JPH10243795A - 光学活性キヌクリジノールの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物・酵素による不斉還元反応を利用し
て、キヌクリジノンから光学活性キヌクリジノールを簡
便な方法で経済的に有利に製造する。 【解決手段】 キヌクリジノン（３−キヌクリジノン）
に微生物又はその処理物を作用させ、生成した光学活性
キヌクリジノール（３−キヌクリジノール）を採取す
る。３−キヌクリジノンから（Ｒ）−３−キヌクリジノ
ールを生成する能力を有する微生物には、ナカザワエア
属（Nakazawaea）、キャンディダ属（Candida）、プロ
テウス属（Proteus）が含まれ、３−キヌクリジノンか
ら（Ｓ）−３−キヌクリジノールを生成する能力を有す
る微生物には、アルスロバクター属（Arthrobacter)、
シュードモナス属（Pseudomonas）、ロドスポリヂウム
属（Rhodosporidium）が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を利用して
キヌクリジノン（３−キヌクリジノンなど）から光学活
性キヌクリジノール（３−キヌクリジノールなど）を製
造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】光学活性キヌクリジノール（例えば、３
−キヌクリジノールなど）は、生理活性又は薬理活性成
分（医薬品など）の重要な中間体として使用される。光
学活性３−キヌクリジノールの製造方法としては、従
来、ラセミ体を原料とし、ズブチリシン プロテアーゼ
を用いるアシル化反応によって光学分割して製造する方
法（米国特許５２１５９１８号明細書，US 5215918
A）、３−キヌクリジノンと光学活性フェネチルアミン
から調製したイミンを原料とし、ソジュームボロハイド
レイトで還元して製造する方法（Synth. Commun. (199
2), 22 (13), 1895-911)、ラセミのアセチル体を酒石酸
で分割し、加水分解して製造する方法(Acta Pharm. Sue
c. (1979), 16(4), 281-3)、ブチルエステルのラセミ体
を原料とし、馬血清のエステラーゼで光学分割して製造
する方法(Life Sci. (1977), 21 (9), 1293-302)などが
知られている。

【０００３】しかし、これらの方法では、光学活性キヌ
クリジノール（３−キヌクリジノールなど）を簡便な方
法で経済的に有利に製造することが困難である。また、
微生物・酵素の不斉還元反応を利用して光学活性キヌク
リジノールを効率よく生成させることは報告されていな
い。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、光学活性キヌクリジノール（特に３−キヌクリジノ
ール）を簡便な方法で経済的に有利に製造できる方法を
提供することにある。本発明の他の目的は、微生物・酵
素による不斉還元反応を利用して、光学活性キヌクリジ
ノール（特に３−キヌクリジノール）を効率よく製造で
きる新規な方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、経済的に優
れ、簡便な方法で光学活性キヌクリジノールを得るた
め、キヌクリジノンを原料とし、微生物又はその処理物
による製造方法に着目して、鋭意検討したところ、微生
物又はその酵素による不斉還元反応を利用すると、キヌ
クリジノン（３−キヌクリジノンなど）から光学活性キ
ヌクリジノール（３−キヌクリジノールなど）が効率よ
く生成することを見いだし、本発明を完成した。すなわ
ち、本発明の方法では、キヌクリジノン（３−キヌクリ
ジノンなど）に微生物又はその処理物を作用させ、生成
した光学活性キヌクリジノール（３−キヌクリジノール
など）を採取することにより光学活性キヌクリジノール
を製造する。この方法において、微生物としては、キヌ
クリジノンから（Ｒ）−キヌクリジノールを生成する能
力を有する微生物［ナカザワエア属（Nakazawaea）、キ
ャンディダ属（Candida）、プロテウス属（Proteus）な
ど］、キヌクリジノンから（Ｓ）−キヌクリジノールを
生成する能力を有する微生物［アルスロバクター属（Ar
throbacter)、シュードモナス属（Pseudomonas）、ロド
スポリヂウム属（Rhodosporidium）など］が含まれる。

