CN109762768B - 芽孢杆菌b8w22及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芽孢杆菌B8W22及应用，所述的应用为：以芽孢杆菌B8W22经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以外消旋(R,S)‑吲哚啉‑2‑甲酸乙酯为底物，以pH值7.0～8.5的磷酸盐缓冲液为反应介质，在25～40℃，150‑200rpm条件下进行拆分制备(S)‑吲哚啉‑2‑甲酸。本发明提供的产酶微生物菌株‑芽孢杆菌B8W22的立体选择性强，产物对映体过量值≧93.7％，转化率达到45.4％以上，能耗低，环境污染小，适合工业化生产。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种新菌株—芽孢杆菌B8W22及其在立体拆分(R,S)吲哚啉-2-甲酸乙酯反应生成光学纯(S)吲哚啉-2-甲酸中的应用。
(二)背景技术
(S)吲哚啉-2-甲酸及其某些化合物是目前实验及临床阶段的许多新药中间体。如法国Servier公司发明的心血管治疗药培哚普利，用于治疗原发性高血压与心力衰竭，作用时间长，副作用小，耐受性好，市场前景良好。这些具有心血管疾病治疗功效的活性组中，普遍含有(S)吲哚啉-2-甲酸或其加氢产物的特征结构。
目前，文献报道的合成(S)吲哚啉-2-甲酸主要是用具有旋光性的起始原料合成、手性助剂合成法、化学试剂拆分法。如浙江大学的钱超以L-苯丙氨酸为“手性源”，经硝化、溴化、分子内环合制备得到了6-硝基-(S)-吲哚啉-2-甲酸，该产物可通过硝基还原、重氮化和去重氮基反应制备得到(S)吲哚啉-2-甲酸。
其路线如下：
Vincent等以吲哚-2-甲酸为原料，经酯化、锡/氯化氢还原得外消旋吲哚啉-2-甲酸乙酯，再用(R)-α-苯乙胺为拆分试剂对其进行拆分，得到(S)吲哚啉-2-甲酸。化学合成或拆分法均存在步骤繁多，污染严重或者拆分试剂价格昂贵的缺点。采用酶法制备是趋势，具有成本低，低排放的优势。
De Vries等的专利报道了以邻卤(氯或溴)苯甲醛为原料，与醋酐缩合，所得的肉桂酸衍生物用苯丙氨酸氨解酶(从Rhodosporidium toruloides ATCC 10788中获得)氨解得到光学纯的邻卤-L-苯丙氨酸，然后再经环合反应得到光学纯的(S)吲哚啉-2-甲酸。
韩国SK公司专利报道使用外消旋的吲哚啉-2-甲酸甲酯作为底物，以商品化的Savinase作为催化剂水解，特异性水解(R)吲哚啉-2-甲酸甲酯，再将不水解的(S)吲哚啉-2-甲酸甲酯进一步水解，得到(S)吲哚啉-2-甲酸e.e.值达99％，收率47％。
本发明所述的微生物酶法反应主要克服已有方法无法一步催化生成(S)吲哚啉-2-甲酸的缺点，筛选得到的水解酶特异性水解(S)吲哚啉-2-甲酸乙酯。
(三)发明内容
本发明目的是为了解决上述方法的不足，通过筛选产脂肪酶微生物，提供了一种廉价高效的产酶微生物，以外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯为反应底物，立体选择性水解S型制备(S)-吲哚啉-2-甲酸。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株菌株—芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B8W22，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2017751，保藏日期2017年11月30日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明还提供一种所述芽孢杆菌B8W22在拆分外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯制备(S)-吲哚啉-2-甲酸中的应用，具体所述的应用为：以芽孢杆菌B8W22经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯为底物，以pH 7.0的磷酸盐缓冲液为反应介质，在25-40℃，150-200rpm(优选30℃、180-200rpm)条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)-吲哚啉-2-甲酸。所述底物加入终浓度为1～50g/L缓冲液(优选5～15g/L)，催化剂加入量以湿菌体计为5～20g/L缓冲液(优选10～15g/L)，以干菌体重量计为1～3g/L缓冲液。
本发明所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将芽孢杆菌B8W22接种至斜面培养基，在30℃培养1天，获得斜面菌体；斜面培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，质量浓度2％琼脂，溶剂为去离子水，pH 7.0；
(2)种子培养：取斜面菌体接种于种子培养基，在30℃、150r/min条件下培养24h，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0；
(3)发酵培养：在无菌条件下，取种子液以体积浓度2％的接种量接种于产酶培养基中，在30℃、150r/min条件下培养24h，获得发酵液，取发酵液在12000rpm离心15min，弃上清液，收集湿菌体；产酶培养基组成为：葡萄糖15g/L，牛肉膏20g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，(NH4)2SO4 5g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；
(4)干菌体的制备：取湿菌体在-40℃条件下冻干2天，得到干菌体。
本发明所述分离纯化的方法为：转化反应结束后，反应液用正己烷萃取未完全反应的底物，充分振荡，12000rpm离心15min，取下层水相加NaOH至pH 10.0，充分振荡，12000rpm离心15min，取上清，用盐酸(优选4M的盐酸)调节至2.0后，减压过滤，获得滤液和滤渣，滤渣为产品(S)-吲哚啉-2-甲酸。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供的产酶微生物菌株-芽孢杆菌B8W22的立体选择性强，产物对映体过量值≧93.7％，转化率达到45.4％以上，下游分离简单，产率较高，能耗低，环境污染小，适合工业化生产。
