JP2002204699A - β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの製造方法 - Google Patents
β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの製造方法Info
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- JP2002204699A JP2002204699A JP2001004182A JP2001004182A JP2002204699A JP 2002204699 A JP2002204699 A JP 2002204699A JP 2001004182 A JP2001004182 A JP 2001004182A JP 2001004182 A JP2001004182 A JP 2001004182A JP 2002204699 A JP2002204699 A JP 2002204699A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの製造方法
の提供。 【解決手段】4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステル
に、以下の属に属する微生物を作用させることによりβ
-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを製造する。シゾブラ
ストスポリオン（Schizoblastsporion）属、スポリディ
オボラス（Sporidiobolus）属、オーレオバシディウム
（Aureobasidium）属、ロドコッカス（Rhodococcus）
属、およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）属β-
ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを容易に得ることができ
る。また、光学活性な4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エ
ステルを基質とすれば、実質的にラセミ化なしに光学活
性なβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを得ることがで
きる。
の提供。 【解決手段】4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステル
に、以下の属に属する微生物を作用させることによりβ
-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを製造する。シゾブラ
ストスポリオン（Schizoblastsporion）属、スポリディ
オボラス（Sporidiobolus）属、オーレオバシディウム
（Aureobasidium）属、ロドコッカス（Rhodococcus）
属、およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）属β-
ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを容易に得ることができ
る。また、光学活性な4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エ
ステルを基質とすれば、実質的にラセミ化なしに光学活
性なβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを得ることがで
きる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を用いたβ
-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの製造法に関する。
-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンは医
薬原料、強誘電性液晶原料として重要な化合物である。
β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの生化学的な製法と
して、エチル-4-t-ブトキシ-3-オキソ酪酸エステルをパ
ン酵母により不斉還元し、得られた(R)-4-t-ブトキシ-3
-ヒドロキシ酪酸エステルからフルオロ酢酸存在下にお
いて、(R)-β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンに誘導す
る方法（Seebach, Dieter; Eberle, Martin, Synthesis
(1), pp37-40, 1986）が公知である。この方法は、化学
的な合成反応を含むことから、光学的に高純度な生成物
を得ることが困難であった。
薬原料、強誘電性液晶原料として重要な化合物である。
β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの生化学的な製法と
して、エチル-4-t-ブトキシ-3-オキソ酪酸エステルをパ
ン酵母により不斉還元し、得られた(R)-4-t-ブトキシ-3
-ヒドロキシ酪酸エステルからフルオロ酢酸存在下にお
いて、(R)-β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンに誘導す
る方法（Seebach, Dieter; Eberle, Martin, Synthesis
(1), pp37-40, 1986）が公知である。この方法は、化学
的な合成反応を含むことから、光学的に高純度な生成物
を得ることが困難であった。
【０００３】その他、微生物を利用した製造方法として
は、4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステルに、シュー
ドモナス属、エンテロコッカス属、キトロバクター属、
バチルス属に属する微生物を作用させる方法が知られて
いる（特開平9-47296）。この方法では、光学異性体の
合成にのために、基質化合物とともに、用いる菌種も選
択しなければならなかった。つまり、微生物によるβ-
ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの公知の製造方法では、
目的とする化合物に応じて、菌株を変えなければならな
い。その結果、各菌株に応じて、最適な培養条件、反応
条件を検討し、設定しなければならず、当然ながら培養
・反応条件に応じて生産設備も変更を要すなどの問題点
がある。
は、4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステルに、シュー
ドモナス属、エンテロコッカス属、キトロバクター属、
バチルス属に属する微生物を作用させる方法が知られて
いる（特開平9-47296）。この方法では、光学異性体の
合成にのために、基質化合物とともに、用いる菌種も選
択しなければならなかった。つまり、微生物によるβ-
ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの公知の製造方法では、
目的とする化合物に応じて、菌株を変えなければならな
い。その結果、各菌株に応じて、最適な培養条件、反応
条件を検討し、設定しなければならず、当然ながら培養
・反応条件に応じて生産設備も変更を要すなどの問題点
がある。
【０００４】しかもR体を生成することができる菌株と
しては、細菌である、シュードモナス sp. OS-K-29株、
およびバチルス スベリカス DS-ID-819株しか知られて
いなかった。そのうえ、これらの細菌を利用した場合、
(R)-β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの光学純度は高
くとも66%eeであり、その収率は１０%程度にすぎなかっ
た。したがって、これらの細菌を利用して、工業的な規
模でβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを製造する方法
を確立することは困難であった。
しては、細菌である、シュードモナス sp. OS-K-29株、
およびバチルス スベリカス DS-ID-819株しか知られて
いなかった。そのうえ、これらの細菌を利用した場合、
(R)-β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの光学純度は高
くとも66%eeであり、その収率は１０%程度にすぎなかっ
た。したがって、これらの細菌を利用して、工業的な規
模でβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを製造する方法
を確立することは困難であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、β-ヒドロ
キシ-γ-ブチロラクトンを高い収率で得ることができ
る、新規な方法の提供を課題とする。また本発明は、光
学的純度の高いβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを、
基質化合物の選択によって生成することができる方法の
提供を課題とする。
キシ-γ-ブチロラクトンを高い収率で得ることができ
る、新規な方法の提供を課題とする。また本発明は、光