【０００６】

【発明の実施の形態】基質であるキヌクリジノンとして
は、キヌクリジンのケトン体（２−位，３−位にカルボ
ニル基を有する化合物）、例えば、２−キヌクリジノ
ン，３−キヌクリジノンなどが例示できる。本発明で
は、このような基質に、不斉還元能を有する微生物又は
その処理物を作用させ、対応する光学活性キヌクリジノ
ール（２−キヌクリジノール，３−キヌクリジノールな
ど）を生成させる。好ましい態様では、３−キヌクリジ
ノンから光学活性３−キヌクリジノールを効率よく生成
させることができる。

【０００７】本発明において、微生物としては、前記不
斉還元能を有する限り種々の微生物が利用できる。例え
ば、キヌクリジノン（特に３−キヌクリジノン）に作用
し、（Ｒ）−キヌクリジノール［特に（Ｒ）−３−キヌ
クリジノール］を生成する能力を有する微生物として
は、ナカザワエア属（Nakazawaea)、キャンディダ属（C
andida）、プロテウス属（Proteus）に属する微生物が
例示できる。キヌクリジノンから（Ｒ）−キヌクリジノ
ールを生成させる具体的な微生物としては、次のような
微生物が例示できる。 ナカザワエア属（Nakazawaea)：ナカザワエア・ホルス
ティ（Nakazawaea holstii)ＩＦＯ ０９８０など キャンディダ属（Candida）：キャンディダ・マグノリ
アエ（Candida magnoliae)ＤＳＭ ７０６３８など プロテウス属（Proteus）：プロテウス・ブルガリス（P
roteus vulgaris）ＩＦＯ ３１６７など。

【０００８】また、キヌクリジノン（特に３−キヌクリ
ジノン）に作用し、（Ｓ）−キヌクリジノール［特に
（Ｓ）−３−キヌクリジノール］を生成する能力を有す
る微生物としては、例えば、アルスロバクター属（Arth
robacter)、シュードモナス属（Pseudomonas）、ロドス
ポリヂウム属（Rhodosporidium）に属する微生物が例示
できる。キヌクリジノンから（Ｓ）−キヌクリジノール
を生成させる具体的な微生物としては、次のような微生
物が例示できる。 アルスロバクター属（Arthrobacter)：アルスロバクタ
ー・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens)
ＩＦＯ １２１４０など シュードモナス属（Pseudomonas）：シュードモナス・
エスピー（Pseudomonas sp.)ＡＴＣＣ ２１０２５など ロドスポリヂウム属（Rhodosporidium）：ロドスポリヂ
ウム・ジオボヴァタム（Rhodosporidium diobovatum)Ｉ
ＦＯ ０６８８など。

【０００９】上記より明らかなように、本発明は、キヌ
クリジノンから光学活性キヌクリジノールを生成する能
力を有する微生物として、ナカザワエア属（Nakazawae
a）、キャンディダ属（Candida）、プロテウス属（Prot
eus）、アルスロバクター属（Arthrobacter)、シュード
モナス属（Pseudomonas）、ロドスポリヂウム属（Rhodo
sporidium）からなる群から選択された少なくとも一種
の微生物も開示する。

【００１０】これらの微生物は、野生株、変異株、又は
細胞融合もしくは遺伝子組み換え法などの遺伝子工学手
法により誘導される遺伝子組み換え株などのいずれの株
も好適に用いることができる。

【００１１】なお、ＩＦＯ番号の付された微生物は、
（財）発酵研究所（ＩＦＯ）発行のLIST OF CULTURES M
ICROORGANISMS 10th EDITION 1996 に記載されており、
該ＩＦＯから入手することができる。ＤＳＭ番号の付さ
れた微生物は、Deutsche Sammlung von Mikroorganisme
n （ＤＳＭ）発行のCATALOGUE OF STRAIN 1989に記載さ
れており、該ＤＳＭから入手することができる。ＡＴＣ
Ｃ番号の付された微生物は、American Type Culture Co
llection（ＡＴＣＣ）発行のCATALOGUE OF BACTERIA AN
D PHAGES Eighteenth edition 1992に記載されており、
該ＡＴＣＣから入手することができる。

