CN109749968B - 一株生物催化合成(r)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株生物催化合成(R)‑1,3‑丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用，属于生物催化技术领域。生物催化合成(R)‑1,3‑丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011，Bacillus velezensis，保藏编号为CGMCC No.13354。所述菌株是一种能够以4‑羟基‑2‑丁酮为底物催化合成(R)‑1,3‑丁二醇的新菌株，该菌株能够表达产生羰基还原酶，通过该菌株能够实现(R)‑1,3‑丁二醇高纯度的制备，其转化率95％，光学纯度达到100％。使用本发明的菌株进行不对称还原工艺，反应条件温和，节能环保，同时显著提高(R)‑1,3‑丁二醇的经济效益，具有很好的工业应用前景。

Description

一株生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株及 其应用

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一株生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术

(R)-1,3-丁二醇(1,3-BDO)，是一种无色、无味、低毒的粘稠液体，其结构如下所示，其熔点较高，为207.5℃，在常压下蒸馏容易被空气氧化，常在减压下进行蒸馏。(R)-1,3-丁二醇无臭味，略有苦味，吸水性较强。(R)-1,3-丁二醇是一种重要的手性合成中间物，被广泛地用于碳青霉烯类抗生素母核氮杂环丁酮、香料、信息激素和杀虫剂等物质的合成，具体如图1所示。在这些化合物中，碳青霉烯类药物、青霉烯类药物和青霉素都同属于β-内酰胺类抗生素，而青霉素的滥用导致许多抗药性菌株产生，但碳青霉烯类药物能够有效地缓解这些抗药性菌株引起的症状，碳青霉烯类药物在国内被广泛的应用，因此，开发绿色、高效的(R)-1,3-丁二醇合成技术成为国内外重要研究的目的。

目前，(R)-1,3-丁二醇主要是采用化学合成方法获得，化学合成法是以L-苏氨酸为起始原料，其反应过程经过亚硝化脱氨、甲酯化、氢解脱钙和还原等步骤，得到粗品，再重结晶而得到纯品，其工艺原料成本非常高，毒害较大，反应步骤多、反应过程复杂、副反应多且易造成环境污染，(R)-1,3-丁二醇的收率仅仅为64％，化学抽提不仅效率低，而且大量有机溶剂的使用也造成安全上的隐患和环境的污染。另一种化学合成的方法是以钌基催化剂催化4-羟基-2-丁酮不对称加氢还原技术合成(R)-1,3-丁二醇，该方法其收率达到99％以上，但催化剂制备成本高，无法实现工业化规模生产。而生物催化法以其环境友好、反应条件温和、对底物专一等优点逐渐成为了(R)-1,3-丁二醇制备最具前景的研究方向。

国内外关于生物催化方法合成(R)-1,3-丁二醇的相关报道很少。1993年，Eguchi等利用固定化SP382脂肪酶重复催化双酰基化反应拆分(R,S)-1,3-丁二醇工艺制备(R)-1,3-丁二醇，其光学纯度达98％以上，但其收率较低(Tamotsu Eguchi,KenichiMochida.Lipase-catalyzed diacylation of1,3-butanediol[J].Biotechnol.Lett.,1993,15(9):955-960.)。AkinobuMatsuyama等多次报道了利用不同酵母催化合成(R)-1,3-丁二醇，其中在1993年他们报道了利用乳酸克鲁维酵母Kluvermyces lactis IFO 1267不对称还原前手性4-羟基-2-丁酮制备(R)-1,3-丁二醇，其得率达到99％，光学纯度达到93％；同样在2001年报道了利用近平滑假丝酵母Candiaparapsilosis IFO 1396拆分外消旋体制备(R)-1,3-丁二醇，其光学纯度达到94％，得率达到48％，但这两种反应的立体选择性较低，很难满足药物的合成需求((1)A Matsuyama，H Yamamoto，N Kawada，YKobayashi.Industrialproduction of(R)-1,3-