学的純度の高いβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを、
基質化合物の選択によって生成することができる方法の
提供を課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】前記課題を解決するため
に、本発明者らは、β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトン
の製造に応用することができる微生物について探索を続
けた。その結果、特定の属に属する微生物を用いること
により、β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを簡便、か
つ安価に製造することが可能となることを見出した。更
に、これらの微生物を用いることにより、任意の光学異
性体を容易に、しかも高い純度で得られることを見出
し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のβ-
ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの製造方法である。 〔１〕次に示す群から選択されるいずれかの属に属し、
4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステルよりβ-ヒドロキ
シ-γ-ブチロラクトンを生成する能力を有する微生物の
菌体あるいはその処理物を4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪
酸エステルに作用させ、生成するβ-ヒドロキシ-γ-ブ
チロラクトンを採取する工程を含む、β-ヒドロキシ-γ
-ブチロラクトンの製造方法。 シゾブラストスポリオン（Schizoblastsporion）属、ス
ポリディオボラス（Sporidiobolus）属、オーレオバシ
ディウム（Aureobasidium）属、ロドコッカス（Rhodoco
ccus）属、およびアグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）属 〔２〕4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステルが、4-ク
ロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルであることを特
徴とする〔１〕に記載の方法。 〔３〕R体またはS体の4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エ
ステルを基質として、R体またはS体のβ−ヒドロキシ−
γ−ブチロラクトンを生成することを特徴とする〔１〕
に記載の方法。 〔４〕微生物が、以下の群から選択されるいずれかの微
生物である〔１〕に記載の方法。 シゾブラストスポリオン・コバヤシイ（Schizoblastspo
rion kobayashii）、スポリディオボラス・パラロゼウ
ス（Sporidiobolus pararoseus）、オーレオバシディウ
ム・プルランス（Aureobasidium pululans）、ロドコッ
カス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、
ロドコッカス・ロドクロラス（Rhodococcus rhodochrou
s）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A
grobacterium tumefaciens） 〔５〕微生物が、以下の群から選択されるいずれかの微
生物である〔４〕に記載の方法。 シゾブラストスポリオン・コバヤシイ（Schizoblastspo
rion kobayashii）IFO 1644、スポリディオボラス・パ
ラロゼウス（Sporidiobolus pararoseus）IFO 0376、オ
ーレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pulu
lans）IFO 6353、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhod
ococcus erythropolis）JCM 6821、ロドコッカス・ロド
クロラス（Rhodococcus rhodochrous）JCM 3202、およ
びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacter
ium tumefaciens）IFO 12664
に、本発明者らは、β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトン
の製造に応用することができる微生物について探索を続
けた。その結果、特定の属に属する微生物を用いること
により、β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを簡便、か
つ安価に製造することが可能となることを見出した。更
に、これらの微生物を用いることにより、任意の光学異
性体を容易に、しかも高い純度で得られることを見出
し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のβ-
ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの製造方法である。 〔１〕次に示す群から選択されるいずれかの属に属し、
4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステルよりβ-ヒドロキ
シ-γ-ブチロラクトンを生成する能力を有する微生物の
菌体あるいはその処理物を4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪
酸エステルに作用させ、生成するβ-ヒドロキシ-γ-ブ
チロラクトンを採取する工程を含む、β-ヒドロキシ-γ
-ブチロラクトンの製造方法。 シゾブラストスポリオン（Schizoblastsporion）属、ス
ポリディオボラス（Sporidiobolus）属、オーレオバシ
ディウム（Aureobasidium）属、ロドコッカス（Rhodoco
ccus）属、およびアグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）属 〔２〕4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステルが、4-ク
ロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルであることを特
徴とする〔１〕に記載の方法。 〔３〕R体またはS体の4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エ
ステルを基質として、R体またはS体のβ−ヒドロキシ−
γ−ブチロラクトンを生成することを特徴とする〔１〕
に記載の方法。 〔４〕微生物が、以下の群から選択されるいずれかの微
生物である〔１〕に記載の方法。 シゾブラストスポリオン・コバヤシイ（Schizoblastspo
rion kobayashii）、スポリディオボラス・パラロゼウ
ス（Sporidiobolus pararoseus）、オーレオバシディウ
ム・プルランス（Aureobasidium pululans）、ロドコッ
カス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、
ロドコッカス・ロドクロラス（Rhodococcus rhodochrou
s）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A
grobacterium tumefaciens） 〔５〕微生物が、以下の群から選択されるいずれかの微
生物である〔４〕に記載の方法。 シゾブラストスポリオン・コバヤシイ（Schizoblastspo
rion kobayashii）IFO 1644、スポリディオボラス・パ
ラロゼウス（Sporidiobolus pararoseus）IFO 0376、オ
ーレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pulu
lans）IFO 6353、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhod
ococcus erythropolis）JCM 6821、ロドコッカス・ロド
クロラス（Rhodococcus rhodochrous）JCM 3202、およ
びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacter
ium tumefaciens）IFO 12664
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明は、以下に示すいずれかの
属に属し、かつ4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステル
よりβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを生成すること
ができる微生物の菌体あるいはその処理物を4-ハロゲノ
-3-ヒドロキシ酪酸エステルに作用させ、生成するβ-ヒ
