreduktasen mit den Polypeptidsequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 9 wurden durch folgendes Verfahren zur Bestimmung der Enantioselektivität und des Umwandlungswerts durch Reduktion von Chinuclidin-3-on zu dem entsprechenden Alkohol untersucht:
Rekombinante Escherichia coli, die die Gene der Oxidoreduktasen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 9 tragen, wurden wie in Beispiel 4 beschrieben kultiviert. 18 h nach der Induktion wurden 2 g von jedem der rekombinanten Stämme in 10 ml 100 mM Triethanolamin-Puffer, pH-Wert = 7,0, ergänzt mit 2 mM MgCl
2, resuspendiert und mithilfe der Glasmühle 10 min aufgebrochen. Die erhaltene Enzymlösung wurde durch Zentrifugation geklärt und mit einem gleichen Volumen Glycerol gemischt. Bei dem Reaktionsaufbau wurden 56 μl Enzymlösung für die Umwandlung von 75 mg Chinuclidin-3-on durch Zugeben von 0,15 mg NAD, 75 μl (10%) Oxidoreduktase aus Pichia capsulata, 250 μl Methyl-2-pentanol und 119 μl 100 mM TEA, pH-Wert = 6,5, ergänzt mit 2 mM MgCl
2 verwendet. Nach 24 h Inkubation der Proben bei 30°C wurden 10 μl der Reaktionslösung zu 1 ml MeOH zugegeben und durch GC analysiert. Zum Nachweisen der Enantiomere wurde eine Hydrodex-β-6TBDM-Säule (25 m × 0,25 mm × 0,25 μm) von Masherey-Nagel (Deutschland) verwendet.
| SEQ Nr: | SEQ ID NO: 1 | SEQ ID NO: 3 | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 7 | SEQ ID NO: 9 |
| Ee (%) | > 99 | > 95 | > 95 | > 95 | > 95 |
| Umwandlung (%) | 100 | > 78 | > 81 | 66 | > 84 |
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BEISPIEL 7
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Umwandlung von Chinuclidin-3-on zu dem entsprechenden (R)-3-Chinuclidinol auf dem 10 ml-Maßstab mit Methyl-2-pentanol als Cosubstrat
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Rekombinante Escherichia coli, die das Gen der Oxidoreduktase SEQ ID NO: 1 tragen, wurden wie in Beispiel 4 beschrieben kultiviert. 18 h nach der Induktion wurden 30 g geerntete Zellen in 100 ml 100 mM Triethanolamin(TEA)-Puffer, pH-Wert = 7,0, ergänzt mit 2 mM MgCl2, resuspendiert und mithilfe einer French-Presse aufgebrochen. Das erhaltene Lysat wurde durch 10 min Zentrifugation mit 6000 g bei 4°C geklärt. Für die Reduktion von 1,5 g 3-Chinuclidinon wurden 250 μl Enzymlösung (1125 U) zu den 4,05 ml 100 mM TEA-Puffer, pH-Wert = 6,5, ergänzt mit 2 mM MgCl2, 3 mg NAD, 225 U Alkoholdehydrogenase aus Pichia capsulata und 5 ml Methyl-2-pentanol zugegeben. Die Reaktionslösung wurde unter Rühren bei 30°C inkubiert. Nach 21 Stunden wurde die Reaktion durch Zugeben von 3 ml 5 M NaOH, 5 ml Methanol beendet und durch Gaschromatographie analysiert. Die gemessene Rate der Umwandlung zu (R)-3-Chinuclidinol betrug 98% mit einer optischen Reinheit des Produkts von > 99%.
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BEISPIEL 8
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Umwandlung von Chinuclidin-3-on zu dem entsprechenden (R)-3-Chinuclidinol auf dem 10 ml-Maßstab mit Isopropanol als Cosubstrat
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Rekombinante Escherichia coli, die das Gen der Oxidoreduktase SEQ ID NO: 1 tragen, wurden wie in Beispiel 4 beschrieben kultiviert. 18 h nach der Induktion wurden 30 g geerntete Zellen in 100 ml 100 mM Triethanolamin(TEA)-Puffer, pH-Wert = 7,0, ergänzt mit 2 mM MgCl
2, resuspendiert und mithilfe einer French-Presse aufgebrochen. Für die Reduktion von 1,5 g Chinuclidin-3-on wurden 525 U Enzym zu den 5,25 ml 100 mM TEA-Puffer, pH-Wert = 7,0, ergänzt mit 1 mM ZnCl
2, 1,5 mg NAD, 525 U Alkoholdehydrogenase aus Candida nemodendra (
WO2007012428 , SEQ ID NO: 8) und 1 ml Isopropanol zugegeben. Die Reaktionslösung wurde unter Rühren bei 30°C inkubiert. Nach 24 Stunden wurde die Reaktion durch Zugeben von 3 ml 5 M NaOH, 5 ml Methanol beendet und durch Gaschromatographie analysiert. Die gemessene Rate der Umwandlung zu (R)-3-Chinuclidinol betrug 100% mit einer optischen Reinheit des Produkts von > 99%.
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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