ES2682031T3

ES2682031T3 - Procedimiento enzimático de producción de (R)-3-quinuclidinol

Info

Publication number: ES2682031T3
Application number: ES14722148.5T
Authority: ES
Inventors: Anke Tschentscher; Maria Dupont; Antje Gupta
Original assignee: Cambrex IEP GmbH
Current assignee: Cambrex IEP GmbH
Priority date: 2013-04-30
Filing date: 2014-04-28
Publication date: 2018-09-18
Anticipated expiration: 2034-04-28
Also published as: EP2992106B1; DK2992106T3; RU2015140392A; IL242373B; PT2992106T; WO2014177492A1; US20160076066A1; EP2992106A1; PL2992106T3; KR102291199B1; DE102013104418B4; DE102013104418A1; RU2015140392A3; CN105051200A; JP2016517690A; HUE039077T2; KR20160002869A

Abstract

Procedimiento de producción de (R)-3-quinuclidinol o una sal del mismo por reducción de quinuclidin-3-ona con cofactor y oxidorreductasa, caracterizado porque la oxidorreductasa comprende un motivo de secuencia de aminoácidos MQX1REX2X3WEA, en el que cada uno de X1, X2 , X3 son cualquiera de los residuos de aminoácidos A (Ala), R (Arg), N (Asn), D (Asp), C (Cys), Q (Gln), E (Glu), G (Gly), H (His), I (Ile), L (Leu), K (Lys), M (Met), F (Phe), P (Pro), S (Ser), T (Thr), W (Trp), Y (Tyr) o V (Val), y porque la oxidorreductasa se selecciona de a) polipéptidos con una secuencia de aminoácidos, en la que al menos el 65 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3; o b) polipéptidos con una secuencia de aminoácidos, en la que al menos el 75 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:9; o c) polipéptidos con una secuencia de aminoácidos, en la que al menos el 85 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la SEQ ID NO:7.

Description

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Procedimiento enzimático de producción de (R)-3-quinuclidinol Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de (R)-3-quinudidinol ((3R)-1-azabiciclo [2.2.2] octan-3-ol, CAS #: 25333-42-0) o una sal del mismo (CAS #: 42437-96-7) de alta pureza óptica, \

imagen1

(R)-3-quinuclidinol [(3R)-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ol]

que comprende hacer reaccionar quinuclidin-3-ona con nuevas oxidoreductasas usando preferiblemente NADH como cofactor.

Antecedentes de la técnica

El (R)-3-quinuclidinol es un intermedio valioso para la síntesis de una amplia gama de productos farmacéuticos. En la industria farmacéutica se usa, por ejemplo, como sintón quiral para el potenciador de la cognición Talsaclidine, el agente para la incontinencia urinaria Solifenacin o el antagonista M3 Revatropate para el tratamiento del asma. Existen diferentes procedimientos conocidos para obtener quinuclidinol ópticamente activo tal como una reacción de reducción química usando un catalizador metálico (véase JPH9-194480A), resolución de mezclas racémicas de ésteres de (±) -3-quinuclidinol por reacción de hidrólisis enzimática (véase US5215918B, JPH10-136995A, JPH10- 210997A, JPH9-194480A), y la reducción enzimática de quinuclidin-3-ona usando biocatalizadores de células enteras o enzimas aisladas (véanse JP10243795, JP11196890, JP2002153293, JP2000245495).

Se informa que la preparación de (R)-3-quinuclidinol ópticamente puro a través de la reducción con catalizadores metálicos proporciona una eficacia inadecuada para la aplicación industrial, dado que la pureza óptica del producto de reducción es baja y se requieren etapas de purificación adicionales para obtener enantiómeros puros.

La preparación de (R)-3-quinuclidinol ópticamente puro a través de la resolución de mezclas racémicas de ésteres de (±)-3-quinuclidinol con proteasa tampoco es apropiada para la aplicación industrial, debido a la necesidad de eliminar los ésteres restantes de la mezcla de reacción y el consiguiente alto coste asociado.

Se ha informado la preparación de (R)-3-quinuclidinol ópticamente puro a través de la reducción enzimática de quinuclidin-3-ona a través de la biotransformación completa para células de los géneros Nakazaewaea, Candida, Proteus, Rhodotorula, Sporidiolobus, Rhodosporidium, Schizosaccharomyces, Cryptococcus, Trichisporon, Gordonia, Nocardia, Alcaligenes, Corynebacterium, Arthrobacter, Filobasisdium, Aureobasidium, Yarrowia, Geotrichum, Tsukamurella, Kurthia, Microbacterium, Kluyveromyces, Acremonium y Mucor (veánse, JP10243795, JP11196890, JP2002153293, JP2000245495). Las impurezas producidas por las células microbianas y/o reacciones secundarias causadas por otras enzimas contenidas en los microorganismos reducen la pureza óptica y el rendimiento del producto.

La preparación de (R)-3-quinuclidinol a través de procesos de oxidorreducción usando enzimas aisladas también se conoce en la técnica y se ha informado de enzimas de plantas de los géneros Datura y Hyoscyamus (Patente JP2003230398), así como enzimas de Rhodotorula (JP2007124922), Burkholderia (WO2010123062) y Microbacterium luteolum (Int J Mol Sci. 2012 Oct 19;13(10):13542-53). Recientemente, se ha cristalizado una alcohol deshidrogenasa, que reduce la quinuclidin-3-ona a partir de Agrobacterium tumerfacience (Acta crystallografica 10(2012) 68 (Pt 10): 1237-1239).

Debido al origen vegetal, las enzimas derivadas de Datura e Hyoscyamus son difíciles de fabricar industrialmente. Las enzimas que se originan en Rhodotorula y Burkholderia requieren NADPH caro como cofactor y glucosa deshidrogenasa para la regeneración de NADPH, lo que hace que el procedimiento de fabricación sea muy costoso.

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Hasta la fecha, el procedimiento más eficiente para la producción de (R)-3-quinuclidinol es informado por Isotani et al. (Int J Mol Sci. 2012 Oct 19;13(10):13542-53) para el procedimiento de reducción usando enzimas de Microbacterium luteolum. Las enzimas derivadas de Microbacterium luteolum requieren NADH como cofactor y una alcohol deshidrogenasa secundaria para la regeneración del cofactor junto con 2-propanol como cosustrato. Sin embargo, en este procedimiento de reducción enzimática, la carga del sustrato es limitada, supuestamente debido al efecto inhibidor de la quinuclidinol-3-ona sobre la actividad enzimática. Se podría lograr una carga máxima de sustrato del 10 % (p/v) añadiendo continuamente sustrato al lote de reacción, manteniendo así la concentración de quinuclidin-3-ona en el recipiente de reacción y la inhibición concomitante de las enzimas a un nivel apropiado. Se logró un rendimiento de conversión del 100 % a una carga de sustrato del 15 % (p/v) usando enzimas inmovilizadas. Sin embargo, la inmovilización de enzimas es elaborada y costosa e impone limitaciones en el volumen de reacción, que no son acordes con los requisitos de un procedimiento de fabricación industrial.