ドロキシ-γ-ブチロラクトンを採取する工程を含む、β
-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの製造方法である。 （ａ）シゾブラストスポリオン（Schizoblastsporion）
属 （ｂ）スポリディオボラス（Sporidiobolus）属 （ｃ）オーレオバシディウム（Aureobasidium）属 （ｄ）ロドコッカス（Rhodococcus）属 （ｅ）アグロバクテリウム（Agrobacterium）属
属に属し、かつ4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステル
よりβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを生成すること
ができる微生物の菌体あるいはその処理物を4-ハロゲノ
-3-ヒドロキシ酪酸エステルに作用させ、生成するβ-ヒ
ドロキシ-γ-ブチロラクトンを採取する工程を含む、β
-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの製造方法である。 （ａ）シゾブラストスポリオン（Schizoblastsporion）
属 （ｂ）スポリディオボラス（Sporidiobolus）属 （ｃ）オーレオバシディウム（Aureobasidium）属 （ｄ）ロドコッカス（Rhodococcus）属 （ｅ）アグロバクテリウム（Agrobacterium）属
【０００８】これらの属に属し、目的とする活性を備え
た微生物は、たとえば次のようにして得ることができ
る。まず、被検菌が細菌の場合には、被検菌がこれらの
属に属する微生物であることを、Bergey's manual of S
ystematic Bacteriology (Volume 4) 1989 等に記載の
公知の微生物同定方法に基づいて同定する。また酵母で
あればThe yeasts a taxonomic study 4th ed., Kurtzm
an, C.P. and J.W.Fell（Elsevier）（1998）等により
同定する。あるいは、既にこれらの属に属することが同
定されている菌株を被検菌として用意する。これらの属
に属する被検菌を、適当な培地で培養し、生育した菌体
を集める。菌体を緩衝液に懸濁し、基質化合物である4-
ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステルを添加し、反応を
行い、その上清を回収する。回収した上清に、、β-ヒ
ドロキシ-γ-ブチロラクトンが検出できれば、被検菌が
目的とする活性を持つものであることが確認できる。β
-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを定量する方法は公知
である。たとえば、実施例に示すように培養液をガスク
ロマトグラフィーによって分析する方法を利用すること
ができる。同一の条件で培養を行って、より高い活性を
持つ菌株を選択することにより、本発明に利用すること
ができる菌株が選択される。
た微生物は、たとえば次のようにして得ることができ
る。まず、被検菌が細菌の場合には、被検菌がこれらの
属に属する微生物であることを、Bergey's manual of S
ystematic Bacteriology (Volume 4) 1989 等に記載の
公知の微生物同定方法に基づいて同定する。また酵母で
あればThe yeasts a taxonomic study 4th ed., Kurtzm
an, C.P. and J.W.Fell（Elsevier）（1998）等により
同定する。あるいは、既にこれらの属に属することが同
定されている菌株を被検菌として用意する。これらの属
に属する被検菌を、適当な培地で培養し、生育した菌体
を集める。菌体を緩衝液に懸濁し、基質化合物である4-
ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステルを添加し、反応を
行い、その上清を回収する。回収した上清に、、β-ヒ
ドロキシ-γ-ブチロラクトンが検出できれば、被検菌が
目的とする活性を持つものであることが確認できる。β
-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを定量する方法は公知
である。たとえば、実施例に示すように培養液をガスク
ロマトグラフィーによって分析する方法を利用すること
ができる。同一の条件で培養を行って、より高い活性を
持つ菌株を選択することにより、本発明に利用すること
ができる菌株が選択される。
【０００９】本発明における望ましい微生物は、基質と
して加える化合物の光学純度に応じて、光学的に活性な
生成物を与える。本発明で得られるβ-ヒドロキシ-γ-
ブチロラクトンの光学純度については、菌株、基質の光
学純度、反応時間により変化するが、所望の立体配置を
もつ基質を用いることにより、所望の立体配置のβ-ヒ
ドロキシ-γ-ブチロラクトンが得られる。すなわち(S)-
体の基質からは(S)-体のβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラク
トンが、(R)-体の基質からは(R)-体のβ-ヒドロキシ-γ
-ブチロラクトンが生成する。したがって、光学的異性
体を基質として用いることにより、任意の光学異性体を
高純度で生成させることができる。本発明において用い
られる微生物のうち、好ましいものにおいては、同一の
菌株が、R体とS体のいずれをも基質とすることができ
る。同一の菌株を用いてR体、S体いずれのエンナンチオ
マーも同様に得られるため、培養・反応の条件を改めて
検討し直す必要がない他、生産設備も変更する必要がな
く、両エナンチオマーが容易に生産できる利点がある。
して加える化合物の光学純度に応じて、光学的に活性な
生成物を与える。本発明で得られるβ-ヒドロキシ-γ-
ブチロラクトンの光学純度については、菌株、基質の光
学純度、反応時間により変化するが、所望の立体配置を
もつ基質を用いることにより、所望の立体配置のβ-ヒ
ドロキシ-γ-ブチロラクトンが得られる。すなわち(S)-
体の基質からは(S)-体のβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラク
トンが、(R)-体の基質からは(R)-体のβ-ヒドロキシ-γ
-ブチロラクトンが生成する。したがって、光学的異性
体を基質として用いることにより、任意の光学異性体を
高純度で生成させることができる。本発明において用い
られる微生物のうち、好ましいものにおいては、同一の
菌株が、R体とS体のいずれをも基質とすることができ
る。同一の菌株を用いてR体、S体いずれのエンナンチオ
マーも同様に得られるため、培養・反応の条件を改めて
検討し直す必要がない他、生産設備も変更する必要がな
く、両エナンチオマーが容易に生産できる利点がある。
【００１０】これらの属に属し本発明に利用することが
できる微生物としては、たとえば次のような微生物を示
すことができる。これらの種は、いずれも4-ハロゲノ-3
-ヒドロキシ酪酸エステルを還元してβ-ヒドロキシ-γ-
ブチロラクトンを生成する能力を有する。なお本発明に
用いることができる微生物は、以下に記載した寄託機関
の菌株番号で特定される菌株に限定されず、他の菌株で
あることもできる。更に本発明に用いることができる微
生物はこれらの種に限定されず、前記（ａ）−（ｅ）の
属に属し、必要な活性を持つ微生物であれば、任意の種
を利用することができる。
できる微生物としては、たとえば次のような微生物を示
すことができる。これらの種は、いずれも4-ハロゲノ-3
-ヒドロキシ酪酸エステルを還元してβ-ヒドロキシ-γ-
ブチロラクトンを生成する能力を有する。なお本発明に
用いることができる微生物は、以下に記載した寄託機関
の菌株番号で特定される菌株に限定されず、他の菌株で
あることもできる。更に本発明に用いることができる微
生物はこれらの種に限定されず、前記（ａ）−（ｅ）の
属に属し、必要な活性を持つ微生物であれば、任意の種
を利用することができる。
【００１１】（ａ）シゾブラストスポリオン（Schizobl
astsporion）属 シゾブラストスポリオン・コバヤシイ（Schizoblastspo
rion kobayashii）IFO1644 （ｂ）スポリディオボラス（Sporidiobolus）属 スポリディオボラス・パラロゼウス（Sporidiobolus pa
raroseus）IFO 0376 （ｃ）オーレオバシディウム（Aureobasidium）属 オーレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pu
lulans）IFO 6353 （ｄ）ロドコッカス（Rhodococcus）属 ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythrop
olis）JCM 6821 ロドコッカス・ロドクロラス（Rhodococcus rhodochrou
s）JCM 3202 （ｅ）アグロバクテリウム（Agrobacterium）属 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacteriu
m tumefaciens）IFO 12664
astsporion）属 シゾブラストスポリオン・コバヤシイ（Schizoblastspo
