JPH03183499A - 光学活性３―ヒドロキシ酪酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は光学活性３−ヒドロキシ醋酸の製造方法に関す
る。更に詳しくは、１．３−ブタンジオールのエナンチ
オマー混合物に特定の微生物或いはその処理物を作用さ
せ、生成する光学活性な３−ヒドロキシ酪酸を採取する
ことを特徴とする光学活性３−ヒドロキシ酪酸の製造方
法に関する。

３−ヒドロキシ酪酸の光学活性体は種々の医薬・農薬等
の重要な合成原料である。

〔従来技術及び発明が解決しようとする課題〕従来、光
学活性３−ヒドロキシ酪酸の製造方法としては、化学合
成されたラセミ体を分割剤により光学分割する方法（Ｈ
ｅｌｖ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、。

６４、１４６７（１９８１））　、微生物により住産さ
れるポリ−β−ヒドロキシ酪酸を加水分解して得る方法
（Ｈｅｌｖ、　ＣｈｉＩＩｌ、　Ａｃｔａ、、　６５．
４５９（１９８２））、アセト酢酸エチルの微生物によ
る不斉還元法（Ｈｅｌｖ。

Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、、　６６、４８５　（１９８３
））、或いは酵母のβ−酸化系を用いて酪酸から製造す
る方法（特開昭５８−１５８１９０号公報）、１，３−
ブタンジオールのラセミ体にロドコッカス属の微生物を
作用させ製造する方法（特開昭６４−７４９９９号公報
）等が知られている。

しかしながら、これらの製造法についてその特徴を見て
みると、夫々一長一短があり、分割剤を用いる方法は分
割剤が高価であること、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸を加
水分解して得る方法はこの生成物が高価であること、微
生物による不斉還元法は基質濃度が低いこと、酵母のβ
酸化系を用いて酪酸から製造する方法は微生物の培養成
いは反応に長時間を要すること等、いずれも種々の問題
点を有しており、必ずしも工業的に優れた方法とは言い
難い。

１．３−ブタンジオールのラセミ体に微生物を作用させ
製造する方法は、原料の価格から考えると有利な方法と
考えられるが、前述のロドコッカス属の微生物を用いる
方法では、やはり基質濃度が低く（約１％）、必ずしも
有利な方法とは言い難い。またこの方法により　（Ｒ）
体の製造法は知られているが、（Ｓ）体の製造法は全く
知られていない。

〔課題を解決するための手段〕

これらの事情に鑑み、本発明者等は１．３−ブタンジオ
ールのエナンチオマー混合物、とりわけ工業的に安価に
製造される１、３−ブタンジオールのラセミ体に微生物
を作用させ光学活性な３−ヒドロキシ酪酸を得る方法は
優れた方法であると考え、更に広い範囲の微生物を対象
に、より優秀な微生物菌株を求めてスクリーニングを行
い、ＣＪ？）体を生成する菌株及び（Ｓ）体を生成する
菌株を見出し、本発明を完成させた。

本発明者らは簡便な方法で、光学活性３−ヒドロキシ酪
酸を得る方法として１．３−ブタンジオールのエナンチ
オマー混合物に微生物を作用させ製造する方法に着目し
、この目的に適した微生物を検索した結果、キャンディ
ダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、
シゾプラストスポリウム（Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓ
ｐｏｒｉｕｍ）属、或いはバチルス（Ｂａｃｉ　１ｌｕ
ｓ）属に属し、１，３−ブタンジオールを光学活性な（
Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸に変換する能力を有する微生
物、或いはその処理物を１゜３−ブタンジオールのエナ
ンチオマー混合物に作用させると、光学活性な（Ｒ）〜
３−ヒドロキシ酪酸を生成すること、及びキャンディダ
（Ｃａｎｄ　１ｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕ
　Ｉａ）属、イサッチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋ
ｉａ）属、タルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイコプシス（
Ｓａｃｃｈａｒｏｒｙｃｏｐｓ　ｉｓ）属、バチルス（
Ｂａｃｉ−ｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シトロバクタ−（Ｃ４
ｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、或いはエンテロバクタ−（Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、１゜３−ブタンジ
オールを光学活性な（Ｓ）　−３−ヒドロキシ酪酸に変
換する能力を有する微生物、或いはその処理物を１，３
−ブタンジオールのエナンチオマー混合物に作用させる
と、光学活性な（Ｓ）　−３−ヒドロキシ酪酸を生成す
ることを見出し、本発明を完成した。

