JPH0616718B2 - 固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法 - Google Patents
固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法Info
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- JPH0616718B2 JPH0616718B2 JP59214725A JP21472584A JPH0616718B2 JP H0616718 B2 JPH0616718 B2 JP H0616718B2 JP 59214725 A JP59214725 A JP 59214725A JP 21472584 A JP21472584 A JP 21472584A JP H0616718 B2 JPH0616718 B2 JP H0616718B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、固定化酵素あるいは固定化微生物を用いて、
インドリン−２−カルボン酸エステルを光学分割し、医
薬品として有用な光学活性インドリン−２−カルボン酸
を製造する方法に関する。
インドリン−２−カルボン酸エステルを光学分割し、医
薬品として有用な光学活性インドリン−２−カルボン酸
を製造する方法に関する。
更に詳しくは、一般式Ｉ （式中、ＲはＣ２〜Ｃ８の脂肪族化水素基を表わす） で表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸
エステルＩと、疎水性の担体に固定化された立体選択的
エステラーゼ活性を有するバチルス（Bacillus）属もし
くはアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物
又は哺乳動物臓器由来の酵素を用いた固定化酵素もしく
はバチルス（Bacillus）属に属する微生物を用いた固定
化微生物とを接触、反応させて、構造式（Ｒ）−II で表わされる光学活性（Ｒ）−インドリン−２−カルボ
ン酸と、構造式（Ｓ）−Ｉ （Ｒは前記と同じ） で表わされる光学活性（Ｓ）−インドリン−２−カルボ
ン酸エステルとに不斉加水分解し、固定化に用いた担体
との親水性の差を利用して、親水性のインドリン−２−
カルボン酸を水または緩衝液で回収、採取し、次に、担
体に吸着・結合しているインドリン−２−カルボン酸エ
ステルを有機溶剤で溶出、採取し、更に必要に応じて、
該エステル（Ｓ）−Ｉを加水分解して（Ｒ）−IIの対掌
体である光学活性インドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−
IIを生成させ、採取する方法に関する。即ち、不斉加水
分解反応と、生成物インドリン−２−カルボン酸の反応
液からの分離、回収を同時に行うことを特徴とするイン
ドリン−２−カルボン酸の製造方法に関する。
エステルＩと、疎水性の担体に固定化された立体選択的
エステラーゼ活性を有するバチルス（Bacillus）属もし
くはアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物
又は哺乳動物臓器由来の酵素を用いた固定化酵素もしく
はバチルス（Bacillus）属に属する微生物を用いた固定
化微生物とを接触、反応させて、構造式（Ｒ）−II で表わされる光学活性（Ｒ）−インドリン−２−カルボ
ン酸と、構造式（Ｓ）−Ｉ （Ｒは前記と同じ） で表わされる光学活性（Ｓ）−インドリン−２−カルボ
ン酸エステルとに不斉加水分解し、固定化に用いた担体
との親水性の差を利用して、親水性のインドリン−２−
カルボン酸を水または緩衝液で回収、採取し、次に、担
体に吸着・結合しているインドリン−２−カルボン酸エ
ステルを有機溶剤で溶出、採取し、更に必要に応じて、
該エステル（Ｓ）−Ｉを加水分解して（Ｒ）−IIの対掌
体である光学活性インドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−
IIを生成させ、採取する方法に関する。即ち、不斉加水
分解反応と、生成物インドリン−２−カルボン酸の反応
液からの分離、回収を同時に行うことを特徴とするイン
ドリン−２−カルボン酸の製造方法に関する。
本発明の場合、立体選択的エステラーゼを活性を有する
酵素あるいは微生物を選択することにより不斉加水分解
生成物として（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸と
（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸エステルの組合わ
せの生成物を得ることができ、各光学活性体を随時採取
することができる。
酵素あるいは微生物を選択することにより不斉加水分解
生成物として（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸と
（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸エステルの組合わ
せの生成物を得ることができ、各光学活性体を随時採取
することができる。
これら光学活性インドリン−２−カルボン酸類化合物は
種々医薬品の原料となりうる重要な化合物である。例え
ば（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸はアンジオテン
シンＩ変換酵素の阻害剤として有用な血圧降下剤（Ｓ）
−１−〔（Ｓ）−３−メルカププト−２−オキソプロピ
ル〕−インドリン−２−カルボン酸構造式： 等に利用できる。〔文献 J.Med.Chem.,26,394(1983)〕 （従来の技術と問題点〕 従来、酵素反応は遊離の酵素を反応器に加え、回分法で
反応が行われ、反応終了後、酵素は使いすてにされてい
たが、酵素は一般的に高価であるためコスト的に不利と
なり、また不安定でもあるため酵素の工業的利用は限ら
れていた。さらに回分法では酵素反応終了後、反応生成
物を反応液から分離する方法として、 １）有機溶媒で抽出分離する方法。
種々医薬品の原料となりうる重要な化合物である。例え
ば（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸はアンジオテン
シンＩ変換酵素の阻害剤として有用な血圧降下剤（Ｓ）
−１−〔（Ｓ）−３−メルカププト−２−オキソプロピ
ル〕−インドリン−２−カルボン酸構造式： 等に利用できる。〔文献 J.Med.Chem.,26,394(1983)〕 （従来の技術と問題点〕 従来、酵素反応は遊離の酵素を反応器に加え、回分法で
反応が行われ、反応終了後、酵素は使いすてにされてい
たが、酵素は一般的に高価であるためコスト的に不利と
なり、また不安定でもあるため酵素の工業的利用は限ら
れていた。さらに回分法では酵素反応終了後、反応生成
物を反応液から分離する方法として、 １）有機溶媒で抽出分離する方法。
２）反応液を一旦有機溶媒に転溶した後、又は反応液を
そのままカラムクロマトグフィー処理することによって
分離する方法。
そのままカラムクロマトグフィー処理することによって
分離する方法。
３）反応液を一旦有機溶媒に転溶した後、又は反応液を
そのまま分留することによって分離する方法。