butanediol by new biocatalysts.Journal of Molecular Catalysis BEnzymatic,2001,11(4):513-521.(2)MatsuyamaA，Kobayashi Y，Ohnishi H.MicrobialProduction of Optically Active 1,3-Butanediol from4-Hydroxy-2-butanone.Journal of the Agricultural Chemical Society,1993,57(4):685-686.)。2011年邱照宽等利用土样筛选到一株能够高效催化4-羟基-2-丁酮合成(R)-1,3-丁二醇的克鲁斯假丝酵母09162。其合成途径是该菌株利用本身表达的羰基还原酶催化还原4-羟基-2-丁酮合成(R)-1,3-丁二醇，产物光学纯度达到99％，转化效率为90％(邱照宽等.2011,37(7):17-21.)。

研究表明，在生物催化4-羟基-2-丁酮合成(R)-1,3-丁二醇的过程中，需要耦合专一配对的还原酶对其进行供氢研究并消耗大量辅酶NADH，耦合辅酶循环用酶对其整个催化体系要求更高，因而少有能直接应用于工业化生产的生物催化法研究，同时在以前报道的生物催化合成(R)-1,3-丁二醇都是在真核生物中进行，还没有关于原核生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的报道。因此，开发一些新型、高效、稳定并可以应用于工业化生产专一的羰基还原酶，进一步优化反应条件，获得最佳(R)-1,3-丁二醇转化率，对于工业制备(R)-1,3-丁二醇具有重要的研究意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够表达羰基还原酶的原核细菌菌株，所述原核细菌菌株利用所表达的羰基还原酶高效立体选择性地催化4-羟基-2-丁酮合成(R)-1,3-丁二醇。

本发明提供的一株生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)菌株SWGC31011，保藏编号为CGMCC No.13354。

本发明提供了一种所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011的培养方法，包括以下步骤：

1)将贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011接种至种子培养基中，在28～30℃下培养8～10h，得到贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌种；

2)将步骤1)中得到贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌种接种至发酵培养基，在28～30℃、150～300rpm下培养24～36h，得到发酵液固液分离，收集含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体。

优选的，所述种子培养基为LB培养基；所述发酵培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖10～45g/L、酵母膏10～50g/L、MgSO₄0.2～1.5g/L、(NH₄)₂HPO₄0.5～3.5g/L和KH₂PO₄0.5～3.5g/L，溶剂为水，pH值为5.5～8.5。

优选的，所述步骤1)或步骤2)中接种的接种量为0.1％～10％。

优选的，所述收集含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体的方法是将固液分离后得到的固相经生理盐水洗涤后，得到菌体；

固液分离的方法为离心；所述离心的转速为7000～9000rpm，所述离心的时间为10～20min。

本发明提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011在合成(R)-1,3-丁二醇中的应用。

优选的，所述合成(R)-1,3-丁二醇的方法包括以下步骤：

以4-羟基-2-丁酮为底物，以所述培养方法中得到的含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体为催化剂，在20～50℃条件下，pH值6.0～9.0的缓冲液中进行不对称加氢还原反应8～72h，反应结束后反应液经分离纯化得到手性化合物(R)-1,3-丁二醇。

优选的，所述缓冲液中底物的初始浓度为5～45g/L。

优选的，以湿重计，所述缓冲液中含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体的浓度为10～55g/L。

优选的，所述缓冲液包括pH值6.0～7.0的柠檬酸缓冲液或pH值6.5～7.5的磷酸盐缓冲液；

所述缓冲液还包括10～120g/L的辅助底物；

所述辅助底物为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、果糖或甘油。

本发明提供的一株生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011，保藏编号为CGMCC No.13354，所述菌株是一种能够以4-羟基-2-丁酮为底物催化合成(R)-1,3-丁二醇的新菌种，该菌株能够表达产生羰基还原酶，通过该菌种能够实现(R)-1,3-丁二醇高纯度的制备，其转化率95％，光学纯度达到100％。使用本发明的菌株进行不对称还原工艺，反应条件温和，节能，环保，更重要的是显著提高了经济效益，具有很好的工业应用前景。