El artículo ""Expression, purification, crystallization and X-ray analysis of 3-quinuclidinone reductase from Agrobacterium temefaciens"; F. Hou, T. Miyakawa, D. Takeshita, M. Kataoka, A. Uzura, K. Nagata, S. Shimizu, M. Tanokura; Acta Crystallographica Section F; 2012; pp. 1237-1239 describe la sobreexpresión, purificación, cristalización y análisis estructural de la reductasa AtQR de Agrobacterium tumefaciens, que cataliza la reducción de 3-quinuclidinona a (R)-3-quinuclidinol con NADH como cofactor. El AtQR recombinante se obtuvo por sobreexpresión en Eschericia coli, se purificó, se cristalizó con NADH por difusión de vapor gota a gota y posteriormente se analizó por difracción de rayos X usando radiación de sincrotrón en Photon Factory, Tsukuba.

El documento científico "Structural basis for high substrate-binding affinity and enantioselectivity of 3-quinoclidinone reductase AtQR"; F. Hou, T. Miyakawa, M. Kataoka, D. Takeshita, S. Kumashiro, A. Uzura, N. Urano, K. Nagata, S. Shimizu, M. Tanokura; Biochem Biophys Res Comm; 2014; pp. 911-913 describen la estructura de AtQR de Agrobacterium tumefaciens, que cataliza la reducción de 3-quinuclidinona a (R)-3-quinuclidinol con NADH como cofactor. Con base en la estructura de AtQR, los autores calculan la afinidad de unión del sustrato y explican el mecanismo catalítico.

El documento JP 2008-212144 se refiere a una alcohol deshidrogenasa que es capaz de reducir asimétricamente 3- quinuclidinona o una de sus sales a (R)-3-quinuclidinol usando NADH como coenzima a alta pureza óptica y rendimiento.

El documento CN 103555608 A describe una quininona reductasa y su aplicación para la síntesis asimétrica de (R)- 3-quinuclidinol.

El artículo "Highly Efficient Synthesis of (R)-3-Quinuclidinol in a Space-Time Yield of 916 g L-1 d-1 Using a New Bacterial Reductase ArQ "; W.-X. Zhang, G.-C Xu, L. Huang, J. Pan, H.-L. Yu, J.-H. Xu; Organic Letters; 2013 Vol. 15, 19; pp. 4917-4919 describe una ceto reductasa derivada de Agrobacterium radiobacter ECU 2556 para la reducción enantioselectiva de 3-quinuclidinona a (R)-3-quinuclidinol usando NADH como coenzima.

El documento científico "Structural basis of stereospecific reduction by quinoclidinone reductase"; D. Takeshita, M. Kataoka, T. Miyakawa, K.-l. Miyazono, S. Kumashiro, T. Nagai, N. Urano, A. Uzura, K. Nagata, S. Shimizu, M. Tanokura; AMB Express; 2014 Vol. 4, 6; pp. 1-10 se refiere a la estructura y el sitio de unión de una 3-quinuclidinona reductasa dependiente de NADPH (RrQR) de Rodotorula rubra.

El número de enzimas conocidas para la reducción de quinuclidin-3-ona es limitado. Además, estas enzimas no están disponibles comercialmente y los procesos de reducción correspondientes tienen inconvenientes importantes. De este modo, existe la necesidad de un procedimiento eficiente e industrialmente aplicable de producción de (R)-3- quinuclidinol con nuevas oxidorreductasas recombinantes usadas como biocatalizador en la reacción de reducción.

Una oxidorreductasa apropiada para un procedimiento de reducción industrial de 3-quinuclidinona debe cumplir los siguientes requisitos:

1) expresión conmensurada en cepa recombinante (por ejemplo, en Escherichia coli);

2) alta estabilidad en solventes orgánicos, en particular en solventes orgánicos miscibles en agua tales como 2- propanol y 2-butanol;

3) actividad enzimática a alta concentración del sustrato 3-quinuclidinona sin verse adversamente afectada por la inhibición del sustrato o del producto;

4) el cumplimiento de la regeneración del cofactor acoplado a la enzima, en particular la regeneración del cofactor a través de la alcohol deshidrogenasa usando alcoholes secundarios como cosustratos.

La presente invención tiene el objetivo de proporcionar un procedimiento de preparación de (R)-3-quinuclidinol reduciendo quinuclidin-3-ona o una sal del mismo usando un cofactor y una oxidorreductasa aislada, un organismo recombinante que expresa dicha oxidorreductasa, o una preparación de un organismo que expresa dicha oxidoreductasa, tal como sus células permeabilizadas, lisadas o liofilizadas. La oxidorreductasa se selecciona de

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a) polipéptidos con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9 de la lista de secuencias; o

b) polipéptidos con una secuencia de aminoácidos derivada de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9 por sustitución, eliminación o adición de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno veintidós, veintitrés, veinticuatro, veinticinco, veintiséis, veintisiete, veintiocho, veintinueve, treinta, treinta y uno, treinta y dos, treinta y tres, treinta y cuatro, treinta y cinco, treinta y seis, treinta y siete, treinta y ocho, treinta y nueve, o cuarenta residuos de aminoácidos y que son capaces de reducir la quinuclidin-3-ona junto con un cofactor; o

c) polipéptidos con una secuencia de aminoácidos, en la que al menos el 65 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3, o en los que al menos el 70 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3, o en los que al menos 75 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:9, o en los que al menos 85 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:9, más preferiblemente en los que al menos 90 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:9, y que son capaces de reducir la quinuclidin-3-ona junto con un cofactor; o

d) polipéptidos con una secuencia de aminoácidos, en la que al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la SEQ ID NO:7, y que son capaces de reducir la quinuclidin-3-ona junto con un cofactor; o

e) polipéptidos que están codificados por un polinucleótido con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2 o SEQ ID nO:4 o SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 de la lista de secuencias; o

f) polipéptidos que están codificados por un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que hibrida con el complemento de longitud completa de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 bajo condiciones rigurosas, y que son capaces de reducir la quinuclidin-3-ona junto con un cofactor; en la que los polipéptidos comprenden un motivo de secuencia de aminoácidos MQX1REX2X3WEA, en el que cada uno de X1, X2, X3 es cualquiera de los residuos de aminoácidos A (Ala), R (Arg), N (Asn), D (Asp), C (Cys), Q (Gln), E (Glu), G (Gly), H (His), I (Ile), L (Leu), K (Lys), M (Met), F (Phe), P (Pro), S (Ser), T (Thr), W (Trp), Y (Tyr) o V (Val).

Preferiblemente, la oxidorreductasa se usa junto con el cofactor NADH o NADPH.

Se ha descubierto que los polipéptidos según a) o b) o c) o d) o f) son capaces de reducir eficientemente la quinuclidin-3-ona a su correspondiente (R)-alcohol. Sorprendentemente, la homología de secuencia (identidad) entre los polipéptidos para uso en la presente invención (véase la tabla 1) varía de 48 % a 72 %. Sin embargo, los polipéptidos tienen un motivo de secuencia de aminoácidos específico MQX1REX2X3WEA en común, que es característico de la actividad enzimática de estas proteínas en la reducción de quinuclidin-3-ona.