rion kobayashii）IFO1644 （ｂ）スポリディオボラス（Sporidiobolus）属 スポリディオボラス・パラロゼウス（Sporidiobolus pa
raroseus）IFO 0376 （ｃ）オーレオバシディウム（Aureobasidium）属 オーレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pu
lulans）IFO 6353 （ｄ）ロドコッカス（Rhodococcus）属 ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythrop
olis）JCM 6821 ロドコッカス・ロドクロラス（Rhodococcus rhodochrou
s）JCM 3202 （ｅ）アグロバクテリウム（Agrobacterium）属 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacteriu
m tumefaciens）IFO 12664
【００１２】これらの微生物が、4-ハロゲノ-3-ヒドロ
キシ酪酸エステルよりβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクト
ンを生成することは、これまで知られていなかった。特
に、シゾブラストスポリオン（Schizoblastsporion）
属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属、オーレ
オバシディウム（Aureobasidium）属のように、真菌類
がこのような活性を有することは、これまで全く知られ
ていなかった。真菌類は、一般に細菌と比べて培養が容
易で、しかも菌体を培養物から分離しやすいことから、
工業的な利用に好適である。
キシ酪酸エステルよりβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクト
ンを生成することは、これまで知られていなかった。特
に、シゾブラストスポリオン（Schizoblastsporion）
属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属、オーレ
オバシディウム（Aureobasidium）属のように、真菌類
がこのような活性を有することは、これまで全く知られ
ていなかった。真菌類は、一般に細菌と比べて培養が容
易で、しかも菌体を培養物から分離しやすいことから、
工業的な利用に好適である。
【００１３】これらの微生物は、野生株のみならず、変
異株や遺伝子工学的な手法で得ることができる形質転換
体であることもできる。形質転換体を得る手法として
は、細胞融合や遺伝子操作などを用いることができる。
なお、IFO番号の付された微生物は、財団法人・発酵研
究所発行の微生物カタログ第10版（1996年）に記載され
ており、同研究所より入手することができる。またJCM
番号の付された微生物は、理化学研究所発行の菌株カタ
ログ第7版（1999年）に記載されており、同研究所より
入手することができる。
異株や遺伝子工学的な手法で得ることができる形質転換
体であることもできる。形質転換体を得る手法として
は、細胞融合や遺伝子操作などを用いることができる。
なお、IFO番号の付された微生物は、財団法人・発酵研
究所発行の微生物カタログ第10版（1996年）に記載され
ており、同研究所より入手することができる。またJCM
番号の付された微生物は、理化学研究所発行の菌株カタ
ログ第7版（1999年）に記載されており、同研究所より
入手することができる。
【００１４】本発明の製造方法において基質となる4-ハ
ロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステルは、特に制限されな
い。エステルを構成するアルキル基は、たとえばC1〜C4
のアルキル基とすることができる。より具体的には、メ
チル、エチル、プロピル、イソプロピル、あるいはブチ
ル基等が挙げられる。また4位の置換ハロゲン原子とし
ては、塩素、臭素、あるいはヨウ素などが挙げられる。
ロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステルは、特に制限されな
い。エステルを構成するアルキル基は、たとえばC1〜C4
のアルキル基とすることができる。より具体的には、メ
チル、エチル、プロピル、イソプロピル、あるいはブチ
ル基等が挙げられる。また4位の置換ハロゲン原子とし
ては、塩素、臭素、あるいはヨウ素などが挙げられる。
【００１５】本発明に用いる微生物を培養するための培
地は、その微生物が増殖しうるものであれば特に制限は
ない。一般に、微生物の培地は、炭素源、窒素源、無機
塩、およびビタミン類などの微量要素で構成される。炭
素源は、上記微生物が利用可能であれば特に限定されな
い。具体的には、糖類、アルコール、有機酸およびその
塩類、炭化水素類、並びにこれらの混合物等を用いるこ
とができる。より具体的には、糖類としては、たとえば
グルコース、フルクトース、シュクロース、あるいはデ
キストリンなどを示すことができる。アルコールには、
ソルビトールやグリセロールなどが含まれる。有機酸と
しては、フマール酸、クエン酸、酢酸、あるいはプロピ
オン酸等を示すことができる。パラフィンなどは、炭化
水素類に含まれる。
地は、その微生物が増殖しうるものであれば特に制限は
ない。一般に、微生物の培地は、炭素源、窒素源、無機
塩、およびビタミン類などの微量要素で構成される。炭
素源は、上記微生物が利用可能であれば特に限定されな
い。具体的には、糖類、アルコール、有機酸およびその
塩類、炭化水素類、並びにこれらの混合物等を用いるこ
とができる。より具体的には、糖類としては、たとえば
グルコース、フルクトース、シュクロース、あるいはデ
キストリンなどを示すことができる。アルコールには、
ソルビトールやグリセロールなどが含まれる。有機酸と
しては、フマール酸、クエン酸、酢酸、あるいはプロピ
オン酸等を示すことができる。パラフィンなどは、炭化
水素類に含まれる。
【００１６】窒素源についても、上記微生物が利用可能
であれば特に限定されない。具体的には、例えば、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
などの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウ
ム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム
塩等を用いることができる。また、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、尿
素、などの各種無機有機含窒素化合物、あるいはこれら
の混合物を使用することもできる。他に無機塩、微量金
属塩、ビタミン類など、通常の培養に用いられる栄養源
を適宜混合して用いることができる。また、必要に応じ
て微生物の増殖を促進する因子、本発明の目的化合物の
生成能力を高める因子、あるいは培地のpH保持に有効な
CaCO3などの物質も添加できる。
であれば特に限定されない。具体的には、例えば、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
などの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウ
ム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム
塩等を用いることができる。また、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、尿
素、などの各種無機有機含窒素化合物、あるいはこれら
の混合物を使用することもできる。他に無機塩、微量金
属塩、ビタミン類など、通常の培養に用いられる栄養源
を適宜混合して用いることができる。また、必要に応じ
て微生物の増殖を促進する因子、本発明の目的化合物の
生成能力を高める因子、あるいは培地のpH保持に有効な
CaCO3などの物質も添加できる。
【００１７】培養方法としては、培地pHは3〜11、好ま
しくは4〜8、培養温度は15〜60℃、好ましくは20〜45℃
で、嫌気的あるいは好気的に、その微生物の生育に適し
た条件下5〜120時間、好ましくは24〜96時間程度培養す
る。
しくは4〜8、培養温度は15〜60℃、好ましくは20〜45℃
で、嫌気的あるいは好気的に、その微生物の生育に適し
た条件下5〜120時間、好ましくは24〜96時間程度培養す
る。
【００１８】基質である4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸
エステルは酵素の基質阻害が起らない濃度範囲で、一括
あるいは間欠的に、あるいは連続して添加すればよく、
通常0.01から20%（wt/wt）程度添加する。基質は、その
まま水に溶解あるいは分散して、または水に溶解あるい
は反応に影響を与えないような有機溶媒に溶解したり、
界面活性剤などに分散させた状態で添加することができ
る。
エステルは酵素の基質阻害が起らない濃度範囲で、一括
あるいは間欠的に、あるいは連続して添加すればよく、
通常0.01から20%（wt/wt）程度添加する。基質は、その
まま水に溶解あるいは分散して、または水に溶解あるい