そのまま分留することによって分離する方法。
などが行われてきたが、操作が繁雑で収率が悪かった
り、時間がかかったり、特別の装置が必要であったりし
てコストが高くなるという欠点があった。
り、時間がかかったり、特別の装置が必要であったりし
てコストが高くなるという欠点があった。
これらの酵素の回分法による使いすて、生産物の回収方
法等の問題点を解決するため、近年、酵素や微生物の固
定化が研究され、酵素や微生物のくり返し使用、さらに
はカラムに充填して連続的に反応を行うことも可能とな
ってきた。しかし、固定化酵素を用いて“ラセミ体”を
原料として不斉加水分解と同時に反応生成物を分離し、
更にそれを連続的に行って成功した例はこれまで報告さ
れていない。
法等の問題点を解決するため、近年、酵素や微生物の固
定化が研究され、酵素や微生物のくり返し使用、さらに
はカラムに充填して連続的に反応を行うことも可能とな
ってきた。しかし、固定化酵素を用いて“ラセミ体”を
原料として不斉加水分解と同時に反応生成物を分離し、
更にそれを連続的に行って成功した例はこれまで報告さ
れていない。
（問題点を解決するための手段及び作用効果） 本発明者らは、さきにインドリン−２−カルボン酸エス
テルＩに作用し、光学活性インドリン−２−カルボン酸
II ＊と光学活性インドリン−２−カルボン酸エステルＩ
＊とに立体選択的に分割する酵素、あるいは微生物を見
出し、光学分割によるインドリン−２−カルボン酸の製
造方法を見出して提案している。
テルＩに作用し、光学活性インドリン−２−カルボン酸
II ＊と光学活性インドリン−２−カルボン酸エステルＩ
＊とに立体選択的に分割する酵素、あるいは微生物を見
出し、光学分割によるインドリン−２−カルボン酸の製
造方法を見出して提案している。
本発明者らは、これら酵素あるいは微生物の固定化と、
より簡便な生成物の分離技術を確立すべく鋭意努力を重
ねてきた。その結果、担体として、基質と生成物に対し
て親和性に差がある担体を選択し、該担体で酵素あるい
は微生物を固定化することによって、基質インドリン−
２−カルボン酸エステルの加水分解と、生成物インドリ
ン−２−カルボン酸の分離、回収とを同時に行うことに
成功し、本発明を完成した。以下、本発明を詳細に説明
する。
より簡便な生成物の分離技術を確立すべく鋭意努力を重
ねてきた。その結果、担体として、基質と生成物に対し
て親和性に差がある担体を選択し、該担体で酵素あるい
は微生物を固定化することによって、基質インドリン−
２−カルボン酸エステルの加水分解と、生成物インドリ
ン−２−カルボン酸の分離、回収とを同時に行うことに
成功し、本発明を完成した。以下、本発明を詳細に説明
する。
本発明の基質として用いられる、一般式 で表わされるインドリン−２−カルボン酸エステルは、
置換基ＲがＣ２〜Ｃ８の脂肪族炭化水素基の化合物であ
り、好ましくはエチル、ブチル、アミル、ヘキシル基か
らなるエステルである。またＩは、一般式II で表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸
に溶媒と反応試剤とを兼ねたアルコールを加え、インド
リン−２−カルボン酸の濃度５〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範
囲で、強酸性下、５０℃〜還流温度の範囲で１〜５時縮
合反応を行う。更に、この反応液をｐＨ7.0に調整後、
減圧濃縮により過剰のアルコールを除去する。濃縮液に
水又は飽和重炭酸ソーダを加え、酢酸エチル又はヘキサ
ン等のような疎水性有機溶媒を用いて抽出し、更に濃縮
すれば高純度の（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン
酸エステルＩが得られる。
置換基ＲがＣ２〜Ｃ８の脂肪族炭化水素基の化合物であ
り、好ましくはエチル、ブチル、アミル、ヘキシル基か
らなるエステルである。またＩは、一般式II で表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸
に溶媒と反応試剤とを兼ねたアルコールを加え、インド
リン−２−カルボン酸の濃度５〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範
囲で、強酸性下、５０℃〜還流温度の範囲で１〜５時縮
合反応を行う。更に、この反応液をｐＨ7.0に調整後、
減圧濃縮により過剰のアルコールを除去する。濃縮液に
水又は飽和重炭酸ソーダを加え、酢酸エチル又はヘキサ
ン等のような疎水性有機溶媒を用いて抽出し、更に濃縮
すれば高純度の（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン
酸エステルＩが得られる。
本発明において、構造式（Ｒ）−II で表わされる光学活性（Ｒ）−インドリン−２−カルボ
ン酸を生成させる場合、酵素としてはビオブラーゼＡＬ
−１５（起源；バチルス・サブチリスBacillus subtili
s、長瀬産業(株)製）、プロテアーゼ「アマノ」Ｐ（起
源；アスペルギルス・メレウスAspergillus melleus，
天野製薬(株)）、ステアプシン（起源；豚膵臓、和光純
薬(株)製）、膵臓性消化酵素ＴＡ（天野製薬(株)製）、
リパーゼNo．Ｌ−３１２６（起源；豚膵臓、シグマ社
製）等が使用できる。
ン酸を生成させる場合、酵素としてはビオブラーゼＡＬ
−１５（起源；バチルス・サブチリスBacillus subtili
s、長瀬産業(株)製）、プロテアーゼ「アマノ」Ｐ（起
源；アスペルギルス・メレウスAspergillus melleus，
天野製薬(株)）、ステアプシン（起源；豚膵臓、和光純
薬(株)製）、膵臓性消化酵素ＴＡ（天野製薬(株)製）、
リパーゼNo．Ｌ−３１２６（起源；豚膵臓、シグマ社
製）等が使用できる。
更に微生物としてはバチルス（Bacillus）属、あるいは
アスペルギルス（Aspergillus）属等に属する微生物が
あり、更に詳しくはバチルス・サブチリス（Bacillus s
ubtilis）IFO 3013或いはアスペルギルス・メレウス（A
spergillus melleus）IFO 4420がある。
アスペルギルス（Aspergillus）属等に属する微生物が
あり、更に詳しくはバチルス・サブチリス（Bacillus s
ubtilis）IFO 3013或いはアスペルギルス・メレウス（A
spergillus melleus）IFO 4420がある。
これら微生物の菌体を得るには、栄養源として通常資化
しうる炭素源、窒素源、ビタミン及びミネラルを適宜配
合したもの、たとえばグルコース、ペプトン、酵母エキ
ス、肉エキス等からなる栄養培地が用いられる。培養
は、温度１０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で、Ｐ
Ｈは３〜８、好ましくは６〜７であり、好気的に培養
し、通常２４〜４８時間行えばよい。こうして得られた
菌体は遠心分離或いは濾過等の処理で集菌し、そのまま
樹脂で固定し、固定化菌体とするが、微生物菌体を破砕
後、硫安分画やアセトン処理して得られる粗酵素として
から固定化して固定化酵素として使用することができ
る。
しうる炭素源、窒素源、ビタミン及びミネラルを適宜配
合したもの、たとえばグルコース、ペプトン、酵母エキ
ス、肉エキス等からなる栄養培地が用いられる。培養