: SEQ ID NO: 1 Mycobacterium Vanbaalenii SEQ ID NO:3 Mycobacterium smegmatis SEQ ID NO:5 Caldilinea aerophila SEQ ID NO:7 Starkeya novella SEQ ID NO:9 Oceanithermus profundus

SEQ ID NO: 1 Mycobacteri um Vanbaalenii: 100 72 % 53 % 50 % 47 %

SEQ ID NO:3 Mycobacterium smegmatis: 72 % 100 53 % 48 % 45 %

SEQ ID NO:5 Caldilinea aerophila: 53 % 53 % 100 50 % 57 %

SEQ ID NO:7 Starkeya novella: 50 % 48 % 50 % 100 52 %

SEQ ID NO:9 Oceanithermus profundus: 47 % 45 % 57 % 52 % 100

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El motivo de secuencia MQXiReX2X3WEA está situado proximal al extremo C de las proteínas. Este hallazgo es proporcional a la estructura cristalina y por consiguiente en base al modelo de homología de la alcohol deshidrogenasa de cadena corta conocida, que revela que este motivo forma una cola de un bolsillo de unión de sustrato de la deshidrogenasa, en la que los residuos amino M, Q, R, E, W , E y A interactúan con el sustrato. De este modo, se postula que las alcohol deshidrogenasas de cadena corta que comprenden dicho motivo MQX1REX2X3WEA son apropiadas para la reducción de quinuclidin-3-ona.

Una oxidoreductasa apropiada para la reducción de quinuclidin-3-ona, preferiblemente al correspondiente R-alcohol, se entiende que es un polipéptido que en condiciones de reacción optimizadas produce un exceso enantiomérico del R-alcohol de al menos 50 %. En este documento, se entiende que las condiciones de reacción optimizadas son las condiciones de reacción en las que un polipéptido produce un exceso enantiomérico máximo del alcohol-R.

Se ha encontrado que los polipéptidos para usar en la presente invención proporcionan actividades apropiadas de oxidorreductasa y se pueden usar para reducir la quinuclidin-3-ona preferiblemente a (R)-3-quinuclidinol. El exceso enantiomérico alcanzable del alcohol R asciende a más de o igual a 50 %, preferiblemente mayor que o igual a 80 % y en particular preferiblemente mayor que o igual a 95 %. Cuando se usa la SEQ ID NO: 1, se puede lograr un exceso enantiomérico superior o igual al 99 %.

Las oxidorreductasas capaces de reducir la quinuclidin-3-ona al correspondiente (R)-3-quinuclidinol se pueden aislar a partir de bacterias del género Mycobacterium, en particular desde Mycobacterium vanbaalenii o desde Mycobacterium smegmatis, desde bacterias del género Caldilinea, en particular desde Caldilinea aerophila, desde bacterias del género Starkeya, en particular desde Starkeya novella, desde bacterias del género Oceanithermus, en particular desde Oceanithermus profundum.

Los polinucleótidos que codifican la oxidorreductasa para su uso en la presente invención se pueden obtener, por ejemplo, a partir del ADN genómico de la cepa PYR-1 de Bacterium Mycobacterium vanbaalenii o de la cepa ATCC 700084 de Mycobaterium smegmatis, de las bacterias del género Caldilinea, en particular de la cepa DSM 14535 de Caldilinea aerophila, de bacterias del género Starkeya, en particular de la cepa de DSM 506 de Starkeya novella, de bacterias del género Oceanithermus, en particular de Oceanithermus profundum usando técnicas de biología molecular conocidas.

El organismo que produce la oxidorreductasa es preferiblemente un organismo recombinante que sobreexpresa la oxidorreductasa. Preferiblemente, pero no se limita a, tal organismo recombinante es Escherichia coli. La oxidorreductasa expresada por un organismo recombinante puede usarse cualquiera en un estado completamente purificado, en un estado parcialmente purificado o como células que contienen el polipéptido. Las células que expresan el polipéptido se pueden usar en un estado nativo, permeabilizado, lisado o liofilizado.

Se describe adicionalmente el organismo que produce esta oxidoreductasa o una preparación de un organismo que expresa dicha oxidorreductasa, tales como sus células permeabilizadas, lisadas o liofilizadas, capaces de reducir enantioselectivamente la quinuclidin-3-ona a su correspondiente alcohol usando un cofactor.

Preferiblemente, la oxidorreductasa se usa junto con el cofactor NADH o NADPH.

En la presente divulgación, el término "secuencia de aminoácidos (A), en el que el (P) % porcentaje de aminoácidos es idéntico a los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: (N)" se refiere a la secuencia de aminoácidos ( A) y SEQ ID NO: (N) estando alineados en toda su longitud y en la que cualquiera de las secuencias de aminoácidos alineadas (A) y SEQ ID NO: (N) alineadas pueden comprender inserciones de brechas en relación con sus respectivas secuencias no alineadas. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones en las que se producen residuos de aminoácidos idénticos tanto en la secuencia de aminoácidos alineada (A) como en la SEQ ID NO: (N) alineada, y dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de residuos en la secuencia de referencia. El resultado, multiplicado por 100, produce el porcentaje de identidad. La alineación de las secuencias se puede llevar a cabo usando los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402 y Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403410.

El término "aminoácido suprimido" o "deleción" se refiere a la modificación de un polipéptido mediante la eliminación de uno o más aminoácidos, en una parte interna y/o terminal de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9 mientras se retiene la actividad enzimática.

El término "inserción" se refiere a la modificación de un polipéptido mediante la adición de uno o más aminoácidos al polipéptido en diversas posiciones en una parte interna y/o terminal de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9.

La sustitución se refiere a la sustitución de uno o más aminoácidos en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9 y puede ser conservadora y/o no conservadora. La sustitución de aminoácidos conservadora se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene cadenas laterales similares o que pertenece a la misma clase de aminoácidos, por ejemplo, desde hidrófilo a

hidrófilo, desde hidrófobo a hidrófobo, desde no polar a no polar, polar a polar, ácido a ácido, básico a básico, aromático a aromático. Ejemplos de sustituciones conservadoras se enumeran en la siguiente tabla:

Residuo: Sustituciones conservadoras

Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Gly
Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Gly

Asp, Glu
Asp, Glu

Gly, Met: Ala, Gly, Met

Lys, Arg
Lys, Arg

Asn, Gln, His
Asn, Gln, His

Trp, Phe, Tyr
Trp, Phe, Tyr

La sustitución no conservadora se refiere al reemplazo de un aminoácido en el polipéptido con un aminoácido con 5 propiedades de cadena lateral y/o fisicoquímicas significativamente diferentes. La sustitución de aminoácidos no conservadora puede afectar la estructura del polipéptido, su hidrofobicidad y/o su carga neta.