生物材料保藏信息

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，菌株编号为SWGC31011，于2016年11月28日保藏至保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号为CGMCC No.13354。

附图说明

图1为以(R)-1,3-丁二醇为中间产物合成多种物质的流程图；

图2为贝莱斯芽孢杆菌SWGC31011菌落形态图。

具体实施方式

本发明提供的一株生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011，Bacillus velezensis，保藏编号为CGMCC No.13354。根据筛选获得菌株生理生化特性和16SrDNA测序，鉴定为Bacillus velezensis。命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)SWGC31011。所述菌株是一种能够以4-羟基-2-丁酮为底物催化合成(R)-1,3-丁二醇的新菌种，该菌株能够表达产生羰基还原酶，通过该菌种能够实现(R)-1,3-丁二醇高纯度的制备，其转化率95％，光学纯度达到100％。

本发明提供了一种所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011的培养方法，包括以下步骤：

1)将贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011接种至种子培养基中，在28～30℃下培养8～10h，得到贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌种；

2)将步骤1)中得到贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌种接种至发酵培养基，在28～30℃、150～300rpm下培养24～36h，得到发酵液固液分离，收集含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体。

本发明将贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011接种至种子培养基中，28～30℃培养8～10h，得到贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌种。

在本发明中，贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011的富集方法优选包括以下步骤：

A.将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SWGC31011接种至SYT培养基中发酵培养；

B.发酵结束后，所得发酵液离心，所得菌体洗涤两次，收集菌体备用。

在本发明中，所述SYT培养基包括以下含量的组分：胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，pH值为7.4。所述SYT培养基在121℃高温蒸汽灭菌20min。

在本发明中，所述接种的接种量为0.1～10％。所述发酵培养的温度优选为30℃，所述发酵培养的转速优选为300rpm，所述发酵培养的时间优选为24h。所述离心的转速优选为8000rpm，所述离心的时间优选为15min。洗涤用溶液优选为用生理盐水。

在本发明中，所述种子培养基优选为LB培养基；所述发酵培养基优选包括以下浓度的组分：葡萄糖10～45g/L、酵母膏10～50g/L、MgSO₄0.2～1.5g/L、(NH₄)₂HPO₄0.5～3.5g/L和KH₂PO₄0.5～3.5g/L，溶剂为水，pH值优选为5.5～8.5。

在本发明中，所述接种的接种量优选为0.1％～10％，更优选为1～5％。

得到贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌种后，本发明将得到贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌种接种至发酵培养基，在28～30℃、150～300rpm下培养24～36h，得到发酵液离心分离，收集含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体。

在本发明中，所述收集含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体的方法优选是将固液分离后得到的固相经生理盐水洗涤后，得到菌体；所述离心的转速为7000～9000rpm，所述离心的时间为10～20min。

本发明提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011在合成(R)-1,3-丁二醇中的应用。

在本发明中，所述合成(R)-1,3-丁二醇的方法优选包括以下步骤：

以4-羟基-2-丁酮为底物，以所述培养方法中得到的含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体为催化剂，在20～50℃条件下，pH值6.0～9.0的缓冲液中进行不对称加氢还原反应8～72h，反应结束后反应液经分离纯化得到手性化合物(R)-1,3-丁二醇。

在本发明中，所述缓冲液中底物的初始浓度优选为5～45g/L，更优选为10～30g/L，最优选为20g/L。以湿重计，所述缓冲液中含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体的浓度优选为10～55g/L，更优选为15～50g/L，进一步优选为20～40g/L，更优选为30g/L。所述缓冲液优选包括pH值6.0～7.0的柠檬酸缓冲液或pH值6.5～7.5的磷酸盐缓冲液。所述缓冲液优选还包括10～120g/L的辅助底物；所述辅助底物优选为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、果糖或甘油。