は、温度１０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で、Ｐ
Ｈは３〜８、好ましくは６〜７であり、好気的に培養
し、通常２４〜４８時間行えばよい。こうして得られた
菌体は遠心分離或いは濾過等の処理で集菌し、そのまま
樹脂で固定し、固定化菌体とするが、微生物菌体を破砕
後、硫安分画やアセトン処理して得られる粗酵素として
から固定化して固定化酵素として使用することができ
る。
酵素あるいは微生物固定化用担体としては、疎水性をも
つ種々の担体が用いられる。疎水性をもつ担体とは、水
もしくは緩衝液中では不斉水解反応によって生成した親
水性化合物（Ｒ）−IIを吸着せず、エステル化合物
（Ｓ）−Ｉを疎水的相互作用によって吸着し、さらにこ
の吸着しているエステル化合物（Ｓ）−Ｉは低極性溶媒
中では速やかに脱着するような性質をもつ担体であるこ
とが望ましい。更に具体的な担体としては、例えば疎水
性をもつ合成吸着剤、疎水クロマトグラフィー用樹脂、
疎水性を持つ光架橋性樹脂、疎水性のウレタンプレポリ
マー樹脂、疎水基を化学結合させて導入した高分子物質
等が挙げられる。
つ種々の担体が用いられる。疎水性をもつ担体とは、水
もしくは緩衝液中では不斉水解反応によって生成した親
水性化合物（Ｒ）−IIを吸着せず、エステル化合物
（Ｓ）−Ｉを疎水的相互作用によって吸着し、さらにこ
の吸着しているエステル化合物（Ｓ）−Ｉは低極性溶媒
中では速やかに脱着するような性質をもつ担体であるこ
とが望ましい。更に具体的な担体としては、例えば疎水
性をもつ合成吸着剤、疎水クロマトグラフィー用樹脂、
疎水性を持つ光架橋性樹脂、疎水性のウレタンプレポリ
マー樹脂、疎水基を化学結合させて導入した高分子物質
等が挙げられる。
かかる担体への酵素の固定化は、公知の種々の方法によ
って行うことができる。例えば物理的吸着法、共有結合
法、イオン結合法、架橋法、包括法等が挙げられる。微
生物の場合にも包括法等が挙げられる〔福井・千畑・鈴
木編、酵素工学、１５７−２４３頁、講談社（１９８
１）；千畑一郎編、固定化酵素、講談社（１９７
５）〕。これらの固定化酵素或いは固定化微生物の調製
法のうち、方法の簡便さ、担体の物理的強度及び安価さ
などにより、酵素では疎水性を持つ合成吸着剤に酵素を
物理的に吸着させる方法、微生物では疎水性を持つ光架
橋性樹脂或いは疎水性のウレタンプレポリマー樹脂に微
生物菌体を包括する方法が工業的に望ましい。
って行うことができる。例えば物理的吸着法、共有結合
法、イオン結合法、架橋法、包括法等が挙げられる。微
生物の場合にも包括法等が挙げられる〔福井・千畑・鈴
木編、酵素工学、１５７−２４３頁、講談社（１９８
１）；千畑一郎編、固定化酵素、講談社（１９７
５）〕。これらの固定化酵素或いは固定化微生物の調製
法のうち、方法の簡便さ、担体の物理的強度及び安価さ
などにより、酵素では疎水性を持つ合成吸着剤に酵素を
物理的に吸着させる方法、微生物では疎水性を持つ光架
橋性樹脂或いは疎水性のウレタンプレポリマー樹脂に微
生物菌体を包括する方法が工業的に望ましい。
酵素或いは微生物の担体への担持量は、担体の担持能に
よって左右されるので、必しも一義的ではないが、酵素
では担体の湿重量１ｇ当り約0.1mg乃至約１００mg、通
常約1mg乃至約２０mg程度であればよく、微生物菌体で
は担体の湿重量１ｇ当り湿菌体0.1ｇ乃至１ｇ、通常約
0.15ｇ乃至約0.5ｇ程度であればよい。
よって左右されるので、必しも一義的ではないが、酵素
では担体の湿重量１ｇ当り約0.1mg乃至約１００mg、通
常約1mg乃至約２０mg程度であればよく、微生物菌体で
は担体の湿重量１ｇ当り湿菌体0.1ｇ乃至１ｇ、通常約
0.15ｇ乃至約0.5ｇ程度であればよい。
本固定化酵素或いは固定化微生物に負荷できる基質の量
としては、固定化した担体によって変わるが、基質を負
荷した時に未反応の基質が遊離する限界量まで可能であ
る。例えば合成吸着剤アンバーライトＸＡＤ−７を担体
とした固定化酵素をカラムに充填した場合、そのカラム
容積の１／３量までの基質を負荷することが可能であ
る。
としては、固定化した担体によって変わるが、基質を負
荷した時に未反応の基質が遊離する限界量まで可能であ
る。例えば合成吸着剤アンバーライトＸＡＤ−７を担体
とした固定化酵素をカラムに充填した場合、そのカラム
容積の１／３量までの基質を負荷することが可能であ
る。
化合物Ｉの水に対する溶解度は一般に低いが、例えばア
セトン、メタノール等の有機溶媒の界面活性剤等を反応
に支障とならない程度加えても良い。
セトン、メタノール等の有機溶媒の界面活性剤等を反応
に支障とならない程度加えても良い。
固定化酵素もしくは固定化微生物を用いて不斉加水分解
を行う場合、反応温度は通常１０〜６０℃の範囲で可能
であるが、２０〜４０℃で行うことが好ましい。本不斉
加水分解反応はｐＨ4.5〜ｐＨ１０の範囲で可能である
が、反応速度が大であるｐＨ６〜ｐＨ8.5の範囲で行う
ことが望ましい。また本反応では不斉加水分解の進行に
伴いインドリンカルボン酸を生じｐＨが低下する。その
ため基質化合物の負荷量が多いときには、緩衝液を使用
するなどしてｐＨを一定の範囲内に制御することが望ま
しい。この目的に適する緩衝液としては無機酸塩、有機
酸塩いずれの緩衝液も使用することができる。
を行う場合、反応温度は通常１０〜６０℃の範囲で可能
であるが、２０〜４０℃で行うことが好ましい。本不斉
加水分解反応はｐＨ4.5〜ｐＨ１０の範囲で可能である
が、反応速度が大であるｐＨ６〜ｐＨ8.5の範囲で行う
ことが望ましい。また本反応では不斉加水分解の進行に
伴いインドリンカルボン酸を生じｐＨが低下する。その
ため基質化合物の負荷量が多いときには、緩衝液を使用
するなどしてｐＨを一定の範囲内に制御することが望ま
しい。この目的に適する緩衝液としては無機酸塩、有機
酸塩いずれの緩衝液も使用することができる。
カラムを用いて反応を行う場合、固定化酵素或いは固定
化微生物をカラムに充填し、まず緩衝液を流し、次に基
質のエステル化合物（Ｒ，Ｓ）−Ｉを負荷し、負荷し終
わったら再び緩衝液を流すことによってカラム内で不斉
加水分解反応を行う。生成する親水的な化合物（Ｒ）−
IIは緩衝液に溶けてカラムから溶出される。この緩衝液
画分を高速液体クロマトグラフィー（Finepak SIL C8，
展開液；アセトニトリル：水＝1.5：１（ｖ／ｖ）、検
出；ＵＶ２１５ｎｍ）により分析し、画分中に化合物
（Ｒ）−IIがほとんど認められなくなった時点で緩衝液
にかえて低極性溶媒を流し、カラム内の固定化酵素或い
は固定化微生物に吸着している未反応の化合物（Ｓ）−
Ｉを溶出する。この溶媒画分を液体クロマトグラフィー
（条件上と同じ）で分析し、画分中に化合物（Ｓ）−Ｉ
がほとんど認められなくなれば、低極性溶媒にかえて再
び緩衝液を流すことによってカラム内を緩衝液で置換
し、基質のエステル化合物（Ｒ，Ｓ）−Ｉを負荷する。
これらの一連の操作をくり返すことによって化合物
（Ｒ，Ｓ）−Ｉの不斉加水分解と反応生成物の分取をパ
ルス的に連続して行うことが可能である。
化微生物をカラムに充填し、まず緩衝液を流し、次に基
質のエステル化合物（Ｒ，Ｓ）−Ｉを負荷し、負荷し終
わったら再び緩衝液を流すことによってカラム内で不斉
加水分解反応を行う。生成する親水的な化合物（Ｒ）−
IIは緩衝液に溶けてカラムから溶出される。この緩衝液