De acuerdo con lo anterior, la divulgación también se refiere a polipéptidos con la secuencia de aminoácidos enumerada a continuación, que comprende en cada una de las posiciones 1-282 un aminoácido seleccionado del grupo de selección correspondiente encerrado entre paréntesis cuadrados [...], en el que "-" designa un espacio:

Posición: Aminoácido

1: [-M]

2: [-FKLMRST]

3: [-L]

4: [-FM]

5: [-IPY]

6: [-AEP]

7: [-ADGQV]

8: [-DGQST]

9: [-ALMTV]

10: [-AGPQT]

11: [-AEHPST]

12: [-KNPQ]

13: [-IKQRSV]

14: [-FGHLTY]

15: [-APT]

16: [-DEGN]

17: [-LST]

18: [-AEKPRS]

19: [-DEGKST]

20: [-L]

21: [-KLPQR]

Posición: Aminoácido

22: [-IKLNRSTV]

23: [-AIV]

24: [AFGILMV]

25: [ILV]

26: [T]

27: [G]

28: [AG]

29: [AG]

30: [AGRST]

31: [G]

32: [I]

33: [G]

34: [AKLRW]

35: [AG]

36: [ACIMV]

37: [AC]

38: [ADEHKLNQRST]

39: [ARST]

40: [LMY]

41: [AHSTV]

42: [AEGHKLQR]

43: [DEHQR]

44: [ADEGN]

45: [AFIRVW]

46: [AGKQRTW]

47: [ILV]

48: [AITVW]

49: [AIV]

50: [ACGIT]

51: [-D]

52: [-FILRV]

53: [-DN]

54: [-AEFGIKLPV]

Posición: Aminoácido

55: [ADEGKRT]

56: [AFGLSW]

57: [AK]

58: [ADEKNQRS]

59: [ADEKNQRST]

60: [ATVW]

61: [ASV]

62: [ADEGHQS]

63: [ADEGS]

64: [ILV]

65: [-EGPRS]

66: [-ADEGKNQS]

67: [-A]

68: [-AEPQST]

69: [-DGLPST]

70: [-AEGRST]

71: [DEGHIMQR]

72: [-AHPST]

73: [-AEHILRTV]

74: [AGHLPS]

75: [-AHILRVW]

76: [AEGKPQRT]

77: [AILMV]

78: [D]

79: [V]

80: [RT]

81: [DEKNRS]

82: [APQR]

83: [ADENST]

84: [ADEGNQS]

85: [AILV]

86: [AEKQS]

87: [AKQRST]

Posición: Aminoácido

88: [ALTV]

89: [ACFILRT]

90: [ADEQRS]

91: [ADEQRSTV]

92: [AILV]

93: [AILSTY]

94: [ADEG]

95: [AEIKLR]

96: [DFILMRY]

97: [GP]

98: [-GR]

99: [CILVY]

100: [DEGH]

101: [AILV]

102: [CLMVW]

103: [CHIV]

104: [ANS]

105: [N]

106: [A]

107: [G]

108: [IV]

109: [S]

110: [AFST]

111: [M]

112: [AEHNQR]

113: [AHKPR]

114: [AF]

115: [ILV]

116: [DE]

117: [AILV]

118: [PST]

119: [ADEIPV]

120: [DEGKQR]

121: [DEQR]

Posición: Aminoácido

122: [FLWY]

123: [ADENQ]

124: [FQRY]

125: [NST]

126: [FLMV]

127: [ADNQS]

128: [IV]

129: [N]

130: [AILT]

131: [KR]

132: [AG]

133: [ITV]

134: [F]

135: [FILVY]

136: [ACSTV]

137: [GLNS]

138: [Q]

139: [AEIQTV]

140: [AFV]

141: [AGLT]

142: [R]

143: [AEHQR]

144: [FM]

145: [IKLSTV]

146: [ADEKNRS]

147: [AEQST]

148: [AEGNPQ]

149: [-IKPQRTV]

150: [-ADGKMPQRV]

151: [-P]

152: [-GNS]

153: [-ERS]

154: [-GS]

155: [-LV]

Posición: Aminoácido

156: [-GR]

157: [-G]

158: [CKMSTV]

159: [IL]

160: [IV]

161: [AN]

162: [ITV]

163: [A]

164: [S]

165: [LM]

166: [A]

167: [AG]

168: [KR]

169: [IQRV]

170: [AG]

171: [-NR]

172: [AV]

173: [P]

174: [FLW]

175: [L]

176: [AST]

177: [DH]

178: [Y]

179: [SV]

180: [A]

181: [S]

182: [K]

183: [F]

184: [AG]

185: [V]

186: [ILV]

187: [G]

188: [LW]

Posición: Aminoácido

189: [TV]

190: [Q]

191: [AG]

192: [AFLM]

193: [A]

194: [CFGKRY]

195: [E]

196: [FL]

197: [AG]

198: [ADEPSV]

199: [DFHKQRSY]

200: [GHKQRS]

201: [I]

202: [LRT]

203: [V]

204: [N]

205: [ACS]

206: [IV]

207: [CN]

208: [P]

209: [G]

210: [FY]

211: [V]

212: [AEKR]

213: [T]

214: [GPS]

215: [M]

216: [Q]

217: [EST]

218: [R]

219: [E]

220: [AILV]

221: [ADEGQSV]

Posición: Aminoácido

222: [W]

223: [E]

224: [A]

225: [AEHKMQRST]

226: [L]

227: [RST]

228: [GNQS]

229: [ILMSTV]

230: [ST]

231: [EPST]

232: [ADEQ]

233: [AEGQRV]

234: [V]

235: [FIKLQRV]

236: [ADENQ]

237: [ADELMS]

238: [MWY]

239: [ILV]

240: [ADGKQRS]

241: [ADQ]

242: [T]

243: [P]

244: [L]

245: [AGR]

246: [R]

247: [IL]

248: [EQ]

249: [AELQRT]

250: [AP]

251: [DE]

252: [D]

253: [IV]

254: [A]

Posición: Aminoácido

255: [DGKNRT]

256: [ALSV]

257: [AIV]

258: [AFISV]

259: [F]

260: [L]

261: [ACLV]

262: [GS]

263: [DEGNPS]

264: [ADLQS]

265: [AS]

266: [DGNR]

267: [F]

268: [IM]

269: [T]

270: [G]

271: [EQ]

272: [AG]

273: [ILV]

274: [AENS]

275: [V]

276: [NT]

277: [G]

278: [G]

279: [AV]

280: [FWY]

281: [IMT]

282: [DFT]

El número de modificaciones de aminoácidos en la secuencia polipeptídica se define en las reivindicaciones y puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 3, 5 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 aminoácidos, mientras que retiene o mejora la actividad catalítica del polipéptido.