は反応に影響を与えないような有機溶媒に溶解したり、
界面活性剤などに分散させた状態で添加することができ
る。
【００１９】基質である4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸
エステルは、培養液に添加することにより、微生物を作
用させることができる。あるいは、遠心分離などにより
菌体を分離し、これをそのまま、あるいは洗浄した後、
緩衝液、水などに再懸濁したものに、4-ハロゲノ-3-ヒ
ドロキシ酪酸エステルを添加し、反応させることもでき
る。微生物菌体は、生菌体のままでもよいし、その処理
物または調製物を用いても良い。
エステルは、培養液に添加することにより、微生物を作
用させることができる。あるいは、遠心分離などにより
菌体を分離し、これをそのまま、あるいは洗浄した後、
緩衝液、水などに再懸濁したものに、4-ハロゲノ-3-ヒ
ドロキシ酪酸エステルを添加し、反応させることもでき
る。微生物菌体は、生菌体のままでもよいし、その処理
物または調製物を用いても良い。
【００２０】該処理物または調製物とは、たとえば下記
のような処理を施した菌体を含む。このような微生物菌
体の処理物（あるいは調製物）は、一般に菌体のまま用
いるよりも反応性や、安定性の点で改善を期待できると
されている。あるいは、菌体の捕集を容易とし、反応生
成物の回収を助ける効果がある。
のような処理を施した菌体を含む。このような微生物菌
体の処理物（あるいは調製物）は、一般に菌体のまま用
いるよりも反応性や、安定性の点で改善を期待できると
されている。あるいは、菌体の捕集を容易とし、反応生
成物の回収を助ける効果がある。
【００２１】・培養菌体をガラスビーズや超音波等で処
理して物理的に細胞壁を破壊した無細胞抽出液 ・無細胞抽出液から調製した部分精製酵素画分 ・ザイモリアーゼ等の溶菌酵素により酵素的に細胞壁を
破壊、もしくは、部分的に破壊した菌体 ・トルエン、キシレン等の有機溶媒や界面活性剤により
細胞壁の透過性を良くした菌体 ・アセトン処理した菌体 ・凍結乾燥処理した菌体 菌体処理物とは、これら菌体やその処理物を、固定化し
たもの、グルタルアルデヒド等により架橋処理したもの
を含む。微生物菌体はカラギーナンゲル、アルギン酸ゲ
ル、ポリアクリルアミドゲル、セルロース、寒天などに
公知の方法で固定化して行うことも可能である。更に、
本発明の反応は、膜リアクターなどを利用して行うこと
も可能である。膜リアクターを構成することができる膜
としては、限外濾過膜、疎水性膜、カチオン膜、ナノフ
ィルトレーション膜(J.Ferment.Bioeng. 83, 54-58 (19
97))等を示すことができる。
理して物理的に細胞壁を破壊した無細胞抽出液 ・無細胞抽出液から調製した部分精製酵素画分 ・ザイモリアーゼ等の溶菌酵素により酵素的に細胞壁を
破壊、もしくは、部分的に破壊した菌体 ・トルエン、キシレン等の有機溶媒や界面活性剤により
細胞壁の透過性を良くした菌体 ・アセトン処理した菌体 ・凍結乾燥処理した菌体 菌体処理物とは、これら菌体やその処理物を、固定化し
たもの、グルタルアルデヒド等により架橋処理したもの
を含む。微生物菌体はカラギーナンゲル、アルギン酸ゲ
ル、ポリアクリルアミドゲル、セルロース、寒天などに
公知の方法で固定化して行うことも可能である。更に、
本発明の反応は、膜リアクターなどを利用して行うこと
も可能である。膜リアクターを構成することができる膜
としては、限外濾過膜、疎水性膜、カチオン膜、ナノフ
ィルトレーション膜(J.Ferment.Bioeng. 83, 54-58 (19
97))等を示すことができる。
【００２２】反応温度は5〜70℃、望ましくは15〜60℃
で反応させる。反応pHは酵素が反応する範囲で適宜選択
すればよいが、通常pH5〜10、望ましくはpH6〜9で緩衝
液中あるいはpHスタットを用いて行う。反応は静置ある
いは振とう、攪拌いずれでも行うことができる。反応に
用いる溶媒は通常水であるが、反応に影響を与えない範
囲でアルコールなどの有機溶媒を加えることができる。
で反応させる。反応pHは酵素が反応する範囲で適宜選択
すればよいが、通常pH5〜10、望ましくはpH6〜9で緩衝
液中あるいはpHスタットを用いて行う。反応は静置ある
いは振とう、攪拌いずれでも行うことができる。反応に
用いる溶媒は通常水であるが、反応に影響を与えない範
囲でアルコールなどの有機溶媒を加えることができる。
【００２３】本発明の反応は、水中や、あるいは水と相
溶性を有する有機溶媒との混合系で行うことができる。
水と相溶性を有する溶媒としては、メタノール、エタノ
ール、イソプロパノール、アセトン、あるいはアセトニ
トリルなどを示すことができる。また、水に溶解しにく
い有機溶媒中や、水に溶解しにくい有機溶媒と水性媒体
との２相系において、本発明の反応を行うことができ
る。水に溶解しにくい有機溶媒としては、たとえば酢酸
エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘ
キサン、シクロヘキサン、オクタン、あるいは１−オク
タノール等を用いることができる。生成したβ-ヒドロ
キシ-γ-ブチロラクトンは、反応液から任意の方法によ
って回収し、精製することができる。具体的には、たと
えば、限外ろ過、濃縮、カラムクロマトグラフィー、抽
出、活性炭処理、蒸留など通常の方法を組み合せること
で回収、精製できる。
溶性を有する有機溶媒との混合系で行うことができる。
水と相溶性を有する溶媒としては、メタノール、エタノ
ール、イソプロパノール、アセトン、あるいはアセトニ
トリルなどを示すことができる。また、水に溶解しにく
い有機溶媒中や、水に溶解しにくい有機溶媒と水性媒体
との２相系において、本発明の反応を行うことができ
る。水に溶解しにくい有機溶媒としては、たとえば酢酸
エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘ
キサン、シクロヘキサン、オクタン、あるいは１−オク
タノール等を用いることができる。生成したβ-ヒドロ
キシ-γ-ブチロラクトンは、反応液から任意の方法によ
って回収し、精製することができる。具体的には、たと
えば、限外ろ過、濃縮、カラムクロマトグラフィー、抽
出、活性炭処理、蒸留など通常の方法を組み合せること
で回収、精製できる。
【００２４】
【実施例】次に本発明を実施例により具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではな
い。以下の実施例において、4-クロロ-3-ヒドロキシ酪
酸エチルエステル、並びにβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラ
クトンは、ガスクロマトグラフィーにより定量した。ガ
スクロマトグラフィーの条件は、以下のとおりである。 カラム：Thermon 3000 5%、クロモソルブW 60-80メッシュ(AW-DMCS)、φ3mm×2. 1m 気相：ヘリウム 50mL/min カラム温度：125℃（4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステル） 180℃（β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトン） 注入口温度：250℃ 検出器温度：250℃ 検出：FID
が、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではな
い。以下の実施例において、4-クロロ-3-ヒドロキシ酪
酸エチルエステル、並びにβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラ
クトンは、ガスクロマトグラフィーにより定量した。ガ
スクロマトグラフィーの条件は、以下のとおりである。 カラム：Thermon 3000 5%、クロモソルブW 60-80メッシュ(AW-DMCS)、φ3mm×2. 1m 気相：ヘリウム 50mL/min カラム温度：125℃（4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステル） 180℃（β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトン） 注入口温度：250℃ 検出器温度：250℃ 検出：FID
【００２５】β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの光学
純度は、CHIRALPAK AD（ダイセル化学工業（株）製）を
用いるHPLCにより測定した。HPLCの条件は、以下のとお
りである。 カラム：CHIRALPAK AD φ4.6×250mm 移動相：n-ヘキサン/2-プロパノール[9:1] 流速：1.0mL/min カラム温度：40℃ 検出：示差屈折率計
純度は、CHIRALPAK AD（ダイセル化学工業（株）製）を
用いるHPLCにより測定した。HPLCの条件は、以下のとお
りである。 カラム：CHIRALPAK AD φ4.6×250mm 移動相：n-ヘキサン/2-プロパノール[9:1] 流速：1.0mL/min カラム温度：40℃ 検出：示差屈折率計
【００２６】以下の実施例で用いている「菌体調製用培
地１」、「菌体調製用培地２」の組成は以下の通りであ
る。 （菌体調製用培地１）グルコース 20g、酵母エキス（極
東製薬）3g、麦芽エキス（極東製薬）3g、ポリペプトン