本発明に使用する微生物としては、キャンディダ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾブラ
ストスポリウム（Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉ
ｕｍ）属、或いはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属
する微生物で１．３−ブタンジオールのエナンチオマー
混合物から（Ｒ）体の３−ヒドロキシ酪酸を生成しうる
もの、及びキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセ
ヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、イサッチェンキア（Ｉ
ｓｓａ−ｔｃｈｅｎｋｉａ）属、タルイベロマイセス（
Ｋｌｕｙｖｅｒ。

ｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトル
ラ（Ｒｈ。

ｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏ−ｍｙｃｏｐｓ　ｉｓ）属、バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シトロバクタ−（Ｃｉ　ｔｒ
ｏｂａｃｔｅｒ）属、或いはエンテロバクタ−（Ｅｎｔ
ｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物で１．３−ブタ
ンジオールのエナンチオマー混合物から（Ｓ）体の３−
ヒドロキシ酪酸を生威しうるものであればいずれも使用
可能である。

具体的には、（Ｒ）体の生成菌株としては、キャンディ
ダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）　ＩＦ
Ｏ１０８６、ＩＦＯ０６３９、ピキア・ヒープ４−　（
Ｐｉｃｈｉａｈｅｅｄｉｉ）　ｒＦｏ　１００２０　、
ピキア・リンデネリー（Ｐｉｃｈｉａ　ｌ１ｎｄｎｅｒ
ｉｉ）　ＡＴＣＣ３２６５Ｂ　、シゾブラストスポリウ
ム・コバヤシ（Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｕ
ｍｋｏｂａｙａｓｈｉ）　ＩＦＯ１６４４、或いはバチ
ルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）　
ＡＨＩＪ　１７０７等を挙げることができる。