Los polinucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con el complemento de longitud completa de, por ejemplo, polinucleótidos con secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2 comprenden polinucleótidos que son detectables mediante diversas técnicas de hibridación, tales como hibridación de colonias, hibridación de placas, hibridación Southern usando el complemento ADN de longitud completa de la SEQ ID NO: 2 como sonda de hibridación. Un 10 procedimiento de hibridación apropiado se describe en Molecular Cloning, A laboratory manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

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Para la hibridación, el polinucleótido bajo investigación se inmoviliza en un filtro y se híbrida con el complemento polinucleotídico de, por ejemplo SEQ ID No: 2 en una solución de NaCl 0,7-1 M a 60°C. Posteriormente, el filtro se lava con una solución de SSC de 0,1 a 2 veces a 65°C, en la que se entiende que una solución de SSC de 1 vez es una mezcla que consiste en NaCl 150 mM y citrato de sodio 15 mM.

Un polinucleótido que hibrida, por ejemplo, con el complemento de la SEQ ID No: 2 en condiciones rigurosas tiene una secuencia de nucleótidos, en la que al menos el 65 %, preferiblemente al menos el 70 % de nucleótidos son idénticos a los nucleótidos de la SEQ ID NO:2.

Una realización preferida de la invención se caracteriza porque el cofactor usado en el procedimiento se regenera continuamente por la acción de una oxidorreductasa en presencia de alcohol secundario. Preferiblemente, se usa NADH como el cofactor, reduciéndose el NAD formado en la reducción nuevamente a NADH.

La preferencia de cofactor de una oxidoreductasa por NADH se podría cambiar por la preferencia por NADPH y revertirse usando técnicas de mutagénesis mutando el sitio de unión del cofactor.

En los procedimientos según la invención, el cofactor oxidado NAD o NADP formado por la oxidorreductasa/deshidrogenasa se regenera preferiblemente de forma continua.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, el cofactor oxidado NAD o NADP se regenera por oxidación de un alcohol.

Preferiblemente, se usa un alcohol secundario de fórmula general RxRyCHOH para la regeneración de cofactores, en la que Rx y Ry se seleccionan independientemente de hidrógeno, un grupo alquilo C1-C8 ramificado o no ramificado, en el que el número total de átomos de carbono es Ctotal> = 3.

Los alcoholes secundarios tales como 2-propanol, 2-butanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-heptanol, 2-octanol o ciclohexanol se usan preferiblemente como cosustratos. De acuerdo con una realización particularmente preferida, se usa 2-propanol o 4-metil-2-pentanol para la regeneración de coenzima. La cantidad de cosustrato para la regeneración puede variar en el caso de alcoholes secundarios miscibles con agua de 5 a 70 % en volumen, preferiblemente de 5 a 50 %, más preferiblemente de 5 a 40 %, más preferiblemente de 5 a 20 %, mientras que en el en el caso de alcoholes secundarios inmiscibles en agua tales como metil-2-pentanol, la concentración preferida varía desde 5 a 80 %, más preferiblemente desde 20 a 80 %, más preferido desde 40 a 80 % en base al volumen total de los lotes de reacción.

De acuerdo con una realización preferida adicional de los procedimientos según la invención, se añade una oxidoreductasa/deshidrogenasa adicional para la regeneración del cofactor.

En una realización preferida adicional, adicionalmente se puede añadir una alcohol deshidrogenasa adicional para la regeneración del cofactor. Las alcohol deshidrogenasas dependientes de NADH apropiadas se pueden obtener, por ejemplo, de levadura de panadería, de Candida parapsilosis (CPCR) (la Patente de los Estados Unidos No. 5,523,223 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,763,236, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15(11):950-8), Pichia capsulata (EP1633779B1), a partir de Rhodococcus erythropolis (RECR) (la Patente de los Estados Unidos No. 5,523,223), Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10), 1999, p. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, 62(4):380-6; Epub 2003, Apr. 26) o a partir de Rhodococcus ruber (J. Org. Chem., 2003, 68(2):402-6). Los cosustratos apropiados para esas alcohol deshidrogenasas son, por ejemplo, los alcoholes secundarios ya mencionados tales como 2-propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-octanol o ciclohexanol.

Las alcohol deshidrogenasas secundarias apropiadas para la regeneración de NADPH son, por ejemplo, aquellas descritas anteriormente y aisladas de organismos del orden de Lactobacillales, por ejemplo, Lactobacillales, por ejemplo, Lactobacillus kefir (la Patente de los Estados Unidos No. 5,200,335), Lactobacillus brevis (DE 19610984 A1; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000 December; 56 Pt 12:1696-8), Lactobacillus minor (De 10119274), Leuconostoc carnosum (A 1261/2005, Kl. C12N) o, como se describe, las de Thermoanerobium brockii, Thermoanerobium ethanolicus o Clostridium beijerinckii.

Sin embargo, otros sistemas enzimáticos pueden, en principio, usarse también para la regeneración de cofactores. Por ejemplo, la regeneración del cofactor se puede efectuar usando formiato deshidrogenasa dependiente de NAD o NADP (Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase). Los cosustratos apropiados de la formiato deshidrogenasa son, por ejemplo, sales de ácido fórmico tales como formiato de amonio, formiato de sodio o formiato de calcio.

Para la conversión de 1 kg del sustrato quinuclidin-3-ona se debe aplicar 5000 a 10 Mio.Unidades de oxidoreductasa. La unidad de actividad enzimática (U) se define como la cantidad de enzima requerida para la conversión de 1 mmol de quinuclidin-3-ona en el alcohol correspondiente por minuto.

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En los procedimientos según la invención, el sustrato quinuclidin-3-ona se usa en el lote de reacción preferiblemente en una cantidad desde 10 g/l a 500 g/l, preferiblemente de 25 g/l a 300 g/l, de forma particular preferida desde 50 g/l a 200 g/l, en base al volumen total.

La porción acuosa de la mezcla de reacción en la que procede la reducción enzimática contiene preferiblemente una solución reguladora, por ejemplo, una solución reguladora de fosfato de potasio, tris/HCl o trietanolamina, que tiene un valor de pH de 5 a 10, preferiblemente un pH desde 6 a 9. Además, la solución reguladora puede contener iones para estabilizar o activar las enzimas tales como, por ejemplo, iones de zinc o iones de magnesio.

Mientras se lleva a cabo el procedimiento según la invención, la temperatura varía adecuadamente de aproximadamente 10° C a 70° C, preferiblemente de 20° C a 45° C.

La concentración del cofactor, en particular de NADH o NADPH, respectivamente, en la fase acuosa generalmente varía desde 0,001 mM a 10 mM.

El TTN (número de renovación total = mol de compuesto reducido de fórmula I/mol de cofactor usado) conseguido en los procedimientos según la invención normalmente varía desde 102 a 105, preferiblemente, sin embargo, es > = 103.

En el procedimiento según la invención, también se puede usar un estabilizador de oxidorreductasa/deshidrogenasa. Los estabilizantes apropiados son, por ejemplo, glicerol, sorbitol, 1,4-DL-ditiotreitol (DTT) o dimetilsulfóxido (DMSO).