【００１２】本発明において微生物を培養するための培
地は、菌が増殖し得る培地であれば特に制限はない。培
地は、通常、例えば、炭素源［グルコース，フルクトー
ス，シュクロースなどの糖類、エタノール，グリセロー
ルなどのアルコール類、フマル酸，酢酸，プロピオン酸
などの有機酸類、パラフィンなどの炭化水素類、その他
の炭素源、又はこれらの混合物］、窒素源［硫酸アンモ
ニウム，リン酸アンモニウムなどの無機酸のアンモニウ
ム塩、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウ
ム塩、酵母エキス，肉エキス，麦芽エキス，ペプトン，
ポリペプトン，尿素などの無機又は有機含窒素化合物］
を含んでおり、通常の培養に用いられる栄養源（無機
塩、微量金属塩、ビタミン類など）を適宜混合して用い
ることができる。培地には、必要に応じて微生物の増殖
を促進する因子，目的化合物の生成能力を高めるための
因子，培地のｐＨ保持のための化合物（緩衝物質など）
などを添加してもよく、微生物はキヌクリジノンにより
馴化してもよい。

【００１３】微生物の培養は、微生物の成育・増殖に適
した条件、例えば、培地ｐＨ３．０〜９．５（好ましく
は４〜８）程度、培地温度２０〜４５℃（好ましくは２
５〜３５℃）程度の範囲で、好気的又は嫌気的に１〜５
日間培養することにより行うことができる。

【００１４】キヌクリジノンの不斉還元方法は、前記微
生物又はその処理物の活性をキヌクリジノンに作用させ
る限り特に制限されず、例えば、（１）培養液をそのま
ま用い、キヌクリジノンを培養液に添加して反応させる
方法、（２）遠心分離などにより、菌体を分離し、分離
菌体をそのまま、或いは洗浄した後、緩衝液、水などに
再懸濁し、懸濁液にキヌクリジノンを添加して反応させ
る方法、（３）生菌体に代えて、微生物の処理物（菌体
破粉砕物、アセトン処理、凍結乾燥などの処理を施した
処理物、菌体から取得した酵素など）を用いる方法、
（４）前記微生物又はその処理物を担体（ポリアクリル
アミドゲルなど）に固定化して用いる方法などが適用で
きる。この反応の際、グルコース、シュクロース、エタ
ノール、メタノールなどの炭素源をエネルギー源として
添加すると、目的化合物の収率が向上する場合が多い。
キヌクリジノンは、そのまま、又は反応に影響を与えな
いような有機溶媒に溶解した溶液、界面活性剤などに分
散させた分散液として、反応当初から一括して又は分割
して添加してもよい。

【００１５】反応条件は、微生物又はその処理物の活性
を低下させない範囲で行うことができ、例えば、ｐＨ３
〜９（好ましくは４〜８）程度、温度１０〜６０℃（好
ましくは２０〜４０℃）程度であり、反応は、撹拌下、
１〜１２０時間程度行うことができる。菌体濃度および
キヌクリジノン濃度は、光学活性体の生成効率を損なわ
ない限り特に限定されず、菌体濃度は、例えば、乾燥菌
体基準で、１〜３００ｇ／Ｌ程度の範囲であり、キヌク
リジノン（基質）の使用濃度は、例えば、０．１〜１０
重量％程度が好ましい。

【００１６】反応によって生成した光学活性キヌクリジ
ノールは、慣用の方法で採取又は回収できる。例えば、
必要により反応液から菌体を分離した後、反応液を有機
溶媒による抽出、晶析、再結晶、カラムクロマトグラフ
ィー、濃縮、蒸留などの分離精製手段に供することによ
り光学活性体を得ることができ、分離精製手段は、単独
で又は複数の手段を組み合わせて利用できる。前記有機
溶媒としては、例えば、ブタノールなどのアルコール
類、ヘキサン，シクロヘキサン，トルエンなどの炭化水
素類、クロロホルム、塩化メチレンなどのハロゲン化炭
化水素類、酢酸エチルなどのエステル類、ケトン類、エ
ーテル類、これらの混合溶媒などが利用できる。

【００１７】

【発明の効果】本発明では、微生物又はその処理物の活
性を利用して、キヌクリジノンから光学活性キヌクリジ
ノール（特に３−キヌクリジノール）を簡便な方法で経
済的に有利に製造できる。また、微生物・酵素による不
斉還元反応を利用して、光学活性キヌクリジノール（特
に３−キヌクリジノール）を効率よく製造できる。