(四)附图说明
图1为外消旋的吲哚啉-2-甲酸乙酯和吲哚啉-2甲酸液相色谱图。
图2为微生物催化外消旋底物吲哚啉-2-甲酸乙酯制备(S)吲哚啉-2-甲酸的液相色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
1、菌株的分离纯化
称取从浙江省杭州市浙江大学华家池校区试验田土壤中取得的湿土样1g混悬于10mL无菌生理盐水中，振荡混匀；接3mL悬液于50mL含10mmol/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的液体富集培养基中，在30℃、180r/min下培养5～7d后，无菌操作转接1mL浑浊的菌液到新鲜的含10mmol/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的液体富集培养基，连续富集3～4次。将富集后菌液经梯度稀释，涂布含10mmol/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的分离平板培养基，多次分离，获取单菌落。
富集培养基配方如下：NaNO3 3.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH 7.0，溶剂为去离子水。分离平板培养基组成为：富集培养基加入琼脂20g/L。
挑取分离得到的单菌落接种于斜面培养基，30℃培养1天，获得斜面菌体。挑取斜面菌体接种至50mL种子培养基，在30℃、180r/min培养24h，在无菌条件下，取1mL种子液接种于50mL的产酶培养基中，30℃、180r/min培养24h，获得发酵液。种子培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；斜面培养基组成为在种子培养基中添加质量浓度2％琼脂。产酶培养基组成为：葡萄糖15g/L，牛肉膏20g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，(NH4)2SO4 5g/L，溶剂为去离子水，用NaOH调节pH至7.0，115℃灭菌30min。
取2mL发酵液于2mL离心管中，12000rpm离心3min，弃上清液，将0.05g湿菌体加入1mL、0.2mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液，振荡混匀，再加入终浓度25g/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯作为底物，在30℃、180r/min下，转化24h。取出离心管，向反应液中加入乙酸乙酯萃取，充分震荡，12000rpm离心3min。取上层有机相500μL旋蒸后，加入1mL的流动相溶解，用HPLC检测(S)-吲哚啉-2-甲酸的对映体过量值(e.e.)，筛选得到产物对映体过量值达到88％的微生物菌株，记为菌株B8W22。
液相色谱分析条件：采用液相色谱仪Waters 1525型液相色谱仪；手性液相色谱柱大赛璐AD-H；正己烷：异丙醇＝5：1(体积比)，流速1ml/min，柱压457psi，柱温30℃；进样量10μL。水解产物(S)吲哚啉-2-甲酸和(R)吲哚啉-2-甲酸分别在9.6min和14.5min出峰(如图1所示)。
2、菌株B8W22的鉴定
生理生化特征：菌株B8W22为革兰氏阳性菌，专性好氧。
经测序鉴定，菌株B8W22的16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示：
GGCTAGCTCCTTACGGTTACTCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTATGGGATTGGCTTGACCTCGCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAACGCTCTATCTCTAGAGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAAAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCGCTTTTCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACGAGCAGTTACTCTCGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGCCCATCTGTAAGTGATAGCCGAAACCATCTTTCAATCATCTCCCATGAAGGAGAAGATCCTATCCGGTATTAGCTTCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACGTCATAGAAGCAAGCTTCTAATCAGTTCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTGAGCCAGGaTTCAAAACTCTAA。
根据生理生化特性和分子生物学鉴定，该菌株B8W22被鉴定为芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)，命名为(Bacillus aryabhattai B8W22)，该菌种现保藏于中国典型培养物保藏中心(地址中国，武汉，武汉大学，430072)，保藏编号CCTCC NO:M 2017751，保藏日期2017年11月30日。
实施例2：
芽孢杆菌B8W22接种至斜面培养基，在30℃培养1天，获得斜面菌体。斜面培养基组成同实施例1。
取斜面菌体接种于50mL的种子培养基，在30℃、180r/min培24h，获得种子液。种子培养基组成同实施例1。
在无菌条件下，取500μL种子液接种于50mL的产酶培养基中，30℃、180r/min培养24h，获得发酵液。取20mL发酵液12000rpm离心3min，弃上清液，得到芽孢杆菌B8W22湿菌体，经酶活测定，该湿菌体比酶活力为10.47U/L。将湿菌体在-40℃条件下，冻干2天，得到干菌体。