また、（Ｓ）体の生成菌株としては、キャンディダ・ユ
チリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）　ＩＦＯ０６
１９＋ＩＰ００９８８、キャンディダ・ロブスタ　（Ｃ
ａｎｄｉｄａｒｏｂｕｓｔａ）　ＡＨＵ　３４０２　、
キャンディダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｕｇｏｓａ
）　ＩＦＯ１３６４、キャンディダ・クルセイ（Ｃａｎ
ｄｉｄａ　ｋｒｕｓｅｉ）　ＤＳＭ　７００７３、キャ
ンディダ・パラブシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｐａｒａ
ｐｓｉｌｏｓｉｓ）ｒＦｏ　１３９６、ハンセヌラ・ポ
リモルフｙ　ＤＬＩ（Ｈａｎ−ｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈａ　ＤＬＩ）　ＡＴＣＣ２６０１２、ハンセ
ヌラ・【ヌタ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｍ１ｎｕｔａ）　
ＩＦＯ０９７５、ハンセヌラ・ヘンリシー（Ｈａｎｓｅ
ｎｕｌａ　ｈｅｎｒｉｃｉｉ）ＤＳＭ　７０２７２　、
ハンセヌラ・ウィッカーハミー（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　
ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）　ＩＦＯ１７０６、イサッチ
ェンキア・スクツラータ・バー・スクツラータ（Ｉｓｓ
ａｔｃｈｅｎｋｉａ　５ｃｕｔｕｌａｔａ　ｖａｒ、　
５ｃｕｔｕｌａｔａ）　ＩＦＯ１００７０、タルイベロ
マイセス・ドラスフィラルム（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃ
ｅｓ　ｄｒａｓｐｈｉｌａｒｕｍ）　ＩＦＯ１０１２、
タルイベロマイセス◆ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓＩａｃｔｉｓ）　ＩＦＯ１９０３、ピキア・ファ
リノサ（Ｐｉｃｈｉａｆａｒｉｎｏｓａ）　ＩＦＯ１１
６３、ピキア・フェルシーム（Ｐｉｃｈｉａ　ｑｕｅｒ
ｃｕｕｍ）　ＩＦＯ１２７６、ピキア・バストリス（Ｐ
ｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＤＳＭ　７０３８２
　、ピキア・ヒープ４−（Ｐｉｃｈｉａ　ｈｅｅｄｉｉ
）　ＩＦＯ１００１９、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈ
ｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｇｌｕｔｔｎｉｓ）ＩＦＯ０８９
８、サッカロマイコプシス・リボリティ力（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ　ｌ１ｐｏｌｙｔｉｃａ）　Ｉ
ＰＯ１５５０、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　ＩＦＯ３１３４、バチルス・
プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ）ＡＴＣ
Ｃ７０６１、コリネバクテリウム・亀シガネンセ（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋　ｎ＋ｉｃｈｉｇａｎｅ
ｎｓｅ）　ＩＦＯ１３７６２、シトロバクタ−・フロイ
ンデ４　　（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ
）　ＡＨＵ　１５３４、或いはエンテロバクタ−・クロ
アカアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ
）　ＡＴＣＣ７２５６等を挙げることができる。

これらの微生物は、野生株、変異株、又は細胞融合もし
くは遺伝子操作法などの遺伝的手法により誘導される組
み替え株等、いずれの株でも好適に用いることができる
。

尚、ＩＦＯ番号の付された微生物は、（財）醗酵研究所
（ＩＦＯ）発行のＬｉ５ｔ　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、
第８版、第１巻（１９８８）に記載されており、該ＩＦ
Ｏから人手することができる。ＡＨＵ番号の付された微
生物は、日本微生物株保存連盟（ＪＦＣＣ）発行のＣａ
ｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ＋第１ｔｕｒ
ｅｓ＋）に記載されており、北海道大学農学部から人手
することができる。ＡＴＣＣ番号の付された微生物は、
Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）発行のＣａｔａｌｏｇｕｅ
　　ｏｆ　　Ｂａｃｔｅｒｉａ　　Ｐｈａｇｅｓ　　ｒ
ＤＮＡ　　Ｖｅｃｔｏｒｓ。

第１６版（１９８５）に記載されており、該ＡＴＣＣか
ら入手することができる。ＤＳＭ番号の付された微生物
はＤｅｕｔｓｃｈ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）発行のＣａｔａｌ
ｏｇ　ｏｆ　５ｔｒａｉｎｓ（１９８３）に記載されて
おり、該ＤｓＭから入手することができる。

本発明に用いる微生物を培養するための培地はその微生
物が増殖し得るものであれば特に制限はない。例えば、
炭素源としては、上記微生物が利用可能であればいずれ
も使用でき、具体的には、グルコース、フルクトース、
シュクロース、デキストリン等の糖類、ソルビトール、
エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマール
酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類及びそ
の塩類、パラフィン等の炭化水素類等、或いはこれらの
混合物を使用することができる。窒素源としては、例え
ば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニ
ウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム
塩、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、
カゼイン加水分解物、尿素等の無機有機含窒素化合物、
或いはこれらの混合物を使用することができる。他に無
機塩、微量金属塩、ビタミン類等の通常の培養に用いら
れる栄養源を適宜混合して用いることができる。また、
必要に応じて微生物の増殖を促進する因子、本発明の目
的化合物の生成能力を高める因子、例えば１．３−ブタ
ンジオールのエナンチオマー混合物、或いは培地のｐ）
Ｉ保持に有効な物質も添加できる。