【００１８】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。なお、反応液中の３−キヌクリジノンと３−キヌ
クリジノールの定量はガスクロマトグラフィー［カラ
ム；カラム３％シリコンＯＶ−１７／ユニポートＨＰ
（８０／１００メッシュ）３．２ｃｍφ×２．１ｍ、カ
ラム温度；１００℃、検出；ＦＩＤ、検出器温度；２５
０℃、注入温度；２００℃］により行った。

【００１９】光学純度は、反応液から抽出した光学活性
３−キヌクリジノールをベンゾイルクロライドによって
ベンゾイル化した後、それを光学分割カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィー（カラム；キラルパックＡＤ
（０．４６ｃｍφ×２５ｃｍ）、移動相；ヘキサン／エ
タノール／ジエチルアミン＝９５／５／０．１、カラム
温度；２０℃、検出波長；２５４ｎｍ、流速；１．０ｍ
ｌ／分）により測定した。保持時間１２分で（Ｒ）体
（施光度マイナス）、保持時間２３分で（Ｓ）体（施光
度プラス）が検出された。

【００２０】実施例１ ［菌体調製用培地］ −酵母用− グルコース ２．０重量％ 酵母エキス ０．３重量％ 麦芽エキス ０．３重量％ ポリペプトン ０．５重量％ ｐＨ ６．０ −細菌用− グルコース ２．０重量％ 酵母エキス ０．３重量％ 肉エキス ０．３重量％ ポリペプトン ０．５重量％ 硫酸アンモニウム ０．２重量％ リン酸一カリウム ０．１重量％ 硫酸マグネシウム ０．０５重量％ ｐＨ ７．０ 上記の菌体調製用培地２５ｍｌを坂口フラスコに入れて
１２１℃、１５分で滅菌した後、表１に示す微生物をそ
れぞれ植菌し、３０℃で１日間往復振盪培養を行った。
培養終了後、冷却し遠心分離機で菌体を分離し、生菌体
を得た。次いで、２１ｍｍφ試験管に、２重量％グルコ
ース、２重量％炭酸カルシウム、０．５重量％キヌクリ
ジノンを含有する混合液２ｍｌと、上記で調製した生菌
体を入れて、３０℃で３日間、往復振盪反応を行った。

【００２１】反応終了後、遠心分離で除去し、上清を水
酸化ナトリウムでｐＨ１２に調整してから適当に希釈
し、ガスクトマトグラフィーにより生成したキヌクリジ
ノールを定量した。次いで、前記ｐＨ調整後の上清をロ
ータリーエバーポレーターで脱水した後、ブタノール２
ｍｌでキヌクリジノールを抽出した。脱溶媒した後、塩
化メチレン溶液で溶解し、定法によってベンゾイルクロ
ライドでベンゾイル化し、ベンゾイル化物を高速液体ク
ロマトグラフィーで分析し、光学純度を測定した。得ら
れた結果を表１に示す。

【表１】

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:37） (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 キヌクリジノンに微生物又はその処理物
   を作用させ、生成した光学活性キヌクリジノールを採取
   することを特徴とする光学活性キヌクリジノールの製造
   方法。
2. 【請求項２】 ３−キヌクリジノンに微生物又はその処
   理物を作用させ、光学活性３−キヌクリジノールを生成
   させる請求項１記載の光学活性キヌクリジノールの製造
   方法。
3. 【請求項３】 微生物が、ナカザワエア属（Nakazawae
   a）、キャンディダ属（Candida）、プロテウス属（Prot
   eus）からなる群より選ばれ、かつ３−キヌクリジノン
   から（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する能力を有
   する少なくとも一種の微生物である請求項２記載の光学
   活性キヌクリジノールの製造方法。
4. 【請求項４】 微生物が、アルスロバクター属（Arthro
   bacter)、シュードモナス属（Pseudomonas）、ロドスポ
   リヂウム属（Rhodosporidium）からなる群より選ばれ、
   かつ３−キヌクリジノンから（Ｓ）−３−キヌクリジノ
   ールを生成する能力を有する少なくとも一種の微生物で
   ある請求項２記載の光学活性キヌクリジノールの製造方
   法。