De acuerdo con otra posible realización de la invención, el cosustrato oxidado (por ejemplo, acetona) puede eliminarse continuamente y/o puede añadirse nuevamente el cosustrato (por ejemplo, 2-propanol) de una manera continua con el fin de desplazar el equilibrio de la reacción hacia el producto de reacción.

Después de completar la reducción, la mezcla de reacción se procesa. Para este propósito, por ejemplo, la fase acuosa se separa opcionalmente de la fase orgánica y la fase orgánica que contiene el producto se filtra. Opcionalmente, la fase acuosa también se puede extraer y procesar adicionalmente como la fase orgánica. A continuación, el solvente se evapora de la fase orgánica y el producto de fórmula general II o III se obtiene como un producto en bruto. El producto en bruto se puede purificar posteriormente o usar directamente para la síntesis de un producto resultante.

A continuación, la invención se ilustra adicionalmente a modo de ejemplos.

Ejemplo 1

Aislamiento de Oxidoreductasa a partir de Mycobacterium vanbaalenii

Para aislar la oxidorreductasa dependiente de NADH de Mycobacterium vanbaalenii, el microorganismo se cultivó en peptona 5,0 g, extracto de carne 3,0 g por litro de agua, pH 7,0.

Al alcanzar la fase estacionaria, las células se recogieron y se separaron del medio mediante centrifugación. Se suspendieron 5 g de células de Mycobacterium vanbaalenii con 20 ml de solución reguladora (trietanolamina 100 mM, MgCl21 mM, pH = 7,0) y se homogeneizaron. El extracto en bruto obtenido después de la centrifugación (7000 rpm) se purificó luego adicionalmente y se volvió a procesar a través de FPLC (cromatografía líquida de proteína rápida). La oxidoreductasa se pudo purificar en cuatro etapas consecutivas mediante cromatografía de intercambio iónico en butil-sefarosa (Messrs. Pharmacia), dos veces de purificación en Q-sefarosa Fast Flow (Messrs. Pharmacia) con la siguiente hidroxiapatita-cromatografía (Bio-Rad). Para este propósito, el lisado obtenido después de la centrifugación se aplicó directamente a una columna de Butil-Sefarosa equilibrada con 50 mM de TEA, MgCh 1 mM, sulfuro de amonio 1M, pH = 7,0, y se eluyó con un gradiente de sal lineal decreciente. Al hacerlo, la oxidorreductasa se eluyó a 0,2 a 0,3 M de sulfato de amonio. Las fracciones que contienen oxidorreductasa se combinaron y se concentraron a un volumen apropiado por medio de ultrafiltración (límite de exclusión 10 kDa). Posteriormente, las fracciones de oxidorreductasa que se habían concentrado se reprocesaron y se purificaron adicionalmente mediante Q-sefarosa, usando solución reguladora de Kaliumphosphate 50 mM con MgCh 1 mM y NaCl 1M. La enzima se eluyó por consiguiente con NaCl 0,7-0,8 M. Posteriormente, las fracciones activas se concentraron y se equilibraron con solución reguladora Kaliumphosphate 10 mM, pH 7,0, MgCh 1 mM y se aplicaron sobre la columna de hidroxiapatita y se eluyeron con solución reguladora de Kaliumphosphate 200 mM, MgCl2 1 mM. La siguiente tabla resume los resultados obtenidos.

TABLA

Etapa de purificación: Concentración de proteína Proteína total (mg) Actividad total Actividad específica

Lisado celular: 8,9 89 250 2,8

Butil-sefarosa: 5 7,5 115 15

5

10

15

20

25

30

35

40

Q-sefarosa: 1,4 1,68 58 34

Hidroxiapatita: 0,5 0,25 23 92

La determinación de la cantidad desde proteína se realizó según Lowry et al. Journal of Biological Chemistry, 193 (1951): 265 - 275 o Peterson et al., Analytical Biochemistry, 100 (1979): 201 - 220). El cociente entre la actividad de la enzima y la cantidad desde proteína produce la actividad específica, en la que la conversión de 1 |jmol por minuto corresponde a 1 unidad (U).

Ejemplo 2

Determinación de la secuencia N-terminal de la oxidorreductasa según la invención

Después de la etapa de purificación de columna de hidroxiapaptita, la preparación de enzima según el ejemplo 1 se fraccionó en un gel de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10 % y se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno (membrana de PVDF).

La banda claramente visible a aproximadamente 30 kDa se sometió a secuenciación N-terminal mediante degradación de Edman (Procise 492 (PE-Biosystems)) y a la secuenciación del péptido interno prominente. Se obtuvo la siguiente secuencia N-terminal:

TRTVVVTGAGSGIGR

Secuencia de péptido interno:

LEQADDVAR

Ejemplo 3

a) Clonación de la Oxidoreductasa de Mycobacterium vanbaalenii

Se usó ADN genómico aislado de las células de Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 como plantilla para la reacción de PCR con cebadores degenerados diseñados en base a las secuencias de fragmentos de proteínas de la degradación de Edman. Al hacerlo, la amplificación se llevó a cabo en una solución reguladora de pCr [(NH4) 2SO4 16 mM; Tris-HCl 67 mM, pH 8,3 (a 25 °C); MgCl2 1,5 m; 0,01 % de Tween 20; Mezcla dNTP 0,2 mM; en cada caso 30 pMol de cebador y 1,25 U de BioTherm Star Polymerase (Genecraft)] con 50 ng de ADN genómico como plantilla.

Ciclo 1: 95 °C, 7 min

Ciclo 2 x 28: 94 °C, 40 s

La caída de temperatura comienza a 63 °C -0,5 °C/etapa, 30 s 68 °C, 60 s

Ciclo 3 x 20: 94 °C, 40 s 53 °C, 40 s 72 °C, 60 s Ciclo 4: 70 °C, 7 min 4 °C, [infinito]

Después del fraccionamiento de todo el lote de PCR en el gel de agarosa al 1 %, se identificó una banda de aproximadamente 650 y se clonó a través de unidades estructurales de adenosina en un vector Topo-TA (Invitrogen) para la determinación de la secuencia de ADN.

La banda de ADN resultante de la reacción de selección mostró un marco de lectura abierto correspondiente al fragmento de una oxidorreductasa de 227 residuos de aminoácidos.

La determinación de la secuencia completa que codifica la oxidorreductasa se realizó mediante el procedimiento de PCR invertida (iPCR).

La secuencia del gen que codifica la oxidorreductasa incluía 771 pares de bases y era equivalente a una longitud de 256 residuos de aminoácidos.