本発明でいう１．３−ブタンジオールのエナンチオマー
混合物とは、１，３−ブタンジオールの（Ｉ？）体或い
は（Ｓ）体の比率がいかなるものでも良いことを意味す
るが、実質的には、この比率がＩ：１のラセミ体が安価
であり、好適であることは言うまでもない。

培養方法としては、培地ｐＨは３．０〜９．５、好まし
くは５〜８、培養温度は２０〜４５°Ｃ１好ましくは２
５〜３７°Ｃで、嫌気的或いは好気的に、その微生物の
生育に適した条件下５〜１２０時間、好ましくは１２〜
７２時間程度培養する。

１．３−ブタンジオールのエナンチオマー混合物から光
学活性な３−ヒドロキシ酪酸を生成させる方法としては
、微生物の培養時に培地の中に最初から或いは途中から
１．３−ブタンジオールのエナンチオマー混合物を添加
する方法、培養終了後の培養液に１．３−ブタンジオー
ルのエナンチオマー混合物を添加する方法、或いは培養
液から遠心分離等により菌体を分離し、これをそのまま
或いは洗浄した後、緩衝液、水等に再懸濁したものに１
．３−ブタンジオールのエナンチオマー混合物を添加し
、反応させる方法等がある。

培養時の最初或いは途中から１．３−ブタンジオールの
エナンチオマー混合物を添加する場合は、添加濃度は特
に制限されないが０．１〜１０％程度が好ましい。

分離菌体を用いて反応させる場合はｐＨ３〜９、好まし
くはｐ）１５〜８の範囲で、温度は１０〜６０゛Ｃ１好
ましくは２０〜４０°Ｃの温度で１〜１２０時間程度、
攪拌下或いは静置下で行う。１，３−ブタンジオールの
エナンチオマー混合物の使用濃度は特に制限されないが
、０．１〜１０％程度が好ましい。

この際、１．３−ブタンジオールのエナンチオマー混合
物は、そのまま或いは水に溶解し、又は反応に影響を与
えないような有機溶媒に溶解したり、界面活性剤等に分
散させたりして、反応の始めから一括に或いは分割して
添加しても良い。

また、分離菌体を用いて反応を行う場合は生菌体のまま
でも良いし、菌体破砕物、アセトン処理、凍結乾燥等の
処理を施したものでも良い。

また、これらの菌体或いは菌体処理物を、例えばボリア
クリアミドゲル法、含硫多糖ゲル法（カラギーナンゲル
法等）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法等の公知の方法
で固定化して用いることもできる。

生成した光学活性な３−ヒドロキシ酪酸の採取は、培養
液或いは反応液から直接或いは菌体分離後、有機溶媒で
抽出し、カラムクロマトグラフィー、蒸留等の通常の精
製方法を用いれば容易に得られる。

〔実施例〕

以下、本発明を具体的に実施例にて説明するが、本発明
はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ ラセミ体の１．３−ブタンジオール０．５％、酵母エキ
ス０．５％、ペプトン１％、肉エキス０．５％、リン酸
二カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５
％（ｐＨ７，０）　ヨ／）成る培地１００ｍを５００　
ｄ容坂ロフラスコに入れ、滅菌後、表１に示す菌株を夫
々植菌し、３０’Ｃで４８時間往復振盪培養を行った。

培養終了後、培養液４０−を取り、遠心分離により菌体
を分離、生理食塩水で１回洗浄し、生菌体を得た。

この生菌体に水４−を加え菌体懸濁液とした後、ここか
ら４ｄを径１８Ｉｌｌｌｌの試験管に採取した。

これにラセミ体の４％１，３−ブタンジオール溶液４Ｉ
ｌｄｌを加え、３０℃で２４時間振盪しながら反応させ
た０反応終了後、遠心分離にて除菌し、上澄液を得た。

この上澄液の５−を取り、高速液体クロマトグラフィー
（カラム；島津５ＣＲ−１０１８、溶媒二０．１％リン
酸、流速：１ｄ／分、検出：　２１０ｎｍ）により生成
した３−ヒドロキシ酪酸を定量した。