画分を高速液体クロマトグラフィー（Finepak SIL C8，
展開液；アセトニトリル：水＝1.5：１（ｖ／ｖ）、検
出；ＵＶ２１５ｎｍ）により分析し、画分中に化合物
（Ｒ）−IIがほとんど認められなくなった時点で緩衝液
にかえて低極性溶媒を流し、カラム内の固定化酵素或い
は固定化微生物に吸着している未反応の化合物（Ｓ）−
Ｉを溶出する。この溶媒画分を液体クロマトグラフィー
（条件上と同じ）で分析し、画分中に化合物（Ｓ）−Ｉ
がほとんど認められなくなれば、低極性溶媒にかえて再
び緩衝液を流すことによってカラム内を緩衝液で置換
し、基質のエステル化合物（Ｒ，Ｓ）−Ｉを負荷する。
これらの一連の操作をくり返すことによって化合物
（Ｒ，Ｓ）−Ｉの不斉加水分解と反応生成物の分取をパ
ルス的に連続して行うことが可能である。
本固定化酵素或いは固定化微生物を用いて回分法でラセ
ミ体化合物Ｉの不斉加水分解を行う場合には、生成する
光学活性な親水性化合物（Ｒ）−IIを含む水層と光学活
性な疎水性化合物（Ｓ）−Ｉを吸着している固定化酵素
或いは固定化微生物とを濾過もしくはゆるやかに遠心す
ることによって分離し、さらに低極性溶媒で固定化酵素
或いは固定化微生物を洗浄することによって化合物
（Ｓ）−Ｉを得ることができ、固定化酵素或いは固定化
微生物は再び反応に用いることができる。
ミ体化合物Ｉの不斉加水分解を行う場合には、生成する
光学活性な親水性化合物（Ｒ）−IIを含む水層と光学活
性な疎水性化合物（Ｓ）−Ｉを吸着している固定化酵素
或いは固定化微生物とを濾過もしくはゆるやかに遠心す
ることによって分離し、さらに低極性溶媒で固定化酵素
或いは固定化微生物を洗浄することによって化合物
（Ｓ）−Ｉを得ることができ、固定化酵素或いは固定化
微生物は再び反応に用いることができる。
本発明において疎水性の化合物（Ｓ）−Ｉを溶出するの
に用いる低極性溶媒は、固定化酵素の場合、担体に吸着
している酵素を脱着しない溶媒であって、かつ親水性化
合物（Ｒ）−IIは殆んど溶解せず、一方疎水性の化合物
（Ｓ）−Ｉはよく溶解する溶媒が望ましい。そのような
溶媒としては、例えばベンゼン、トルエン、キシレンの
ような芳香族炭化水素溶媒，ｎ−ヘキサン，ｎ−ヘプタ
ン，ｎ−オクタンのような脂肪族炭化水素溶媒，シクロ
ペンタン，シクロヘキサン，シクロヘプタンのような脂
環式炭化水素溶媒又はこれらの混合溶媒が好適な溶媒と
して挙げられる。固定化微生物の場合にもまったく同様
の溶媒を用いることができる。
に用いる低極性溶媒は、固定化酵素の場合、担体に吸着
している酵素を脱着しない溶媒であって、かつ親水性化
合物（Ｒ）−IIは殆んど溶解せず、一方疎水性の化合物
（Ｓ）−Ｉはよく溶解する溶媒が望ましい。そのような
溶媒としては、例えばベンゼン、トルエン、キシレンの
ような芳香族炭化水素溶媒，ｎ−ヘキサン，ｎ−ヘプタ
ン，ｎ−オクタンのような脂肪族炭化水素溶媒，シクロ
ペンタン，シクロヘキサン，シクロヘプタンのような脂
環式炭化水素溶媒又はこれらの混合溶媒が好適な溶媒と
して挙げられる。固定化微生物の場合にもまったく同様
の溶媒を用いることができる。
固定化酵素、あるいは固定化微生物を用いた反応液から
のインドリン−２−カルボン酸、及びインドリン−２−
カルボン酸エステル精製、採取は以下のようにすればよ
い。光学活性インドリン−２−カルボン酸（Ｒ）−IIを
含む緩衝液画分を硫安で飽和後、ｐＨを5.0付近に調整
し、（Ｒ）−IIを酢酸エチル、塩化メチレン等の有機溶
媒で抽出することにより高純度の光学活性化合物（Ｒ）
−IIを得ることができる。必要に応じて、さらにアセト
ン等の有機溶媒中で晶析してもよい。
のインドリン−２−カルボン酸、及びインドリン−２−
カルボン酸エステル精製、採取は以下のようにすればよ
い。光学活性インドリン−２−カルボン酸（Ｒ）−IIを
含む緩衝液画分を硫安で飽和後、ｐＨを5.0付近に調整
し、（Ｒ）−IIを酢酸エチル、塩化メチレン等の有機溶
媒で抽出することにより高純度の光学活性化合物（Ｒ）
−IIを得ることができる。必要に応じて、さらにアセト
ン等の有機溶媒中で晶析してもよい。
疎水性溶媒中に回収された光学活性インドリン−２−カ
ルボン酸エステルは、そのまま濃縮すれば高光学純度の
エステル体で得られるが、更に次のようにして光学活性
インドリン−２−カルボン酸とすることができる。即
ち、光学活性インドリン−２−カルボン酸エステル
（Ｓ）−Ｉを室温下、ｐＨ１０〜13.5の範囲で２〜５時
間アルカリ加水分解を行えば、（Ｓ）−IIが生成する。
また、（Ｓ）−Ｉを加水分解する能力を有する酵素、例
えばリポプロテイン リパーゼアマノ３を作用させて加
水分解を行えば、（Ｓ）−IIを得ることができる。
ルボン酸エステルは、そのまま濃縮すれば高光学純度の
エステル体で得られるが、更に次のようにして光学活性
インドリン−２−カルボン酸とすることができる。即
ち、光学活性インドリン−２−カルボン酸エステル
（Ｓ）−Ｉを室温下、ｐＨ１０〜13.5の範囲で２〜５時
間アルカリ加水分解を行えば、（Ｓ）−IIが生成する。
また、（Ｓ）−Ｉを加水分解する能力を有する酵素、例
えばリポプロテイン リパーゼアマノ３を作用させて加
水分解を行えば、（Ｓ）−IIを得ることができる。
このようにして得られた加水分解液は、ｐＨを４〜６、
好ましくは5.0付近に調整後、塩化メチレン、酢酸エチ
ル等の有機溶媒で抽出し、濃縮後、アセトン等の有機溶
媒中で晶析することにより高光学純度の（Ｓ）−IIを得
ることができる。
好ましくは5.0付近に調整後、塩化メチレン、酢酸エチ
ル等の有機溶媒で抽出し、濃縮後、アセトン等の有機溶
媒中で晶析することにより高光学純度の（Ｓ）−IIを得
ることができる。
（実施例） 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれらの実施例に限定されるものではない。
明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１ （Ｒ．Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸アミルの製造 （Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｒ，Ｓ）−
II ５０ｇをアミルアルコール５００mlに溶解し、更に
濃塩酸１００mlを添加し、９５〜１００℃の範囲で３時
間、縮合反応を行った。反応後、一旦冷却してから１０
％苛性ソーダ液でｐＨを7.0に調整した。更に過剰量の
アミルアルコール及び水を減圧濃縮操作により除去し
た。濃縮液中には、目的物の（Ｒ，Ｓ）−インドリン−
２−カルボン酸アミル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ及び無機塩が含
まれている。この濃縮液に酢酸エチル１を加え、飽和
重炭酸ソーダ水２００mlで２回（計４００ml）洗浄後、
酢酸エチル層を濃縮したところ（Ｒ，Ｓ）−Ｉａが60.8
ｇ、８５％の収率で得られた。
II ５０ｇをアミルアルコール５００mlに溶解し、更に
濃塩酸１００mlを添加し、９５〜１００℃の範囲で３時
間、縮合反応を行った。反応後、一旦冷却してから１０
％苛性ソーダ液でｐＨを7.0に調整した。更に過剰量の
アミルアルコール及び水を減圧濃縮操作により除去し
た。濃縮液中には、目的物の（Ｒ，Ｓ）−インドリン−