酶活力定义：在规定的条件下，每分钟水解1μmol外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯所需脂肪酶的量，所述的规定条件为：取0.05g湿菌体，向湿菌体中加入含25g/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的磷酸缓冲溶液(0.2mol/L pH 7.0)1ml，在30℃、搅拌转速180rpm条件下反应24h后，加入乙酸乙酯，充分振荡，12000rpm离心3min。取上层有机相500μL旋蒸，然后加入1mL的流动相溶解。用HPLC检测底物(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯和产物(S)-吲哚啉-2-甲酸的对映体过量值(e.e.)。
实施例3：
取实施例2方法制备的芽孢杆菌B8W22干菌体0.001g，加入到含有终浓度25g/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的1mL pH7.0、0.2mol/L磷酸缓冲液中，30℃、180rpm条件下，反应3h后，用正己烷萃取未完全反应的底物，充分振荡，12000rpm离心15min，取下层水相加NaOH至pH 10.0，充分振荡，12000rpm离心15min，取上清，用4M盐酸调节至2.0后，减压过滤，获得滤液和滤渣，滤渣为产品(S)-吲哚啉-2-甲酸。采用实施例1方法检测产物(S)-吲哚啉-2-甲酸的生成情况，产物的对映体过量值e.e.p93.2％，产率为45.2％(如图2)。
实施例4：
取实施例2方法制备的芽孢杆菌B8W22干菌体0.002g，加入到含有终浓度为10g/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的1mLpH7.0、0.2mol/L磷酸缓冲液中，30℃、200rpm条件下，反应3h后，反应转化后的反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到(S)-吲哚啉-2-甲酸。采用实施例1方法检测(S)吲哚啉-2-甲酸的对映体过量值e.e.p 94.7％，产率45.1.％。
实施例5：
取实施例2方法制备的芽孢杆菌B8W22干菌体0.003g，加入到含有终浓度25g/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的1mL、pH7.0、0.2mol/L磷酸缓冲液中，30℃、200rpm条件下，反应3h后，反应转化后的反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到(S)-吲哚啉-2-甲酸。采用实施例1方法检测(S)-吲哚啉-2-甲酸的对映体过量值e.e.p 93.9％，产率45.2％。
实施例6：
取实施例2方法制备的芽孢杆菌B8W22湿菌体0.1g，加入到含有终浓度15g/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的20mL、pH7.0、0.2mol/L磷酸缓冲液中，30℃、200rpm条件下，反应3h后，反应转化后的反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到(S)-吲哚啉-2-甲酸。采用实施例1方法检测(S)-吲哚啉-2-甲酸的对映体过量值e.e.p 93.7％，产率45.4％。
实施例7：
取实施例2方法制备的芽孢杆菌B8W22湿菌体0.2g，加入到含有终浓度为20g/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的20mL、pH7.0、0.2mol/L磷酸缓冲液中，30℃、200rpm条件下，反应3h后，反应转化后的反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到(S)-吲哚啉-2-甲酸。采用实施例1方法检测(S)-吲哚啉-2-甲酸的对映体过量值e.e.p 93.7％，产率45.4％。
实施例8：
取实施例2方法制备的芽孢杆菌B8W22干菌体0.06g，加入到含有终浓度为30g/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的20mL、pH7.0、0.2mol/L磷酸缓冲液中，30℃、200rpm条件下，反应3h后，反应转化后的反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到(S)-吲哚啉-2-甲酸。采用实施例1方法检测(S)-吲哚啉-2-甲酸的对映体过量值e.e.p 94.1％，产率45.5％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 芽孢杆菌B8W22及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1470
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)
<400> 1
ggctagctcc ttacggttac tccaccgact tcgggtgtta caaactctcg tggtgtgacg 60
ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag 120
cgattccagc ttcatgtagg cgagttgcag cctacaatcc gaactgagaa tggttttatg 180
ggattggctt gacctcgcgg tcttgcagcc ctttgtacca tccattgtag cacgtgtgta 240
gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac 300
cggcagtcac cttagagtgc ccaactaaat gctggcaact aagatcaagg gttgcgctcg 360
ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc 420