（日本製薬）5gを混合し、脱イオン水を加え総容量1000
mLとし、pH6.0に合わせる。 （菌体調製用培地２）グルコース20g、酵母エキス（極
東製薬）3g、肉エキス（極東製薬）3g、ポリペプトン
（日本製薬）5g、硫酸アンモニウム2g、KH2PO4 1g、硫
酸マグネシウム0.5gを混合し、脱イオン水を加え総容量
1000mLとし、pH7.0に合わせる。尚、(S)-4-クロロ-3-ヒ
ドロキシ酪酸エチルエステル、(R)-4-クロロ-3-ヒドロ
キシ酪酸エチルエステルはアルドリッチ社製の試薬を用
いた。
地１」、「菌体調製用培地２」の組成は以下の通りであ
る。 （菌体調製用培地１）グルコース 20g、酵母エキス（極
東製薬）3g、麦芽エキス（極東製薬）3g、ポリペプトン
（日本製薬）5gを混合し、脱イオン水を加え総容量1000
mLとし、pH6.0に合わせる。 （菌体調製用培地２）グルコース20g、酵母エキス（極
東製薬）3g、肉エキス（極東製薬）3g、ポリペプトン
（日本製薬）5g、硫酸アンモニウム2g、KH2PO4 1g、硫
酸マグネシウム0.5gを混合し、脱イオン水を加え総容量
1000mLとし、pH7.0に合わせる。尚、(S)-4-クロロ-3-ヒ
ドロキシ酪酸エチルエステル、(R)-4-クロロ-3-ヒドロ
キシ酪酸エチルエステルはアルドリッチ社製の試薬を用
いた。
【００２７】（実施例１）50mLの菌体調製用培地１を50
0mL容の坂口フラスコに入れ、殺菌後、スポリディオボ
ラス・パラロゼウス（Sporidiobolus pararoseus）IFO
0376株を一白金耳植菌し、26℃で48時間振とう培養し
た。培養液20mLを遠心分離し、生菌体を分離した。生菌
体を20mLの0.1M カリウムリン酸緩衝液、pH7.5に懸濁
し、100mL容三角フラスコに入れた。さらに(S)-4-クロ
ロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルを0.2g添加し、20
℃で24時間振とうし反応させた。遠心分離により上清を
分離し、上清全量を減圧下に濃縮乾固した後、メタノー
ル5mLを加え、析出したリン酸塩結晶をろ別した。この
ろ液をガスクロマトグラフィー/マススペクトロメトリ
ーにて分析した結果、β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクト
ンのピークが検出された。
0mL容の坂口フラスコに入れ、殺菌後、スポリディオボ
ラス・パラロゼウス（Sporidiobolus pararoseus）IFO
0376株を一白金耳植菌し、26℃で48時間振とう培養し
た。培養液20mLを遠心分離し、生菌体を分離した。生菌
体を20mLの0.1M カリウムリン酸緩衝液、pH7.5に懸濁
し、100mL容三角フラスコに入れた。さらに(S)-4-クロ
ロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルを0.2g添加し、20
℃で24時間振とうし反応させた。遠心分離により上清を
分離し、上清全量を減圧下に濃縮乾固した後、メタノー
ル5mLを加え、析出したリン酸塩結晶をろ別した。この
ろ液をガスクロマトグラフィー/マススペクトロメトリ
ーにて分析した結果、β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクト
ンのピークが検出された。
【００２８】（実施例２）菌体調製用培地１をそれぞれ
50mLずつ500mL容の坂口フラスコに入れ、殺菌後、以下
の菌株を一白金耳植菌し、26℃で48時間振とう培養し
た。 シゾブラストスポリオン・コバヤシイ（Schizoblastspo
rion kobayashii）IFO 1644 スポリディオボラス・パラロゼウス（Sporidiobolus pa
raroseus）IFO 0376 オーレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pu
lulans）IFO 6353 培養液40mLを遠心分離し、生菌体を分離した。生菌体を
40mLの0.1M カリウムリン酸緩衝液、pH7.5に懸濁し、20
mLずつ2本の100mL容三角フラスコに入れ、一方には(S)-
4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルを0.2g、も
う一方には(R)-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエス
テル0.2gを入れ、20℃で24時間振とうし反応させた。遠
心分離により上清を分離し、その0.2mLをメタノール0.8
mLで希釈し、生成したβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクト
ンをガスクロマトグラフィーで定量した。残りの上清全
量を減圧下に数mLまで濃縮した後、メタノール40mLを加
え、析出したリン酸塩結晶をろ別した。ろ液を再び減圧
下に濃縮し、濃縮液を得た。この濃縮液をHPLC移動相で
適宜希釈し、β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの光学
純度を測定した。結果を表１に示す。
50mLずつ500mL容の坂口フラスコに入れ、殺菌後、以下
の菌株を一白金耳植菌し、26℃で48時間振とう培養し
た。 シゾブラストスポリオン・コバヤシイ（Schizoblastspo
rion kobayashii）IFO 1644 スポリディオボラス・パラロゼウス（Sporidiobolus pa
raroseus）IFO 0376 オーレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pu
lulans）IFO 6353 培養液40mLを遠心分離し、生菌体を分離した。生菌体を
40mLの0.1M カリウムリン酸緩衝液、pH7.5に懸濁し、20
mLずつ2本の100mL容三角フラスコに入れ、一方には(S)-
4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルを0.2g、も
う一方には(R)-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエス
テル0.2gを入れ、20℃で24時間振とうし反応させた。遠
心分離により上清を分離し、その0.2mLをメタノール0.8
mLで希釈し、生成したβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクト
ンをガスクロマトグラフィーで定量した。残りの上清全
量を減圧下に数mLまで濃縮した後、メタノール40mLを加
え、析出したリン酸塩結晶をろ別した。ろ液を再び減圧
下に濃縮し、濃縮液を得た。この濃縮液をHPLC移動相で
適宜希釈し、β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの光学
純度を測定した。結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】 ３株とも(R)-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステ
ルからは(R)-β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンが、(S)
-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルからは(S)-
β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンが、いずれも高い光
学純度で生じていることが確認された。
ルからは(R)-β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンが、(S)
-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルからは(S)-
β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンが、いずれも高い光
学純度で生じていることが確認された。
【００３０】（実施例３）菌体調製用培地２をそれぞれ
50mLずつ500mL容の坂口フラスコに入れ、殺菌後、以下
の菌株を一白金耳植菌し、26℃で48時間振とう培養し
た。 ロドコッカス・ロドクロラス（Rhodococcus rhodochrou
s）JCM 3202 ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythrop
olis）JCM 6821 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacteriu
m tumefaciens）IFO 12664 培養液40mLを遠心分離し、生菌体を分離した。実施例２
と同様に生菌体を40mLの0.1M カリウムリン酸緩衝液, p
H7.5に懸濁し、20mLずつ2本の100mL容三角フラスコに入
れた。一方には(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチル
エステルを0.2g、もう一方には(R)-4-クロロ-3-ヒドロ
キシ酪酸エチルエステル0.2gを入れ、20℃で24時間振と
うし反応させた。遠心分離により上清を分離し、その0.