在本发明中，所述分离纯化的产物经过气相色谱方法鉴定，所得发酵产物为手性化合物(R)-1,3-丁二醇。

下面结合实施例对本发明提供的一株生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

贝莱斯芽孢杆菌SWGC31011的发酵培养

种子培养基：LB培养基；发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母膏50g/L，MgSO₄1.5g/L，(NH₄)₂HPO₄3g/L，KH₂PO₄3g/L，溶剂为水，pH值调至7.0。种子培养基在121℃高温灭菌20min，冷却后接种，摇瓶培养，装液量为30％。具体的培养步骤：取-70℃保存的菌种在LB固体平板上划线，挑取单菌落接于LB种子液体培养基中，30℃，250rpm转速培养12小时，将种子按照5％的接种量接种于发酵培养基中，30℃，250rpm振荡培养24小时，培养结束后发酵液离心并利用生理盐水洗涤2次，收集湿菌体细胞，菌体湿重达到20g/L。

(1)经生理生化特性试验结果，所述菌株的主要特征如下：

菌落形态：CYC琼脂30℃培养2天，菌落乳白色，透明，边缘光滑，粘稠(如图2)。

细胞形态：菌体杆状，单个或链状排列，芽孢中生或近端生，椭圆形，孢囊无明显膨大，革兰氏阳性。

生理生化特性：阳性项目：V-P，硝酸盐还原，淀粉水解，明胶液化，柠檬酸，D-木糖，L-阿拉伯糖，D-甘露糖，葡萄糖，蔗糖，络氨酸；阴性项目：丙酸盐，D-甘露糖，D-阿拉伯糖，苯丙氨酸。

(2)采用16SrDNA测序,引物为F：5′agagtttgatcctggctcag3′(SEQ ID No.2)；R：5′ggttaccttgttacgactt3′(SEQ ID No.3)，该菌株16S rDNA扩增产物序列长度为1444bp，序列如下：

gtcaccttcggcggctggctcctaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctgaaccatgcggttcaaacaaccatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccatctgtccgctcgacttgcatgtattagcaccccgc(SEQ ID No.1)

根据筛选获得菌株生理生化特性和16SrDNA测序,引物为F：5′agagtttgatcctggctcag3′(SEQ ID No.2)；R：5′ggttaccttgttacgactt3′(SEQ ID No.3)，鉴定为Bacillus velezensis。命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SWGC31011。

实施例2

(R)-1,3-丁二醇的生产

取实施例1获得的湿菌体10g，悬浮于pH值为7.0的100mM磷酸盐缓冲溶液(500ml)中，加入4-羟基-2-丁酮3g，葡萄糖15g；在30℃振荡转化7h，反应完后加入等体积的饱和碳酸钾溶液，充分混匀后静置20min，加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，抽取乙酸乙酯层进行检测。

产物的对映体光度值(ee)和底物转化率采用气相色谱法分析，具体如下：取转化液处理后的的乙酸乙酯层进样分析。分析条件如下：日本岛津气相色谱仪，瑞士BGB-175毛细管色谱柱，载气为高纯氮气，柱流量1.5ml/min，进样量1μl，分流比40:1，检测器及进样口温度均为220℃，柱温100℃，以2℃/min程序升温至132℃。

经检测产物为(R)-1,3-丁二醇。(R)-1,3-丁二醇的光学纯度为100％，转化率>99％。

实施例3

(R)-1,3-丁二醇的生产

取实施例1获得的湿菌体10g，悬浮于pH值至7.0的50mM磷酸盐缓冲液(500ml)，加入4-羟基-2-丁酮9g，异丙醇15ml，在30℃的水浴中转化，离心去除菌体，上清加入等体积的碳酸钾饱和溶液，经等体积乙酸乙酯萃取。同实施例2的分析方法分析，结果为产物(R)-1,3-丁二醇的光学纯度>99％，转化率为97％。

实施例4

(R)-1,3-丁二醇的生产

取实施例1获得的湿菌体6g，悬浮于pH7.0的50mM磷酸盐缓冲液(500ml)，加入4-羟基-2-丁酮14g，木糖50g，在30℃的水浴中转化，离心去除菌体，上清加入等体积的碳酸钾饱和溶液，经等体积乙酸乙酯萃取，同实施例2的分析方法分析，产物(R)-1,3-丁二醇的光学纯度>99％，转化率为100％。