２−カルボン酸アミル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ及び無機塩が含
まれている。この濃縮液に酢酸エチル１を加え、飽和
重炭酸ソーダ水２００mlで２回（計４００ml）洗浄後、
酢酸エチル層を濃縮したところ（Ｒ，Ｓ）−Ｉａが60.8
ｇ、８５％の収率で得られた。
実施例１ （Ｒ）−選択的エステラーゼ活性を有するリパーゼ（ス
テアプシン）（和光純薬(株)製）１０ｇをｐＨ7.0の0.1
Ｍリン酸緩衝液１００mlに加えて混和し、濾過によって
不溶物を除いた。濾液にローム・アンド・ハース社製メ
タクリレート系多孔質吸着剤アンバーライトＸＡＤ−７
をメタノールと水で洗浄後、湿重量６０ｇ（含水率７１
％）を加え、低温室（４℃）で一夜ゆっくり撹拌し、酵
素を吸着固定化した。固定化酵素懸濁液をグラスフイル
ターを用いて吸引濾過し、さらにｐＨ7.0の0.1Ｍリン酸
緩衝液１００mlで３回回洗浄後、吸引濾過して湿潤固定
化酵素を得た。この固定化リパーゼを内径2.2cmのカラ
ムに高さ１５cmに充填し、３３℃に保温してラセミ体の
インドリン−２−カルボン酸アミル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ
５ｇを負荷し、ｐＨ7.0の0.1Ｍリン酸緩衝液を毎時６ml
の流速で流して反応させた。カラムからの溶出液を１２
mlずつフラクションコレクターで分取し、液体クロマト
グラフィーで分析した。このリン酸緩衝液画分には、不
斉加水分解され生成した親水的なインドリン−２−カル
ボン酸のみが含まれていた。該リン酸緩衝液の画分１８
０mlに飽和になるまで硫酸アンモニウムを加え、更にｐ
Ｈを5.0に調整した。次に等量の酢酸エチルを加え、３
回該インドリン−２−カルボン酸を抽出し、脱水後、減
圧濃縮し、乾固物をアセトン−ヘキサン（５ml−１ml）
で再結した。真空で乾燥後、比旋光度〔α〕25 D−32.5
゜〔ｃ1.0、ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦＡとい
う）〕（文献値、D.H.Kim et al,J.Med.Chem.,26,394(1
983)，〔α〕25 D＋34.5゜（ｃ＝0.91，ＤＭＦＡ）〕を
有する白色の粉末（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸
（Ｒ）−IIが1.26ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−Ｉａよりの収率７２
％〕得られた。リン酸緩衝液を１８０ml流した時点で、
リン酸緩衝液にかえてヘキサンを毎分1.0mlの流速で流
し、カラム内の固定化酵素の担体に吸着していた末反応
の疎水的なインドリン−２−カルボン酸アミルを溶出し
た。カラムからの溶出ヘキサン溶液を１０mlずつフラク
ションコレクターで分取し、インドリン−２−カルボン
酸アミルを含む画分９０mlを濃縮し、比旋光度〔α〕25
D＋5.6゜（ｃ＝1.0，エタノール）を有するシロップ
（Ｓ）−Ｉａが2.38g〔（Ｒ，Ｓ）−Ｉａからの収率９
５％〕得られた。得られた（Ｓ）−Ｉａ 2.38に１Ｎ苛
性ソーダ１５ml加え、室温下約３時間加水分解を行い、
反応液を１Ｎ塩酸でｐＨ5.0に調製後、酢酸エチル１５m
lで４回抽出操作を行った。無水硫酸ソーダで脱水処理
後、減圧濃縮し、乾固物をアセトン−ヘキサン（５ml−
１ml）で再結すると比旋光度〔α〕25 D＋33.9゜（ｃ＝
1.0，ＤＭＦＡ）を有する白色の粉末（Ｓ）−インドリ
ン−２−カルボン酸（Ｓ）−IIが1.23ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−
Ｉａよりの収率７０％〕得られた。なお、上記リン酸緩
衝液およびヘキサンによる溶出において酵素の脱着は認
められなかった。
テアプシン）（和光純薬(株)製）１０ｇをｐＨ7.0の0.1
Ｍリン酸緩衝液１００mlに加えて混和し、濾過によって
不溶物を除いた。濾液にローム・アンド・ハース社製メ
タクリレート系多孔質吸着剤アンバーライトＸＡＤ−７
をメタノールと水で洗浄後、湿重量６０ｇ（含水率７１
％）を加え、低温室（４℃）で一夜ゆっくり撹拌し、酵
素を吸着固定化した。固定化酵素懸濁液をグラスフイル
ターを用いて吸引濾過し、さらにｐＨ7.0の0.1Ｍリン酸
緩衝液１００mlで３回回洗浄後、吸引濾過して湿潤固定
化酵素を得た。この固定化リパーゼを内径2.2cmのカラ
ムに高さ１５cmに充填し、３３℃に保温してラセミ体の
インドリン−２−カルボン酸アミル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ
５ｇを負荷し、ｐＨ7.0の0.1Ｍリン酸緩衝液を毎時６ml
の流速で流して反応させた。カラムからの溶出液を１２
mlずつフラクションコレクターで分取し、液体クロマト
グラフィーで分析した。このリン酸緩衝液画分には、不
斉加水分解され生成した親水的なインドリン−２−カル
ボン酸のみが含まれていた。該リン酸緩衝液の画分１８
０mlに飽和になるまで硫酸アンモニウムを加え、更にｐ
Ｈを5.0に調整した。次に等量の酢酸エチルを加え、３
回該インドリン−２−カルボン酸を抽出し、脱水後、減
圧濃縮し、乾固物をアセトン−ヘキサン（５ml−１ml）
で再結した。真空で乾燥後、比旋光度〔α〕25 D−32.5
゜〔ｃ1.0、ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦＡとい
う）〕（文献値、D.H.Kim et al,J.Med.Chem.,26,394(1
983)，〔α〕25 D＋34.5゜（ｃ＝0.91，ＤＭＦＡ）〕を
有する白色の粉末（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸
（Ｒ）−IIが1.26ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−Ｉａよりの収率７２
％〕得られた。リン酸緩衝液を１８０ml流した時点で、
リン酸緩衝液にかえてヘキサンを毎分1.0mlの流速で流
し、カラム内の固定化酵素の担体に吸着していた末反応
の疎水的なインドリン−２−カルボン酸アミルを溶出し
た。カラムからの溶出ヘキサン溶液を１０mlずつフラク
ションコレクターで分取し、インドリン−２−カルボン
酸アミルを含む画分９０mlを濃縮し、比旋光度〔α〕25
D＋5.6゜（ｃ＝1.0，エタノール）を有するシロップ
（Ｓ）−Ｉａが2.38g〔（Ｒ，Ｓ）−Ｉａからの収率９
５％〕得られた。得られた（Ｓ）−Ｉａ 2.38に１Ｎ苛
性ソーダ１５ml加え、室温下約３時間加水分解を行い、
反応液を１Ｎ塩酸でｐＨ5.0に調製後、酢酸エチル１５m
lで４回抽出操作を行った。無水硫酸ソーダで脱水処理
後、減圧濃縮し、乾固物をアセトン−ヘキサン（５ml−
１ml）で再結すると比旋光度〔α〕25 D＋33.9゜（ｃ＝
1.0，ＤＭＦＡ）を有する白色の粉末（Ｓ）−インドリ
ン−２−カルボン酸（Ｓ）−IIが1.23ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−
Ｉａよりの収率７０％〕得られた。なお、上記リン酸緩
衝液およびヘキサンによる溶出において酵素の脱着は認
められなかった。