5

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25

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50

b) Síntesis de una codificación de fragmentos de ADN de longitud completa para una ADH de cadena corta de Mycobacterium vanbaalenii mediante PCR

Se construyeron cebadores específicos para la clonación posterior del transcrito de longitud completa en los sistemas de expresión apropiados. Al hacerlo, se modificaron un cebador 5' con una secuencia de reconocimiento para Nde I y un cebador 3' con una secuencia de reconocimiento para Hind III. El ADN genómico aislado de las células de Mycobacterium vanbaalenii sirvió como plantilla para la reacción en cadena de la polimerasa. La amplificación se llevó a cabo en una solución reguladora de pCr [Tris-HCl 10 mM (pH 8,0); KCl 50 mM; 10 mM de MgSO4; Mezcla dNTP 1 mM; en cada caso 20 pMol de cebador y 2,5 U de polimerasa de ADN Platinum Pfx (Invitrogen)] con 50 ng de plantilla y los siguientes ciclos de temperatura:

Ciclo 1: 94 °C, 2 minutos

Ciclo 2 x 30: 94 °C, 15 s

58 °C, 30 s

68 °C, 75 s

Ciclo 3: 68 °C, 7 min

4 °C, [infinito]

El producto de PCR resultante se restringió después de la purificación sobre un gel de agarosa al 1 % con la ayuda de las endonucleasas Nde I y Hind III y se ligó en el esqueleto del vector pET21a (Novagen), cuyo esqueleto se había tratado con las mismas endonucleasas. Después de transformar 2 [mu]I del lote de unión en células E. coli Top 10 F' (Invitrogen), se analizaron los ADN plásmidos de colonias resistentes a ampicilina (o kanamicina) para detectar la presencia de un inserto que tiene un tamaño de 750 por medio de un análisis de restricción con las endonucleasas Nde I y Hind. La construcción de expresión pET21-Myc fue secuenciada. El gen de Mycobacterium vanbalenii que codifica una oxidorreductasa de cadena corta tenía un marco de lectura abierto de un total de 771 mediante (SEQ ID No: 2), que correspondía a una proteína de 256 aminoácidos (SEQ ID No: 1).

Ejemplo 4.

Expresión de oxidoreductasa recombinante en Células de E. Coli

Se transformaron células competentes de Escherichia coli Star BL21 (De3) (Invitrogen) con las construcciones de expresión pET21-MIX que codifican la oxidorreductasa. Las células de Escherichia coli transformadas con las construcciones de expresión se cultivaron luego en 200 ml de medio LB (1 % de triptona, 0,5 % de extracto de levadura, 1 % de NaCl) con 50 |ig/ml de ampicilina o 40 |ig/ml de kanamicina, respectivamente, hasta que densidad óptica de 0,5, medida a 550 nm, se alcanzó. La expresión de la proteína recombinante se indujo añadiendo isopropiltiogalactósido (IPTG) con una concentración de 0,1 mM. Después de 16 horas de inducción a 25°C y 220 rpm, las células se recogieron y congelaron a -20°C. Para la prueba de actividad, se mezclaron 10 mg de células con 500 |il de solución reguladora TEA 100 mM pH 7,0, MgCh 1 mM y 500 |il de perlas de vidrio y se rompieron durante 10 minutos usando un molino de vidrio. El lisado obtenido se usó luego en un estado diluido para las mediciones respectivas.

La prueba de actividad se realizó de la siguiente manera: 870 |il de solución reguladora de TEA 100 mM pH 7,0, MgCl2 1 mM, 160 |ig de NADH, 10 |il de lisado celular diluido. La reacción se inició añadiendo 100 |il de una solución de sustrato 100 mM a la mezcla de reacción.

Para la recuperación de enzimas en grandes cantidades, se resuspendieron 30 g de células en 150 ml de solución reguladora de trietanolamina (TEA) (100 mM, pH 7, MgCl2 2 mM, glicerol al 10 %) y se rompieron usando un homogeneizador de alta presión. Posteriormente, la solución de enzima se mezcló con 150 ml de glicerol y se almacenó a -20° C.

Ejemplo 5

Determinación de la actividad oxidorreductasa para la reducción de quinuclidin-3-ona por ensayo fotométrico.

La actividad de las enzimas preparadas como se describe en el ejemplo 4 se determinó como actividad de oxidación de 1 |imol de NADH a NAD en un minuto añadiendo el sustrato 3-quinuclidinona (10 mM), una coenzima NADH (0,25 mM) a los 10 |il de solución de enzima en 1 ml de solución reguladora de TEA 100 mM, pH 7,0 suplementado con MgCl2 1 mM. La velocidad de disminución de la absorbancia a 340 nm por minuto dividida mediante el coeficiente de absorbancia para NADH (6,22 M-1 cm-1) es proporcional a la actividad de la enzima (U) para la reducción de quinuclidin-3-ona al correspondiente alcohol.

Oxidoreductasa:

Actividad (U/g de peso

: húmedo)

SEQ ID NO: 1: 9000 U/g

SEQ ID NO:3: 281 U/g

SEQ ID NO:5: 1088 U/g

SEQ ID NO:7: 413 U/g

SEQ ID NO:9: 5000 U/g

Ejemplo 6

Caracterización de oxidoreductasas con respecto a las propiedades de reducción de quinuclidin-3-ona

Las oxidorreductasas de las secuencias polipeptídicas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 y 5 SEQ ID NO:9 se examinaron para la determinación de la enantioselectividad y el valor de conversión por la reducción de quinuclidin-3-ona al alcohol correspondiente mediante el siguiente procedimiento:

Escherichia coli recombinante que porta los genes de las oxidorreductasas de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 y SeQ iD NO:9 se cultivaron como se describe en el ejemplo 4. 18 h después de la inducción, se resuspendieron 2 g de cada cepa recombinante en 10 ml de solución reguladora de trietanolamina 100 10 mM, pH 7,0 suplementado con MgCh 2 mM y se rompió usando el molino de vidrio durante 10 min. La solución de enzima resultante se clarificó por centrifugación y se mezcló con un volumen igual de glicerol. Para la configuración de la reacción, se usaron 56 |il de solución de enzima para la conversión de 75 mg de quinuclidin-3-ona añadiendo 0,15 mg de NAD, 75 |il (10 %) de Oxidoreductasa aus Pichia capsulata, 250 |il de Metil-2-pentanol y 119 |il de TEA 100 mM pH 6,5 suplementado con MgCh 2 mM. Después de 24 h de incubación de las muestras a 30 °C, se 15 añadieron 10 |il de la reacción a 1 ml de MeOH y se analizó por GC. Para la detección de los enantiómeros, se usó la columna Hydrodex P-6TBDM (25 m x 0,25 mm x 0,25 |im) de Masherey-Nagel (Alemania).

SEQ No:: SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:9

Ee ( %): > 99 > 95 > 95 > 95 > 95

Conversión (%): 100 > 78 > 81 66 > 84

Ejemplo 7

Conversión de quinuclidin-3-ona en el correspondiente (R)-3-quinuclidinol en una escala de 10 ml con Metil-2- 20 pentanol como cosustrato

Se cultivó Escherichia coli recombinante que porta el gen de oxidorreductasa de la SEQ ID NO: 1 como se describe en el ejemplo 4. 18 horas después de la inducción, se resuspendieron 30 g de células cosechadas en 100 ml de solución reguladora de trietanolamina (TEA) 100 mM, pH 7,0 suplementado con MgCh 2 mM e interrumpido con prensa francesa. El lisado obtenido se clarificó por centrifugación a 6000 g durante 10 minutos a 4° C. Para la 25 reducción de 1,5 g de 3-quinuclidinona, se añadieron 250 |il de solución de enzima (1125 U) a los 4,05 ml de solución reguladora de TEA 100 mM, pH 6,5 suplementado con MgCh 2 mM, 3 mg de NAD, 225 U de alcohol deshidrogenasa de Pichia capsulata y 5 ml de metil-2-pentanol. La reacción se incubó bajo agitación a 30°C. Después de 21 horas, la reacción se detuvo mediante la adición de 3 ml de NaOH 5 M, 5 ml de metanol y se analizó por cromatografía de gases. La tasa de conversión medida a (R)-3-quinuclidinol fue del 98 % con una pureza óptica 30 del producto de > 99 %.