实施例5

(R)-1,3-丁二醇的生产

取实施例1获得的湿菌体8g，悬浮于pH值为7.0的50mM磷酸盐缓冲液(500ml)，加入4-羟基-2-丁酮15g，果糖21g，在30℃的水浴中转化，离心去除菌体，上清加入等体积的碳酸钾饱和溶液，经等体积乙酸乙酯萃取。同实施例2的分析方法分析，产物(R)-1,3-丁二醇的光学纯度>99％，转化率为100％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 河北省科学院生物研究所

<120> 一株生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1444

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 1

gtcaccttcg gcggctggct cctaaaaggt tacctcaccg acttcgggtg ttacaaactc 60

tcgtggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat 120

ccgcgattac tagcgattcc agcttcacgc agtcgagttg cagactgcga tccgaactga 180

gaacagattt gtgggattgg cttaacctcg cggtttcgct gccctttgtt ctgtccattg 240

tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc 300

tccggtttgt caccggcagt caccttagag tgcccaactg aatgctggca actaagatca 360

agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca 420

tgcaccacct gtcactctgc ccccgaaggg gacgtcctat ctctaggatt gtcagaggat 480

gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg 540

tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggagt 600

gcttaatgcg ttagctgcag cactaagggg cggaaacccc ctaacactta gcactcatcg 660

tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca 720

gcgtcagtta cagaccagag agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca 780

tttcaccgct acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca ctcaagttcc ccagtttcca 840

atgaccctcc ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgagc 900

cctttacgcc caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc 960

acgtagttag ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg tgccgcccta tttgaacggc 1020

acttgttctt ccctaacaac agagctttac gatccgaaaa ccttcatcac tcacgcggcg 1080

ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt 1140

ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtc 1200

gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggtccat ctgtaagtgg 1260

tagccgaagc caccttttat gtctgaacca tgcggttcaa acaaccatcc ggtattagcc 1320

ccggtttccc ggagttatcc cagtcttaca ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc 1380

cgccgctaac atcagggagc aagctcccat ctgtccgctc gacttgcatg tattagcacc 1440

ccgc 1444

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一株生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株SWGC31011，保藏编号为CGMCC No.13354。

2.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011接种至种子培养基中，在28～30℃下培养8～10h，得到贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌种；

2)将步骤1)中所述贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌种接种至发酵培养基，在28～30℃、150～300rpm下培养24～36h，得到的发酵液固液分离，收集含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体。

3.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，所述种子培养基为LB培养基；所述发酵培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖10～45g/L、酵母膏10～50g/L、MgSO₄0.2～1.5g/L、(NH₄)₂HPO₄0.5～3.5g/L和KH₂PO₄0.5～3.5g/L，溶剂为水，pH值为5.5～8.5。

4.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，所述步骤1)或步骤2)中接种的接种量为0.1％～10％。

5.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，所述收集含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体的方法是将固液分离后得到的固相经生理盐水洗涤后，得到菌体；

所述固液分离为离心；所述离心的转速为7000～9000rpm，所述离心的时间为10～20min。

6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011在合成(R)-1,3-丁二醇中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述合成(R)-1,3-丁二醇的方法包括以下步骤：

以4-羟基-2-丁酮为底物，以权利要求2～5任意一项所述培养方法中得到的含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体为催化剂，在20～50℃条件下，pH值6.0～9.0的缓冲液中进行不对称加氢还原反应8～72h，反应结束后反应液经分离纯化得到手性化合物(R)-1,3-丁二醇。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述缓冲液中底物的初始浓度为5～45g/L。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，以湿重计，所述缓冲液中含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体的浓度为10～55g/L。

10.根据权利要求7～9任意一项所述的应用，其特征在于，所述缓冲液包括pH值6.0～7.0的柠檬酸缓冲液或pH值6.5～7.5的磷酸盐缓冲液；

所述缓冲液还包括10～120g/L的辅助底物；

所述辅助底物为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、果糖或甘油。

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