実施例２ 実施例１において使用した固定化ステアプシン充填カラ
ムにｐＨ7.0の0.1Ｍリン酸緩衝液５０mlを流してから実
施例１と同様にしてラセミ体のインドリン−２−カルボ
ン酸アミル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ ５ｇを負荷し、リン酸緩
衝液による反応および生成するカルボン酸の溶出ならび
にヘキサンによる未反応エステルの溶出を行った。さら
にこの一連の反応、溶出操作を２０回くり返し連続して
行い、毎回リン酸緩衝液画分とヘキサン溶出画分とを実
施例１と同様の操作で処理した。その結果、各回のリン
酸緩衝液画分から、比旋光度〔α〕25 D−31.9゜（ｃ＝
1.0，ＤＭＦＡ）から〔α〕25 D−33.1゜（ｃ＝1.0，Ｄ
ＭＦＡ）を有する（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸
（Ｒ）−IIを1.21ｇ〜1.27ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−Ｉａよりの
収率６９％〜７３％〕の範囲で得た。また各回のヘキサ
ン溶出画分から比旋光度〔α〕25 D＋32.2゜（ｃ＝1.0，
ＤＭＦＡ）から〔α〕25 D＋34.1゜（ｃ＝1.0，ＤＭＦ
Ａ）を有する（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸
（Ｓ）−IIを1.18ｇ〜1.24ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−Iaからの収
率６８％〜７１％〕の範囲で得た。
ムにｐＨ7.0の0.1Ｍリン酸緩衝液５０mlを流してから実
施例１と同様にしてラセミ体のインドリン−２−カルボ
ン酸アミル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ ５ｇを負荷し、リン酸緩
衝液による反応および生成するカルボン酸の溶出ならび
にヘキサンによる未反応エステルの溶出を行った。さら
にこの一連の反応、溶出操作を２０回くり返し連続して
行い、毎回リン酸緩衝液画分とヘキサン溶出画分とを実
施例１と同様の操作で処理した。その結果、各回のリン
酸緩衝液画分から、比旋光度〔α〕25 D−31.9゜（ｃ＝
1.0，ＤＭＦＡ）から〔α〕25 D−33.1゜（ｃ＝1.0，Ｄ
ＭＦＡ）を有する（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸
（Ｒ）−IIを1.21ｇ〜1.27ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−Ｉａよりの
収率６９％〜７３％〕の範囲で得た。また各回のヘキサ
ン溶出画分から比旋光度〔α〕25 D＋32.2゜（ｃ＝1.0，
ＤＭＦＡ）から〔α〕25 D＋34.1゜（ｃ＝1.0，ＤＭＦ
Ａ）を有する（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸
（Ｓ）−IIを1.18ｇ〜1.24ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−Iaからの収
率６８％〜７１％〕の範囲で得た。
実施例３〜５ 実施例１において、酵素及び基質のエステルを変えて実
施例１と同様の操作を行い、表１の結果を得た。基質の
負荷量はすべて５ｇである。
施例１と同様の操作を行い、表１の結果を得た。基質の
負荷量はすべて５ｇである。
実施例６ 実施例１において、アンバーライトＸＡＤ−７のかわり
に三菱化成工業(株)製の合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ
２ＭＧを用い、操作は実施例１と同様にして固定化リパ
ーゼ（ステアプシン）を調製した。この固定化リパーゼ
を内径2.2cmのカラムに高さ１５cmに充填し、インドリ
ン−２−カルボン酸アミル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ ５ｇを負
荷し、以下実施例１と同様の操作を行い、不斉加水分解
と生成物の分離を行った。その結果、リン酸緩衝液画分
から比旋光度〔α〕25 D−32.7゜（ｃ＝1.0，ＤＭＦＡ）
を有する（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｒ）−
II 1.25ｇを得た。またヘキサン溶出画分からは比旋光
度〔α〕25 D＋33.5゜（ｃ＝1.0，ＤＭＦＡ）を有する
（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−II 1.17
ｇ得た。
に三菱化成工業(株)製の合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ
２ＭＧを用い、操作は実施例１と同様にして固定化リパ
ーゼ（ステアプシン）を調製した。この固定化リパーゼ
を内径2.2cmのカラムに高さ１５cmに充填し、インドリ
ン−２−カルボン酸アミル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ ５ｇを負
荷し、以下実施例１と同様の操作を行い、不斉加水分解
と生成物の分離を行った。その結果、リン酸緩衝液画分
から比旋光度〔α〕25 D−32.7゜（ｃ＝1.0，ＤＭＦＡ）
を有する（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｒ）−
II 1.25ｇを得た。またヘキサン溶出画分からは比旋光
度〔α〕25 D＋33.5゜（ｃ＝1.0，ＤＭＦＡ）を有する
（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−II 1.17
ｇ得た。
参考例２ 下記の組成からなる栄養液体培地を調製し、２坂口フ
ラスコに４００mlずつ分注後、１２０℃、１５分殺菌し
た。
ラスコに４００mlずつ分注後、１２０℃、１５分殺菌し
た。
グルコース４％、イーストエキス0.3％、肉エキス0.3
％、ペプトン0.3％、リン酸二アンモニウム0.2％、リン
酸−カリウム0.1％（ｐＨ6.8） これとは別に同じ組成の培地にて前培地をしたシュード
モナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa)IFO 3
080の種菌液１０mlを前培養培地に接種し、３０℃、２
４時間振とうを行った。合計５本培養し、培養液計２
を得た。この培溶液を遠心し、菌体を集めた。この湿菌
体２０ｇを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）４０mlに
懸濁し、それにウリタンプレポリマーＰＵ−３（東洋ゴ
ム工業(株)製）２０ｇを加え、４０℃にてすばやく撹拌
後４℃に冷却し、３０分間放置した。こうして得られた
固定化微生物を約２mm角に切断し、内径2.2cmのカラム
に高さ１５cmに充填し、３３℃に保温してｐＨ7.0の0.1
Ｍリン酸緩衝液を５０ml流してから基質インドリン−２
−カルボン酸アミル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ ４ｇを負荷し
た。ｐＨ7.0の0.1Ｍリン酸緩衝液を毎時４mlの流速で流