2mLをメタノール0.8mLで希釈し、生成したβ-ヒドロキ
シ-γ-ブチロラクトンをガスクロマトグラフィーで定量
した。また、β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの光学
純度も実施例２と同様の操作で測定した。結果を表２に
示す。
50mLずつ500mL容の坂口フラスコに入れ、殺菌後、以下
の菌株を一白金耳植菌し、26℃で48時間振とう培養し
た。 ロドコッカス・ロドクロラス（Rhodococcus rhodochrou
s）JCM 3202 ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythrop
olis）JCM 6821 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacteriu
m tumefaciens）IFO 12664 培養液40mLを遠心分離し、生菌体を分離した。実施例２
と同様に生菌体を40mLの0.1M カリウムリン酸緩衝液, p
H7.5に懸濁し、20mLずつ2本の100mL容三角フラスコに入
れた。一方には(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチル
エステルを0.2g、もう一方には(R)-4-クロロ-3-ヒドロ
キシ酪酸エチルエステル0.2gを入れ、20℃で24時間振と
うし反応させた。遠心分離により上清を分離し、その0.
2mLをメタノール0.8mLで希釈し、生成したβ-ヒドロキ
シ-γ-ブチロラクトンをガスクロマトグラフィーで定量
した。また、β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの光学
純度も実施例２と同様の操作で測定した。結果を表２に
示す。
【００３１】
【表２】 実施例２と同様、３株とも(R)-4-クロロ-3-ヒドロキシ
酪酸エチルエステルからは(R)-β-ヒドロキシ-γ-ブチ
ロラクトンが、(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチル
エステルからは(S)-β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトン
が、いずれも高い光学純度で生じていることが確認され
た。
酪酸エチルエステルからは(R)-β-ヒドロキシ-γ-ブチ
ロラクトンが、(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチル
エステルからは(S)-β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトン
が、いずれも高い光学純度で生じていることが確認され
た。
【００３２】（実施例４）菌体調製用培地１を50mLずつ
12本の500mL容の坂口フラスコに入れ、殺菌後、スポリ
ディオボラス・パラロゼウス（Sporidiobolus pararose
us）IFO 0376株を一白金耳植菌し、26℃で48時間振とう
培養した。培養液500mLを遠心分離し、生菌体を分離し
た。生菌体を500mLの0.1Mカリウムリン酸緩衝液, pH7.5
に懸濁し、100mLずつ500mL容坂口フラスコに入れた。さ
らに(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルを
フラスコ1本あたり2.0g添加し、20℃で24時間振とうし
反応させた。遠心分離により上清を分離し、上清を500m
Lの酢酸エチルで抽出し、水層を分離した。水層を活性
炭カラムに通し、カラムは蒸留水で洗浄した。次いで、
アセトン1000mLでβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを
溶出した。溶離液を減圧下に濃縮し、濃縮液 1.83gを得
た。純度 40.0%、光学純度S体 98.7%eeであった。
12本の500mL容の坂口フラスコに入れ、殺菌後、スポリ
ディオボラス・パラロゼウス（Sporidiobolus pararose
us）IFO 0376株を一白金耳植菌し、26℃で48時間振とう
培養した。培養液500mLを遠心分離し、生菌体を分離し
た。生菌体を500mLの0.1Mカリウムリン酸緩衝液, pH7.5
に懸濁し、100mLずつ500mL容坂口フラスコに入れた。さ
らに(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルを
フラスコ1本あたり2.0g添加し、20℃で24時間振とうし
反応させた。遠心分離により上清を分離し、上清を500m
Lの酢酸エチルで抽出し、水層を分離した。水層を活性
炭カラムに通し、カラムは蒸留水で洗浄した。次いで、
アセトン1000mLでβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを
溶出した。溶離液を減圧下に濃縮し、濃縮液 1.83gを得
た。純度 40.0%、光学純度S体 98.7%eeであった。
【００３３】（実施例５）菌体調製用培地１をそれぞれ
50mLずつ500mL容の坂口フラスコに入れ、殺菌後、以下
の菌株を一白金耳植菌し、26℃で48時間振とう培養し
た。 シゾブラストスポリオン・コバヤシイ（Schizoblastspo
rion kobayashii）IFO 1644 スポリディオボラス・パラロゼウス（Sporidiobolus pa
raroseus）IFO 0376 また、50mLの菌体調製培地２を同様に500mL容坂口フラ
スコに入れて殺菌後、ロドコッカス・ロドクロラス（Rh
odococcus rhodochrous）JCM 3202を一白金耳植菌し、2
6℃で48時間振とう培養した。それぞれの培養液20mLを
遠心分離し、生菌体を分離した。生菌体を20mLの0.1Mカ
リウムリン酸緩衝液, pH7.5に懸濁し、20mLずつ100mL容
三角フラスコに入れた。次いで、(S)-4-クロロ-3-ヒド
ロキシ酪酸エチルエステル0.1g、(R)-4-クロロ-3-ヒド
ロキシ酪酸エチルエステル0.1gずつを各フラスコに添加
し、20℃で24時間振とう反応を行った。遠心分離により
上清を分離し、その0.2mLをメタノール0.8mLで希釈し、
生成したβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンをガスクロ
マトグラフィーで定量した。残りの上清全量を減圧下に
数mLまで濃縮した後、メタノール20mLを加え、析出した
リン酸塩結晶をろ別した。ろ液を再び減圧下に濃縮し、
濃縮液を得た。この濃縮液をHPLC移動相で適宜希釈し、
β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの光学純度を測定し
た。結果を表３に示す。いずれの菌株においても、基質
として光学純度が低い基質を与えた場合には、生成物の
光学純度が低くなることが確認された。つまり、これら
の微生物によるβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの生
成反応は、いずれも、基質として与えられた化合物の光
学純度が生成物の光学純度に反映されていることが確認
された。
50mLずつ500mL容の坂口フラスコに入れ、殺菌後、以下
の菌株を一白金耳植菌し、26℃で48時間振とう培養し
た。 シゾブラストスポリオン・コバヤシイ（Schizoblastspo
rion kobayashii）IFO 1644 スポリディオボラス・パラロゼウス（Sporidiobolus pa
raroseus）IFO 0376 また、50mLの菌体調製培地２を同様に500mL容坂口フラ
スコに入れて殺菌後、ロドコッカス・ロドクロラス（Rh
odococcus rhodochrous）JCM 3202を一白金耳植菌し、2
6℃で48時間振とう培養した。それぞれの培養液20mLを
遠心分離し、生菌体を分離した。生菌体を20mLの0.1Mカ
リウムリン酸緩衝液, pH7.5に懸濁し、20mLずつ100mL容
三角フラスコに入れた。次いで、(S)-4-クロロ-3-ヒド
ロキシ酪酸エチルエステル0.1g、(R)-4-クロロ-3-ヒド
ロキシ酪酸エチルエステル0.1gずつを各フラスコに添加
し、20℃で24時間振とう反応を行った。遠心分離により
上清を分離し、その0.2mLをメタノール0.8mLで希釈し、
生成したβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンをガスクロ
マトグラフィーで定量した。残りの上清全量を減圧下に
数mLまで濃縮した後、メタノール20mLを加え、析出した
リン酸塩結晶をろ別した。ろ液を再び減圧下に濃縮し、
濃縮液を得た。この濃縮液をHPLC移動相で適宜希釈し、
β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの光学純度を測定し
た。結果を表３に示す。いずれの菌株においても、基質
として光学純度が低い基質を与えた場合には、生成物の
光学純度が低くなることが確認された。つまり、これら
の微生物によるβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの生
成反応は、いずれも、基質として与えられた化合物の光
学純度が生成物の光学純度に反映されていることが確認
された。
【００３４】
【表３】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 基質：(R,S)-4-クロロ-3-ヒドロキシ 酪酸エチルエステル等量混合物 β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトン 菌株 濃度,% 光学純度,%ee ─────────────────────────S. kobayashii IFO 1644 0.040 S 27.7S. pararoseus IFO 0376 0.219 R 12.0R. rhodochrous JCM 3202 0.087 S 27.9 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００３５】