また、こうして生成した３−ヒドロキシ酪酸の絶対配置
と光学純度は次のようにして求めた。

即ち、反応上澄液をイオン交換樹脂（Ｄｏｓｖｅｘｌ−
ｘ８．　ｃｌ型）のカラム（２Ｉ１１）に通し、３−ヒ
ドロキシ酪酸を吸着させた。次いで、水洗後、ＩＮ塩酸
４−で溶出した。減圧下、塩酸を除去した後、常法によ
りメタノールでメチルエステル化を行った。次いで、こ
のサンプルを光学分割カラムを用いた高速液体クロマト
グラフィー（カラム：ダイセル化学工業製キラルセルＯ
Ｄ、４．６ａ＋ａ＋ＩＤ　Ｘ　２５０ｍｍ　、溶媒：ｎ
−ヘキサン／２−プロパツール＝９：１、流速：０．５
１ｄ／分、検出＝２２０ｎｍ）により分析し、生成物の
絶対配置及び光学純度を求めた。

得られた結果を表１に示す。

表 表 （続 き） 表 １ （続 き） 実施例２ 酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ペプトン０
．５％、ラセミ体１，３−ブタンジオール２％の組成の
培地（ｐＨ６，０）　Ｉ　Ｉｔを２．６１容ミニジャー
ファーメンタ−に入れ、滅菌後、表２に示す菌株を夫々
植菌し、３０°Ｃ＋　１ｖｖｍ＋　４００ｒｐ−の条件
下で４８時間培養を行った。

培養終了後、遠心分離により菌体を除き上澄液を得た。

このサンプルに塩酸を加えｐＨを２にした後、飽和食塩
溶液とし、酢酸エチルｉｆにて３回抽出した。この抽出
液を合わせ、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を
留去し、次いで減圧蒸留し、無色油状物質を得た。これ
らについて実施例１の場合と同様に生成物の絶対配置及
び光学純度の測定を行った。

得られた結果を表２に示す。

表 〔発明の効果〕 本発明の微生物を用いた光学活性な３−ヒドロキシ酪酸
の製造方法は工業的に比較的簡便な方法で光学活性な３
−ヒドロキシ酪酸を製造できることを可能にさせるもの
であり、極めて有利である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、１，３−ブタンジオールのエナンチオマー混合物に
   、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃ
   ｈｉａ）属、シゾブラストスポリウム（Ｓｃｈｉ−ｚｏ
   ｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、或いはバチルス（Ｂ
   ａｃｉ−ｌｌｕｓ）属に属し、１，３−ブタンジオール
   を光学活性な（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸に変換する能
   力を有する微生物、或いはその処理物を作用させ、生成
   する光学活性な（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を採取する
   ことを特徴とする光学活性３−ヒドロキシ酪酸の製造方
   法。 ２、１，３−ブタンジオールのエナンチオマー混合物に
   、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈ
   ａｎｓｅｎｕｌａ）属、イサッチェンキア（Ｉｓｓａ−
   ｔｃｈｅｎｋｉａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙ
   ｖｅｒｏ−ｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属
   、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロ
   マイコプシス（Ｓａ−ｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）
   属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリ
   ウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シトロバ
   クター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、或いはエンテロ
   バクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、１，
   ３−ブタンジオールを光学活性な（Ｓ）−３−ヒドロキ
   シ酪酸に変換する能力を有する微生物、或いはその処理
   物を作用させ、生成する光学活性な（Ｓ）−３−ヒドロ
   キシ酪酸を採取することを特徴とする光学活性３−ヒド
   ロキシ酪酸誘導体の製造方法。