し不斉加水分解反応を行わせ、カラムからの溶出液を１
２mlずつフラクションコレクターで分取し、液体クロマ
トグラフィーで分析した。このリン酸緩衝液画分には不
斉加水分解され生成した親水的なインドリン−２−カル
ボン酸のみが含まれていた。このリン酸緩衝液の画分１
８０mlに飽和になるまで硫酸アンモニウムを加え、更に
ｐＨを5.0に調整し、等量の酢酸エチルで３回該インド
リン−２−カルボン酸を抽出した。酢エチ層を分離し、
脱水後、減圧濃縮し、乾固物をアセトン−ヘキサン（５
ml−１ml）で再結した。真空で乾燥後、比旋光度〔α〕
25 D＋23.7゜（ｃ＝1.0，ＤＭＦＡ）を有する（Ｓ）−イ
ンドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−IIが0.89ｇ得られ
た。
％、ペプトン0.3％、リン酸二アンモニウム0.2％、リン
酸−カリウム0.1％（ｐＨ6.8） これとは別に同じ組成の培地にて前培地をしたシュード
モナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa)IFO 3
080の種菌液１０mlを前培養培地に接種し、３０℃、２
４時間振とうを行った。合計５本培養し、培養液計２
を得た。この培溶液を遠心し、菌体を集めた。この湿菌
体２０ｇを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）４０mlに
懸濁し、それにウリタンプレポリマーＰＵ−３（東洋ゴ
ム工業(株)製）２０ｇを加え、４０℃にてすばやく撹拌
後４℃に冷却し、３０分間放置した。こうして得られた
固定化微生物を約２mm角に切断し、内径2.2cmのカラム
に高さ１５cmに充填し、３３℃に保温してｐＨ7.0の0.1
Ｍリン酸緩衝液を５０ml流してから基質インドリン−２
−カルボン酸アミル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ ４ｇを負荷し
た。ｐＨ7.0の0.1Ｍリン酸緩衝液を毎時４mlの流速で流
し不斉加水分解反応を行わせ、カラムからの溶出液を１
２mlずつフラクションコレクターで分取し、液体クロマ
トグラフィーで分析した。このリン酸緩衝液画分には不
斉加水分解され生成した親水的なインドリン−２−カル
ボン酸のみが含まれていた。このリン酸緩衝液の画分１
８０mlに飽和になるまで硫酸アンモニウムを加え、更に
ｐＨを5.0に調整し、等量の酢酸エチルで３回該インド
リン−２−カルボン酸を抽出した。酢エチ層を分離し、
脱水後、減圧濃縮し、乾固物をアセトン−ヘキサン（５
ml−１ml）で再結した。真空で乾燥後、比旋光度〔α〕
25 D＋23.7゜（ｃ＝1.0，ＤＭＦＡ）を有する（Ｓ）−イ
ンドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−IIが0.89ｇ得られ
た。
リン酸緩衝液を１８０ml流した時点で、リン酸緩衝液に
変えてヘキサンを毎分1.0mlの流速で流し、カラム内の
固定化微生物の担体に吸着していたインドリン−２−カ
ルボン酸アミルを溶出した。ヘキサン溶液を１０mlずつ
フラクションコレクターで分取し、インドリン−２−カ
ルボン酸アミルを含む画分８０mlを濃縮し、比旋光度
〔α〕25 D−3.9゜（ｃ＝1.0，エタノール）を有するシ
ロップ（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸アミル
（Ｒ）−Ｉａが1.15ｇ得られた。
変えてヘキサンを毎分1.0mlの流速で流し、カラム内の
固定化微生物の担体に吸着していたインドリン−２−カ
ルボン酸アミルを溶出した。ヘキサン溶液を１０mlずつ
フラクションコレクターで分取し、インドリン−２−カ
ルボン酸アミルを含む画分８０mlを濃縮し、比旋光度
〔α〕25 D−3.9゜（ｃ＝1.0，エタノール）を有するシ
ロップ（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸アミル
（Ｒ）−Ｉａが1.15ｇ得られた。
得られた（Ｒ）−Ｉａ 1.15ｇに１Ｎ苛性ソーダ１０ml
を加え、室温下約３時間加水分解を行い、反応液を１Ｎ
塩酸でｐＨ5.0に調整後、酢酸エチル１０mlで４回抽出
操作を行った。脱水処理後、減圧濃縮し、乾固物をアセ
トン−ヘキサン（2.5ml−0.5ml）で再結すると比旋光度
〔α〕25 D−21.7゜（ｃ＝1.0，ＤＭＦＡ）を有する
（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｒ）−IIが0.58
ｇ得られた。
を加え、室温下約３時間加水分解を行い、反応液を１Ｎ
塩酸でｐＨ5.0に調整後、酢酸エチル１０mlで４回抽出
操作を行った。脱水処理後、減圧濃縮し、乾固物をアセ
トン−ヘキサン（2.5ml−0.5ml）で再結すると比旋光度
〔α〕25 D−21.7゜（ｃ＝1.0，ＤＭＦＡ）を有する
（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｒ）−IIが0.58
ｇ得られた。
実施例７，８ 菌株を変えて、参考例２と同様の操作により、固定化、
不斉加水分解と分離、生成物の分析を行い、表２に示す
結果を得た。基質は（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ４ｇ負荷した。
不斉加水分解と分離、生成物の分析を行い、表２に示す
結果を得た。基質は（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ４ｇ負荷した。
（発明の効果） 本発明によれば、基質インドリン−２−カルボン酸エス
テルの加水分解と、生成物インドリン−２−カルボン酸
の分離、回収とを同時に行うことができる。
テルの加水分解と、生成物インドリン−２−カルボン酸
の分離、回収とを同時に行うことができる。
Claims (8)
- 【請求項１】一般式Ｉ （式中、ＲはＣ２〜Ｃ８の脂肪族炭化水素基を表わす） で表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸
エステルと、疎水性の担体に固定化された立体選択的エ
ステラーゼ活性を有するバチルス（Bacillus）属もしく
はアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物又
は哺乳動物臓器由来の酵素を用いた固定化酵素もしくは
バチルス（Bacillus）属に属する微生物を用いた固定化
微生物とを接触、反応させて、構造式（Ｒ）−II で表わされる光学活性（Ｒ）−インドリン−２−カルボ
ン酸と、構造式（Ｓ）−Ｉ （Ｒは前記と同じ） で表わされる光学活性（Ｓ）−インドリン−２−カルボ
ン酸エステルとに不斉加水分解し、親水性のインドリン
−２−カルボン酸（Ｒ）−IIを水または緩衝液で回収、
採取後、固定化用担体に吸着、保持されているインドリ
ン−２−カルボン酸エステル（Ｓ）−Ｉを低極性有機溶
剤で溶出、採取することを特徴とする光学活性インドリ
ン−２−カルボン酸の製造方法。 - 【請求項２】不斉加水分解をカラムに充填した固定化酵
素もしくは固定化微生物で行う特許請求の範囲第１項記
載の製造方法。 - 【請求項３】不斉加水分解を回分式で行う特許請求の範
囲第１項記載の製造方法。 - 【請求項４】疎水性を持つ酵素或いは微生物の固定化用