【発明の効果】本発明によればシゾブラストスポリオン
（Schizoblastsporion）属、スポリディオボラス（Spor
idiobolus）属、オーレオバシディウム（Aureobasidiu
m）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、またはアグロ
バクテリウム（Agrobacterium）属に属する微生物を作
用させることにより、4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エ
ステルからβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを容易に
得ることができる。また、光学活性な4-ハロゲノ-3-ヒ
ドロキシ酪酸エステルを基質とすれば、実質的にラセミ
化なしに光学活性なβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトン
を得ることができる。
（Schizoblastsporion）属、スポリディオボラス（Spor
idiobolus）属、オーレオバシディウム（Aureobasidiu
m）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、またはアグロ
バクテリウム（Agrobacterium）属に属する微生物を作
用させることにより、4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エ
ステルからβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを容易に
得ることができる。また、光学活性な4-ハロゲノ-3-ヒ
ドロキシ酪酸エステルを基質とすれば、実質的にラセミ
化なしに光学活性なβ-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトン
を得ることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 17/04 (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/14 (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/16 (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｇ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (5)
- 【請求項１】シゾブラストスポリオン（Schizoblastspo
rion）属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属、
オーレオバシディウム（Aureobasidium）属、ロドコッ
カス（Rhodococcus）属、およびアグロバクテリウム（A
grobacterium）属からなる群から選択されるいずれかの
属に属し、4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステルより
β-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンを生成する能力を有
する微生物の菌体あるいはその処理物を4-ハロゲノ-3-
ヒドロキシ酪酸エステルに作用させ、生成するβ-ヒド
ロキシ-γ-ブチロラクトンを採取する工程を含む、β-
ヒドロキシ-γ-ブチロラクトンの製造方法。 - 【請求項２】4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ酪酸エステル
が、4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルである
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】R体またはS体の4-ハロゲノ-3-ヒドロキシ
酪酸エステルを基質として、R体またはS体のβ−ヒドロ
キシ−γ−ブチロラクトンを生成することを特徴とする
請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】微生物が、以下の群から選択されるいずれ
かの微生物である請求項１に記載の方法。シゾブラスト
スポリオン・コバヤシイ（Schizoblastsporion kobayas
hii）、スポリディオボラス・パラロゼウス（Sporidiob
olus pararoseus）、オーレオバシディウム・プルラン
ス（Aureobasidium pululans）、ロドコッカス・エリス
ロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ロドコッカス
・ロドクロラス（Rhodococcus rhodochrous）、および
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacteriu
m tumefaciens） - 【請求項５】微生物が、以下の群から選択されるいずれ
かの微生物である請求項４に記載の方法。シゾブラスト
スポリオン・コバヤシイ（Schizoblastsporion kobayas
hii）IFO 1644、スポリディオボラス・パラロゼウス（S
poridiobolus pararoseus）IFO 0376、オーレオバシデ
ィウム・プルランス（Aureobasidium pululans）IFO 63
53、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus eryt
hropolis）JCM 6821、ロドコッカス・ロドクロラス（Rh
odococcus rhodochrous）JCM 3202、およびアグロバク
テリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaci
ens）IFO 12664
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001004182A JP2002204699A (ja) | 2001-01-11 | 2001-01-11 | β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの製造方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002204699A true JP2002204699A (ja) | 2002-07-23 |
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ID=18872405
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|---|---|---|---|
| JP2001004182A Pending JP2002204699A (ja) | 2001-01-11 | 2001-01-11 | β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002204699A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003038194A (ja) * | 2001-07-26 | 2003-02-12 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類の製造方法 |
| KR100657204B1 (ko) | 2004-07-23 | 2006-12-14 | 엔자이텍 주식회사 | 효소적 방법에 의한 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤의 제조 방법 |
| WO2007035066A1 (en) * | 2005-09-26 | 2007-03-29 | Enzytech, Ltd. | The method of making optically active 3-acyloxy-gamma-butyrolactone and optically active 3-hydroxy-gamma-butyrolactone by enzymatic method |
| WO2007100227A1 (en) * | 2006-03-02 | 2007-09-07 | Lg Chem, Ltd. | Method for preparing (s)-3-hydroxy-gamma-butyrolactone using hydrolase |
-
2001
- 2001-01-11 JP JP2001004182A patent/JP2002204699A/ja active Pending
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|---|---|---|---|---|
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| WO2007035066A1 (en) * | 2005-09-26 | 2007-03-29 | Enzytech, Ltd. | The method of making optically active 3-acyloxy-gamma-butyrolactone and optically active 3-hydroxy-gamma-butyrolactone by enzymatic method |
| WO2007100227A1 (en) * | 2006-03-02 | 2007-09-07 | Lg Chem, Ltd. | Method for preparing (s)-3-hydroxy-gamma-butyrolactone using hydrolase |
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