Ejemplo 8

Conversión de quinuclidin-3-ona en el correspondiente (R)-3-quinuclidinol en una escala de 10 ml con Isopropanol como cosustrato

Se cultivó Escherichia coli recombinante que porta el gen de oxidorreductasa de la SEQ ID NO: 1 como se describe 35 en el ejemplo 4. 18 horas después de la inducción se resuspendieron 30 g de células cosechadas en 100 ml de solución reguladora de trietanolamina (TEA) 100 mM, pH 7,0 suplementado con MgCh 2 mM e interrumpido con prensa francesa. Para la reducción de 1,5 g de quinuclidin-3-ona se añadieron 525 U de enzima a 5,25 ml de solución reguladora de TEA 100 mM, pH 7,0 suplementado con ZnCl2 1 mM, 1,5 mg de NAD, 525 U de Alcohol Deshidrogenasa de Candida nemodendra (WO2007012428, SEQ ID NO: 8) y 1 ml de isopropanol. La reacción se 40 incubó bajo agitación a 30° C. Después de 24 h de incubación, la reacción se detuvo mediante la adición de 3 ml de

19

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de producción de (R)-3-quinuclidinol o una sal del mismo por reducción de quinuclidin-3-ona con cofactor y oxidorreductasa, caracterizado porque la oxidorreductasa comprende un motivo de secuencia de aminoácidos MQX1REX2X3WEA, en el que cada uno de X1, X2, X3 son cualquiera de los residuos de aminoácidos A (Ala), R (Arg), N (Asn), D (Asp), C (Cys), Q (Gln), E (Glu), G (Gly), H (His), I (Ile), L (Leu), K (Lys), M (Met), F (Phe), P (Pro), S (Ser), T (Thr), W (Trp), Y (Tyr) o V (Val), y porque la oxidorreductasa se selecciona de

a) polipéptidos con una secuencia de aminoácidos, en la que al menos el 65 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID nO:3; o

b) polipéptidos con una secuencia de aminoácidos, en la que al menos el 75 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la SEQ ID NO:5 o SEQ ID nO:9; o

c) polipéptidos con una secuencia de aminoácidos, en la que al menos el 85 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la SEQ ID NO:7.
2. Procedimiento de producción de (R)-3-quinuclidinol o una de sus sales por reducción de quinuclidin-3-ona con cofactor y oxidorreductasa, caracterizado porque la oxidorreductasa comprende un motivo de secuencia de aminoácidos MQX1REX2X3WEA, en el que cada uno de X1, X2, X3 son cualquiera de los residuos de aminoácidos A (Ala), R (Arg), N (Asn), D (Asp), C (Cys), Q (Gln), E (Glu), G (Gly), H (His), I (Ile), L (Leu), K (Lys), M (Met), F (Phe), P (Pro), S (Ser), T (Thr), W (Trp), Y (Tyr) o V (Val), y porque la oxidorreductasa se selecciona de

a) polipéptidos con una secuencia de aminoácidos derivada de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9 a través de la sustitución, eliminación o adición de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro, veinticinco, veintiséis o veintisiete a cuarenta residuos de aminoácidos, que son capaces de reducir la quinuclidin-3-ona; o

b) polipéptidos que están codificados por un polinucleótido con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 de la lista de secuencias; o

c) polipéptidos que están codificados por un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que hibrida con el complemento de longitud completa de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 en condiciones rigurosas, en el que condiciones rigurosas comprenden hibridación en solución de NaCl 0,7-1 M a 60 °C y lavado en una solución de SSC de 0,1 a 2 veces a 65 °C, y se entiende que una solución de SSC de 1 vez es una mezcla que consiste en NaCl 150 mM y citrato de sodio 15 mM.
3. Procedimiento de producción de (R)-3-quinuclidinol o una de sus sales por reducción de quinuclidin-3-ona con cofactor y oxidorreductasa, caracterizado porque la oxidorreductasa comprende un motivo de secuencia de aminoácidos MQX1REX2X3WEA, en el que cada uno de X1, X2, X3 son cualquiera de los residuos de aminoácidos A (Ala), R (Arg), N (Asn), D (Asp), C (Cys), Q (Gln), E (Glu), G (Gly), H (His), I (Ile), L (Leu), K (Lys), M (Met), F (Phe), P (Pro), S (Ser), T (Thr), W (Trp), Y (Tyr) o V (Val), y porque la oxidorreductasa se selecciona de

polipéptidos con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9 de la lista de secuencias.
4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el cofactor se regenera continuamente con un cosustrato.
5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se usa NADH o NADPH como cofactor.
6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se usa 2-propanol, 2- butanol, 2-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-heptanol o 2-octanol como cosustrato o como un alcohol secundario, respectivamente.
7. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el alcohol secundario como cosustrato se usa en una cantidad desde 5 a 70 % en volumen en base al volumen total de los lotes de reacción.
8. Un procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el alcohol secundario como cosustrato se usa en una cantidad desde 5 a 50 % en volumen en base al volumen total de los lotes de reacción.
9. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el alcohol secundario usado como cosustrato es inmiscible en agua y se usa en una cantidad desde 5 a 80 % en volumen en base al volumen total de los lotes de reacción.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque el alcohol secundario usado como cosustrato es inmiscible en agua y se usa en una cantidad desde 20 a 80 % en volumen en base al volumen total de los lotes de reacción.
11. Un procedimiento según la reivindicación 9 o 10, caracterizado porque el alcohol secundario usado como

5 cosustrato es metil-2-pentanol.
12. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la quinuclidin-3-ona se usa en una cantidad desde 5 a 50 % en peso, en base al volumen de reacción total.
13. Un procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque la quinuclidin-3-ona se usa en una cantidad desde 8-40 % en peso en base al volumen de reacción total.

10 14. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el número de

renovación total TTN (= mol de quinuclidin-3-ona reducido por mol de cofactor) es > 103.
15. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque se lleva a cabo en un sistema acuoso orgánico de dos fases.
16. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque, además, se usa un

15 solvente orgánico.
17. Un procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque se usa éter dietílico, tert-butil metil éter, diisopropil éter, dibutil éter, acetato de etilo, acetato de butilo, heptano, hexano o ciclohexano como solvente orgánico.
18. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque se añade una 20 oxidorreductasa adicional en la reacción para la regeneración del cofactor.