担体が、合成吸着剤、疎水クロマトグラフィー用樹脂、
疎水性光架橋性樹脂又は疎水基を化学結合させて導入し
た高分子物質である特許請求の範囲第１項乃至第３項の
いずれかの項記載の製造方法。 - 【請求項５】一般式Ｉ （式中、ＲはＣ２〜Ｃ８の脂肪族炭化水素基を表わす） で表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸
エステルと、疎水性の担体に固定化された立体選択的エ
ステラーゼ活性を有するバチルス（Bacillus）属もしく
はアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物又
は哺乳動物臓器由来の酵素を用いた固定化酵素もしくは
バチルス（Bacillus）属に属する微生物を用いた固定化
微生物とを接触、反応させて、構造式（Ｒ）−II で表わされる光学活性（Ｒ）−インドリン−２−カルボ
ン酸と、構造式（Ｓ）−Ｉ （Ｒは前記と同じ） で表わされる光学活性（Ｓ）−インドリン−２−カルボ
ン酸エステルとに不斉加水分解し、親水性のインドリン
−２−カルボン酸（Ｒ）−IIを水または緩衝液で回収、
採取後、固定化用担体に吸着、保持されているインドリ
ン−２−カルボン酸エステル（Ｓ）−Ｉを低極性有機溶
剤で溶出、採取し、更に（Ｓ）−Ｉを加水分解して構造
式（Ｒ）−IIの対掌体である光学活性インドリン−２−
カルボン酸エステル（Ｓ）−IIを生成させ、採取するこ
とを特徴とする光学活性インドリン−２−カルボン酸の
製造方法。 - 【請求項６】不斉加水分解をカラムに充填した固定化酵
素もしくは固定化微生物で行う特許請求の範囲第５項記
載の製造方法。 - 【請求項７】不斉加水分解を回分式で行う特許請求の範
囲第５項記載の製造方法。 - 【請求項８】疎水性を持つ酵素或いは微生物の固定化用
担体が、合成吸着剤、疎水クロマトグラフィー用樹脂、
疎水性光架橋性樹脂又は疎水基を化学結合させて導入し
た高分子物質である特許請求の範囲第５項乃至第７項の
いずれかの項記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59214725A JPH0616718B2 (ja) | 1984-10-13 | 1984-10-13 | 固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59214725A JPH0616718B2 (ja) | 1984-10-13 | 1984-10-13 | 固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13953593A Division JPH0779712B2 (ja) | 1993-05-17 | 1993-05-17 | 固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6192596A JPS6192596A (ja) | 1986-05-10 |
| JPH0616718B2 true JPH0616718B2 (ja) | 1994-03-09 |
Family
ID=16660585
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59214725A Expired - Lifetime JPH0616718B2 (ja) | 1984-10-13 | 1984-10-13 | 固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0616718B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005051910A1 (en) * | 2003-11-26 | 2005-06-09 | Sk Corporation | Method for preparing (s)-indoline-2-carboxylic acid and (s)-indoline-2-carboxylic acid methyl ester using hydrolytic enzyme |
Families Citing this family (3)
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|---|---|---|---|---|
| EP0197474B1 (en) * | 1985-04-01 | 1991-07-10 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for preparing optically active indoline-2-carboxylic acid |
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| CN109762768B (zh) * | 2019-02-21 | 2020-08-21 | 浙江工业大学 | 芽孢杆菌b8w22及其应用 |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JPS5781460A (en) * | 1980-11-10 | 1982-05-21 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | Novel indolinecarboxylic acid derivative |
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-
1984
- 1984-10-13 JP JP59214725A patent/JPH0616718B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JPS5781460A (en) * | 1980-11-10 | 1982-05-21 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | Novel indolinecarboxylic acid derivative |
| JPS6192595A (ja) * | 1984-10-09 | 1986-05-10 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 光学分割によるインドリン−２−カルボン酸の製造方法 |
Cited By (1)
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| WO2005051910A1 (en) * | 2003-11-26 | 2005-06-09 | Sk Corporation | Method for preparing (s)-indoline-2-carboxylic acid and (s)-indoline-2-carboxylic acid methyl ester using hydrolytic enzyme |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6192596A (ja) | 1986-05-10 |
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