actctgtccc ccgaagggga acgctctatc tctagagttg tcagaggatg tcaagacctg 480
gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc 540
gtcaattcct ttgagtttca gtcttgcgac cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt 600
tagctgcagc actaaagggc ggaaaccctc taacacttag cactcatcgt ttacggcgtg 660
gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt cgcgcctcag cgtcagttac 720
agaccaaaaa gccgccttcg ccactggtgt tcctccacat ctctacgcat ttcaccgcta 780
cacgtggaat tccgcttttc tcttctgcac tcaagttccc cagtttccaa tgaccctcca 840
cggttgagcc gtgggctttc acatcagact taagaaaccg cctgcgcgcg ctttacgccc 900
aataattccg gataacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 960
cgtggctttc tggttaggta ccgtcaaggt acgagcagtt actctcgtac ttgttcttcc 1020
ctaacaacag agttttacga cccgaaagcc ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag 1080
actttcgtcc attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc 1140
tcagtcccag tgtggccgat caccctctca ggtcggctat gcatcgttgc cttggtgagc 1200
cgttacctca ccaactagct aatgcaccgc gggcccatct gtaagtgata gccgaaacca 1260
tctttcaatc atctcccatg aaggagaaga tcctatccgg tattagcttc ggtttcccga 1320
agttatccca gtcttacagg caggttgccc acgtgttact cacccgtccg ccgctaacgt 1380
catagaagca agcttctaat cagttcgctc gacttgcatg tattaggcac gccgccagcg 1440
ttcatcctga gccaggattc aaaactctaa 1470
Claims (6)
1.芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B8W22，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2017751，保藏日期2017年11月30日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述芽孢杆菌B8W22在拆分外消旋(R，S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以芽孢杆菌B8W22经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以外消旋(R，S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯为底物，以pH值7.0～8.0的磷酸缓冲液为反应介质，在25～40℃、180rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)-吲哚啉-2-甲酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物加入终浓度为10～30g/L缓冲液；催化剂加入量以湿菌体计为5～20g/L缓冲液，以干菌体重量计为1～3g/L缓冲液。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将芽孢杆菌B8W22接种至斜面培养基，在30℃培养1天，获得斜面菌体；斜面培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，质量浓度2％琼脂，溶剂为去离子水，pH 7.0；
(2)种子培养：取斜面菌体接种于种子培养基，在30℃、150r/min条件下培养24h，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0；
(3)发酵培养：在无菌条件下，取种子液以体积浓度2％的接种量接种于产酶培养基中，在30℃、150r/min条件下培养24h，获得发酵液，取发酵液在12000rpm离心15min，弃上清液，收集湿菌体；产酶培养基组成为：葡萄糖15g/L，牛肉膏20g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，(NH4)2SO4 5g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；
(4)干菌体的制备：取湿菌体在-40℃条件下，冻干2天，得到干菌体。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述分离纯化的方法为：反应结束后，反应液用正己烷萃取，充分振荡，12000rpm离心15min，取下层水相加NaOH至pH 10.0，充分振荡，12000rpm离心15min，取上清，用盐酸调节至2.0后，减压过滤，获得滤液和滤渣，滤渣为产品(S)-吲哚啉-2-甲酸。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |