JPH0779712B2 - 固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法 - Google Patents
固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法Info
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- JPH0779712B2 JPH0779712B2 JP13953593A JP13953593A JPH0779712B2 JP H0779712 B2 JPH0779712 B2 JP H0779712B2 JP 13953593 A JP13953593 A JP 13953593A JP 13953593 A JP13953593 A JP 13953593A JP H0779712 B2 JPH0779712 B2 JP H0779712B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、固定化酵素あるいは固
定化微生物を用いて、インドリン−２−カルボン酸エス
テルを光学分割し、医薬品として有用な光学活性インド
リン−２−カルボン酸を製造する方法に関する。更に詳
しくは、一般式Ｉ
定化微生物を用いて、インドリン−２−カルボン酸エス
テルを光学分割し、医薬品として有用な光学活性インド
リン−２−カルボン酸を製造する方法に関する。更に詳
しくは、一般式Ｉ
【０００２】
【化７】
【０００３】（式中、ＲはＣ2 〜Ｃ8 の脂肪族炭化水素
基を表わす）で表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２
−カルボン酸エステルと、疎水性の担体に固定化された
立体選択的エステラーゼ活性を有するシュードモナス
（Pseudomonas)属又はアスペルギルス(Aspergillus) 属
に属する微生物由来の酵素を用いた固定化酵素もしくは
シュードモナス（Pseudomonas)属に属する微生物を用い
た固定化微生物とを接触、反応させて、構造式（Ｓ）−
II
基を表わす）で表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２
−カルボン酸エステルと、疎水性の担体に固定化された
立体選択的エステラーゼ活性を有するシュードモナス
（Pseudomonas)属又はアスペルギルス(Aspergillus) 属
に属する微生物由来の酵素を用いた固定化酵素もしくは
シュードモナス（Pseudomonas)属に属する微生物を用い
た固定化微生物とを接触、反応させて、構造式（Ｓ）−
II
【０００４】
【化８】
【０００５】で表わされる光学活性（Ｓ）−インドリン
−２−カルボン酸と、構造式（Ｒ）−Ｉ
−２−カルボン酸と、構造式（Ｒ）−Ｉ
【０００６】
【化９】
【０００７】（Ｒは前記と同じ）で表わされる光学活性
インドリン−２−カルボン酸エステルとに不斉加水分解
し、固定化に用いた担体との親和性の差を利用して、親
水性のインドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−IIを水また
は緩衝液で回収、採取し、次に、担体に吸着・結合して
いるインドリン−２−カルボン酸エステル（Ｒ）−Ｉを
有機溶剤で溶出、採取し、更に必要に応じ、該エステル
（Ｒ）−Ｉを加水分解して（Ｓ）−IIの対掌体である光
学活性インドリン−２−カルボン酸（Ｒ）−IIを生成さ
せ、採取する方法に関する。即ち、不斉加水分解反応
と、生成物インドリン−２−カルボン酸の反応液からの
分離、回収を同時に行うことを特徴とするインドリン−
２−カルボン酸の製造方法に関する。
インドリン−２−カルボン酸エステルとに不斉加水分解
し、固定化に用いた担体との親和性の差を利用して、親
水性のインドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−IIを水また
は緩衝液で回収、採取し、次に、担体に吸着・結合して
いるインドリン−２−カルボン酸エステル（Ｒ）−Ｉを
有機溶剤で溶出、採取し、更に必要に応じ、該エステル
（Ｒ）−Ｉを加水分解して（Ｓ）−IIの対掌体である光
学活性インドリン−２−カルボン酸（Ｒ）−IIを生成さ
せ、採取する方法に関する。即ち、不斉加水分解反応
と、生成物インドリン−２−カルボン酸の反応液からの
分離、回収を同時に行うことを特徴とするインドリン−
２−カルボン酸の製造方法に関する。
【０００８】本発明の場合、立体選択的エステラーゼを
活性を有する酵素あるいは微生物を選択することにより
不斉加水分解生成物として（Ｓ）−インドリン−２−カ
ルボン酸と（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸エステ
ルの組合わせの生成物を得ることができ、各光学活性体
を随時採取することができる。
活性を有する酵素あるいは微生物を選択することにより
不斉加水分解生成物として（Ｓ）−インドリン−２−カ
ルボン酸と（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸エステ
ルの組合わせの生成物を得ることができ、各光学活性体
を随時採取することができる。
【０００９】これら光学活性インドリン−２−カルボン
酸類化合物は種々医薬品の原料となりうる重要な化合物
である。例えば（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸は
アンジオテンシンＩ変換酵素の阻害剤として有用な血圧
降下剤（Ｓ）−１−〔（Ｓ）−３−メルカプト−２−オ
キソプロピル〕−インドリン−２−カルボン酸構造式：
酸類化合物は種々医薬品の原料となりうる重要な化合物
である。例えば（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸は
アンジオテンシンＩ変換酵素の阻害剤として有用な血圧
降下剤（Ｓ）−１−〔（Ｓ）−３−メルカプト−２−オ
キソプロピル〕−インドリン−２−カルボン酸構造式：
【００１０】
【化１０】
【００１１】
【従来の技術】従来、酵素反応は遊離の酵素を反応器に
加え、回分法で反応が行われ、反応終了後、酵素は使い
すてにされていたが、酵素は一般的に高価であるためコ
スト的に不利となり、また不安定でもあるため酵素の工
業的利用は限られていた。さらに回分法では酵素反応終
了後、反応生成物を反応液から分離する方法として、 １）有機溶媒で抽出分離する方法。 ２）反応液を一旦有機溶媒に転溶した後、又は反応液を
そのままカラムクロマトグラフィー処理することによっ
て分離する方法。 ３）反応液を一旦有機溶媒に転溶した後、又は反応液を
そのまま分留することによって分離する方法。 などが行われてきたが、操作が繁雑で収率が悪かった
り、時間がかかったり、特別の装置が必要であったりし
てコストが高くなるという欠点があった。
加え、回分法で反応が行われ、反応終了後、酵素は使い
すてにされていたが、酵素は一般的に高価であるためコ
スト的に不利となり、また不安定でもあるため酵素の工
業的利用は限られていた。さらに回分法では酵素反応終
了後、反応生成物を反応液から分離する方法として、 １）有機溶媒で抽出分離する方法。 ２）反応液を一旦有機溶媒に転溶した後、又は反応液を
そのままカラムクロマトグラフィー処理することによっ
て分離する方法。 ３）反応液を一旦有機溶媒に転溶した後、又は反応液を
そのまま分留することによって分離する方法。 などが行われてきたが、操作が繁雑で収率が悪かった
り、時間がかかったり、特別の装置が必要であったりし
てコストが高くなるという欠点があった。
【００１２】これらの酵素の回分法による使いすて、生
産物の回収方法等の問題点を解決するため、近年、酵素
や微生物の固定化が研究され、酵素や微生物のくり返し
使用、さらにはカラムに充填して連続的に反応を行うこ
とも可能となってきた。しかし、固定化酵素を用いてセ
ラミ体を原料として不斉加水分解と同時に反応生成物を
分離し、更にそれを連続的に行って成功した例はこれま
で報告されていない。
産物の回収方法等の問題点を解決するため、近年、酵素
や微生物の固定化が研究され、酵素や微生物のくり返し
使用、さらにはカラムに充填して連続的に反応を行うこ
とも可能となってきた。しかし、固定化酵素を用いてセ
ラミ体を原料として不斉加水分解と同時に反応生成物を
分離し、更にそれを連続的に行って成功した例はこれま
で報告されていない。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、さきに、
インドリン−２−カルボン酸エステルＩに作用し、光学
活性インドリン−２−カルボン酸II * と光学活性インド
リン−２−カルボン酸エステルＩ * とに立体選択的に分
割する酵素、あるいは微生物を見出し、光学分割による
インドリン−２−カルボン酸の製造方法を見出して提案
している。
インドリン−２−カルボン酸エステルＩに作用し、光学
活性インドリン−２−カルボン酸II * と光学活性インド
リン−２−カルボン酸エステルＩ * とに立体選択的に分
割する酵素、あるいは微生物を見出し、光学分割による
インドリン−２−カルボン酸の製造方法を見出して提案
している。
【００１４】本発明者らは、これら酵素あるいは微生物
の固定化と、より簡便な生成物の分離技術を確立すべく
鋭意努力を重ねてきた。その結果、担体として、基質と
生成物に対して親和性に差がある担体を選択し、該担体
で酵素あるいは微生物を固定化することによって、基質
インドリン−２−カルボン酸エステルの加水分解と、生
成物インドリン−２−カルボン酸の分離、回収とを同時
に行うことに成功し、本発明を完成した。以下、本発明
を詳細に説明する。
の固定化と、より簡便な生成物の分離技術を確立すべく
鋭意努力を重ねてきた。その結果、担体として、基質と
生成物に対して親和性に差がある担体を選択し、該担体
で酵素あるいは微生物を固定化することによって、基質
インドリン−２−カルボン酸エステルの加水分解と、生
成物インドリン−２−カルボン酸の分離、回収とを同時
に行うことに成功し、本発明を完成した。以下、本発明
を詳細に説明する。
【００１５】本発明の基質として用いられる、一般式
【００１６】
【化１１】
【００１７】で表わされるインドリン−２−カルボン酸
エステルは、置換基ＲがＣ2 〜Ｃ8 の脂肪族炭化水素基
の化合物であり、好ましくはエチル、ブチル、アミル、
ヘキシル基からなるエステルである。またＩは、一般式
II
エステルは、置換基ＲがＣ2 〜Ｃ8 の脂肪族炭化水素基
の化合物であり、好ましくはエチル、ブチル、アミル、
ヘキシル基からなるエステルである。またＩは、一般式
II
【００１８】
【化１２】
【００１９】で表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２
−カルボン酸に溶媒と反応試剤とを兼ねたアルコールを
加え、インドリン−２−カルボン酸の濃度５〜２０％
（Ｗ／Ｖ）の範囲で、強酸性下、５０℃〜還流温度の範
囲で１〜５時間縮合反応を行う。更に、この反応液をｐ
Ｈ７．０に調整後、減圧濃縮により過剰のアルコールを
除去する。濃縮液に水又は飽和重炭酸ソーダを加え、酢
酸エチル又はヘキサン等のような疎水性有機溶媒を用い
て抽出し、更に濃縮すれば高純度の（Ｒ，Ｓ）−インド
リン−２−カルボン酸エステルＩが得られる。
−カルボン酸に溶媒と反応試剤とを兼ねたアルコールを
加え、インドリン−２−カルボン酸の濃度５〜２０％
（Ｗ／Ｖ）の範囲で、強酸性下、５０℃〜還流温度の範
囲で１〜５時間縮合反応を行う。更に、この反応液をｐ
Ｈ７．０に調整後、減圧濃縮により過剰のアルコールを
除去する。濃縮液に水又は飽和重炭酸ソーダを加え、酢
酸エチル又はヘキサン等のような疎水性有機溶媒を用い
て抽出し、更に濃縮すれば高純度の（Ｒ，Ｓ）−インド
リン−２−カルボン酸エステルＩが得られる。
【００２０】本発明において、構造式（Ｓ）−II
【００２１】
【化１３】
【００２２】で表わされる光学活性（Ｓ）−インドリン
−２−カルボン酸（Ｓ）−IIを生成させる場合、酵素と
しては例えばリポプロテイン リパーゼアマノ３（ＬＰ
Ｌ，起源；シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomona
s aeruginosa) 、天野製薬株式会社製やリパーゼＡＰ−
４及びリパーゼＡＰ−６（起源；アスペルギルス・ニガ
ー（Aspergillus niger), 天野製薬株式会社製）等を使
用することができる。
−２−カルボン酸（Ｓ）−IIを生成させる場合、酵素と
しては例えばリポプロテイン リパーゼアマノ３（ＬＰ
Ｌ，起源；シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomona
s aeruginosa) 、天野製薬株式会社製やリパーゼＡＰ−
４及びリパーゼＡＰ−６（起源；アスペルギルス・ニガ
ー（Aspergillus niger), 天野製薬株式会社製）等を使
用することができる。
【００２３】微生物を用いて（Ｓ）−IIを生成させる場
合、例えばシュードモナス属（Pseudomonas)或いはアス
ペルギルス（Aspergillus)属等に属する微生物があり、
更に詳しくはシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomo
nas aeruginosa) IFO 3030,IFO 13130 やアスペルギル
ス・ニガー（Aspergillus niger) IFO 4407 がある。
合、例えばシュードモナス属（Pseudomonas)或いはアス
ペルギルス（Aspergillus)属等に属する微生物があり、
更に詳しくはシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomo
nas aeruginosa) IFO 3030,IFO 13130 やアスペルギル
ス・ニガー（Aspergillus niger) IFO 4407 がある。
【００２４】これら微生物の菌体を得るには、栄養源と
して通常資化しうる炭素源、窒素源、ビタミン及びミネ
ラルを適宜配合したもの、たとえばグルコース、ペプト
ン、酵母エキス、肉エキス等からなる栄養培地が用いら
れる。培養は、温度１０〜４０℃、好ましくは２５〜３
５℃で、ｐＨは３〜８、好ましくは６〜７であり、好気
的に培養し、通常２４〜４８時間行えばよい。こうして
得られた菌体は遠心分離或いは濾過等の処理で集菌し、
そのまま樹脂で固定し、固定化菌体とするが、微生物菌
体を破砕後、硫安分画やアセトン処理して得られる粗酵
素としてから固定化して固定化酵素として使用すること
ができる。
して通常資化しうる炭素源、窒素源、ビタミン及びミネ
ラルを適宜配合したもの、たとえばグルコース、ペプト
ン、酵母エキス、肉エキス等からなる栄養培地が用いら
れる。培養は、温度１０〜４０℃、好ましくは２５〜３
５℃で、ｐＨは３〜８、好ましくは６〜７であり、好気
的に培養し、通常２４〜４８時間行えばよい。こうして
得られた菌体は遠心分離或いは濾過等の処理で集菌し、
そのまま樹脂で固定し、固定化菌体とするが、微生物菌
体を破砕後、硫安分画やアセトン処理して得られる粗酵
素としてから固定化して固定化酵素として使用すること
ができる。
【００２５】酵素あるいは微生物固定化用担体として
は、疎水性をもつ種々の担体が用いられる。疎水性をも
つ担体とは、水もしくは緩衝液中では不斉水解反応によ
って生成した親水性化合物（Ｓ）−IIを吸着せず、エス
テル化合物（Ｒ）−Ｉを疎水的相互作用によって吸着
し、さらにこの吸着しているエステル化合物（Ｒ）−Ｉ
は低極性溶媒中では速やかに脱着するような性質をもつ
担体であることが望ましい。更に具体的な担体として
は、例えば疎水性をもつ合成吸着剤、疎水クロマトグラ
フィー用樹脂、疎水性を持つ光架橋性樹脂、疎水性のウ
レタンプレポリマー樹脂、疎水基を化学結合させて導入
した高分子物質等が挙げられる。
は、疎水性をもつ種々の担体が用いられる。疎水性をも
つ担体とは、水もしくは緩衝液中では不斉水解反応によ
って生成した親水性化合物（Ｓ）−IIを吸着せず、エス
テル化合物（Ｒ）−Ｉを疎水的相互作用によって吸着
し、さらにこの吸着しているエステル化合物（Ｒ）−Ｉ
は低極性溶媒中では速やかに脱着するような性質をもつ
担体であることが望ましい。更に具体的な担体として
は、例えば疎水性をもつ合成吸着剤、疎水クロマトグラ
フィー用樹脂、疎水性を持つ光架橋性樹脂、疎水性のウ
レタンプレポリマー樹脂、疎水基を化学結合させて導入
した高分子物質等が挙げられる。
【００２６】かかる担体への酵素の固定化は、公知の種
々の方法によって行うことができる。例えば物理的吸着
法、共有結合法、イオン結合法、架橋法、包括法等が挙
げられる。微生物の場合にも包括法等が挙げられる〔福
井・千畑・鈴木編、酵素工学、１５７−２４３頁、講談
社（１９８１）；千畑一郎編、固定化酵素、講談社（１
９７５）〕。これらの固定化酵素或いは固定化微生物の
調製法のうち、方法の簡便さ、担体の物理的強度及び安
価さなどにより、酵素では疎水性を持つ合成吸着剤に酵
素を物理的に吸着させる方法、微生物では疎水性を持つ
光架橋性樹脂或いは疎水性のウレタンプレポリマー樹脂
に微生物菌体を包括する方法が工業的に望ましい。
々の方法によって行うことができる。例えば物理的吸着
法、共有結合法、イオン結合法、架橋法、包括法等が挙
げられる。微生物の場合にも包括法等が挙げられる〔福
井・千畑・鈴木編、酵素工学、１５７−２４３頁、講談
社（１９８１）；千畑一郎編、固定化酵素、講談社（１
９７５）〕。これらの固定化酵素或いは固定化微生物の
調製法のうち、方法の簡便さ、担体の物理的強度及び安
価さなどにより、酵素では疎水性を持つ合成吸着剤に酵
素を物理的に吸着させる方法、微生物では疎水性を持つ
光架橋性樹脂或いは疎水性のウレタンプレポリマー樹脂
に微生物菌体を包括する方法が工業的に望ましい。
【００２７】酵素或いは微生物の担体への担持量は、担
体の担持能によって左右されるので、必ずしも一義的で
はないが、酵素では担体の湿重量１ｇ当り約０．１mg乃
至約１００mg、通常約１mg乃至約２０mg程度であればよ
く、微生物菌体では担体の湿重量１ｇ当り湿菌体０．１
ｇ乃至１ｇ、通常約０．１５ｇ乃至約０．５ｇ程度であ
ればよい。
体の担持能によって左右されるので、必ずしも一義的で
はないが、酵素では担体の湿重量１ｇ当り約０．１mg乃
至約１００mg、通常約１mg乃至約２０mg程度であればよ
く、微生物菌体では担体の湿重量１ｇ当り湿菌体０．１
ｇ乃至１ｇ、通常約０．１５ｇ乃至約０．５ｇ程度であ
ればよい。
【００２８】本固定化酵素或いは固定化微生物に負荷で
きる基質の量としては、固定化した担体によって変わる
が、基質を負荷した時に未反応の基質が遊離する限界量
まで可能である。例えば合成吸着剤アンバーライトＸＡ
Ｄ−７を担体とした固定化酵素をカラムに充填した場
合、そのカラム容積の１／３量までの基質を負荷するこ
とが可能である。化合物Ｉの水に対する溶解度は一般に
低いが、例えばアセトン、メタノール等の有機溶媒の界
面活性剤等を反応に支障とならない程度加えても良い。
固定化酵素もしくは固定化微生物を用いて不斉加水分解
を行う場合、反応温度は通常１０〜６０℃の範囲で可能
であるが、２０〜４０℃で行うことが好ましい。本不斉
加水分解反応はｐＨ４．５〜ｐＨ１０の範囲で可能であ
るが、反応速度が大であるｐＨ６〜ｐＨ８．５の範囲で
行うことが望ましい。また本反応では不斉加水分解の進
行に伴いインドリンカルボン酸を生じｐＨが低下する。
そのため基質化合物の負荷量が多いときには、緩衝液を
使用するなどしてｐＨを一定の範囲内に制御することが
望ましい。この目的に適する緩衝液としては無機酸塩、
有機酸塩いずれの緩衝液も使用することができる。
きる基質の量としては、固定化した担体によって変わる
が、基質を負荷した時に未反応の基質が遊離する限界量
まで可能である。例えば合成吸着剤アンバーライトＸＡ
Ｄ−７を担体とした固定化酵素をカラムに充填した場
合、そのカラム容積の１／３量までの基質を負荷するこ
とが可能である。化合物Ｉの水に対する溶解度は一般に
低いが、例えばアセトン、メタノール等の有機溶媒の界
面活性剤等を反応に支障とならない程度加えても良い。
固定化酵素もしくは固定化微生物を用いて不斉加水分解
を行う場合、反応温度は通常１０〜６０℃の範囲で可能
であるが、２０〜４０℃で行うことが好ましい。本不斉
加水分解反応はｐＨ４．５〜ｐＨ１０の範囲で可能であ
るが、反応速度が大であるｐＨ６〜ｐＨ８．５の範囲で
行うことが望ましい。また本反応では不斉加水分解の進
行に伴いインドリンカルボン酸を生じｐＨが低下する。
そのため基質化合物の負荷量が多いときには、緩衝液を
使用するなどしてｐＨを一定の範囲内に制御することが
望ましい。この目的に適する緩衝液としては無機酸塩、
有機酸塩いずれの緩衝液も使用することができる。
【００２９】カラムを用いて反応を行う場合、固定化酵
素或いは固定化微生物をカラムに充填し、まず緩衝液を
流し、次に基質のエステル化合物（Ｒ，Ｓ）−Ｉを負荷
し、負荷し終わったら再び緩衝液を流すことによってカ
ラム内で不斉加水分解反応を行う。生成する親水的な化
合物（Ｓ）−IIは緩衝液に溶けてカラムから溶出され
る。この緩衝液画分を高速液体クロマトグラフィー（Fi
nepak SIL C18,展開液；アセトニトリル：水＝１．５：
１（ｖ／ｖ）、検出；ＵＶ２１５ｎｍ）により分析し、
画分中に化合物（Ｓ）−IIがほとんど認められなくなっ
た時点で緩衝液にかえて低極性溶媒を流し、カラム内の
固定化酵素或いは固定化微生物に吸着している未反応の
化合物（Ｒ）−Ｉを溶出する。この溶媒画分を液体クロ
マトグラフィー（条件上と同じ）で分析し、画分中に化
合物（Ｒ）−Ｉがほとんど認められなくなれば、低極性
溶媒にかえて再び緩衝液を流すことによってカラム内を
緩衝液で置換し、基質のエステル化合物（Ｒ，Ｓ）−Ｉ
を負荷する。これらの一連の操作をくり返すことによっ
て化合物（Ｒ，Ｓ）−Ｉの不斉加水分解と反応生成物の
分取をパルス的に連続して行うことが可能である。
素或いは固定化微生物をカラムに充填し、まず緩衝液を
流し、次に基質のエステル化合物（Ｒ，Ｓ）−Ｉを負荷
し、負荷し終わったら再び緩衝液を流すことによってカ
ラム内で不斉加水分解反応を行う。生成する親水的な化
合物（Ｓ）−IIは緩衝液に溶けてカラムから溶出され
る。この緩衝液画分を高速液体クロマトグラフィー（Fi
nepak SIL C18,展開液；アセトニトリル：水＝１．５：
１（ｖ／ｖ）、検出；ＵＶ２１５ｎｍ）により分析し、
画分中に化合物（Ｓ）−IIがほとんど認められなくなっ
た時点で緩衝液にかえて低極性溶媒を流し、カラム内の
固定化酵素或いは固定化微生物に吸着している未反応の
化合物（Ｒ）−Ｉを溶出する。この溶媒画分を液体クロ
マトグラフィー（条件上と同じ）で分析し、画分中に化
合物（Ｒ）−Ｉがほとんど認められなくなれば、低極性
溶媒にかえて再び緩衝液を流すことによってカラム内を
緩衝液で置換し、基質のエステル化合物（Ｒ，Ｓ）−Ｉ
を負荷する。これらの一連の操作をくり返すことによっ
て化合物（Ｒ，Ｓ）−Ｉの不斉加水分解と反応生成物の
分取をパルス的に連続して行うことが可能である。
【００３０】本固定化酵素或いは固定化微生物を用いて
回分法でラセミ体化合物Ｉの不斉加水分解を行う場合に
は、生成する光学活性な親水性化合物（Ｓ）−IIを含む
水層と光学活性な疎水性化合物（Ｒ）−Ｉを吸着してい
る固定化酵素或いは固定化微生物とを濾過もしくはゆる
やかに遠心することによって分離し、さらに低極性溶媒
で固定化酵素或いは固定化微生物を洗浄することによっ
て化合物（Ｒ）−Ｉを得ることができ、固定化酵素或い
は固定化微生物は再び反応に用いることができる。
回分法でラセミ体化合物Ｉの不斉加水分解を行う場合に
は、生成する光学活性な親水性化合物（Ｓ）−IIを含む
水層と光学活性な疎水性化合物（Ｒ）−Ｉを吸着してい
る固定化酵素或いは固定化微生物とを濾過もしくはゆる
やかに遠心することによって分離し、さらに低極性溶媒
で固定化酵素或いは固定化微生物を洗浄することによっ
て化合物（Ｒ）−Ｉを得ることができ、固定化酵素或い
は固定化微生物は再び反応に用いることができる。
【００３１】本発明において疎水性の化合物（Ｒ）−Ｉ
を溶出するのに用いる低極性溶媒は、固定化酵素の場
合、担体に吸着している酵素を脱着しない溶媒であっ
て、かつ親水性化合物（Ｓ）−IIは殆んど溶解せず、一
方疎水性の化合物（Ｒ）−Ｉはよく溶解する溶媒が望ま
しい。そのような溶媒としては、例えばベンゼン、トル
エン、キシレンのような芳香族炭化水素溶媒，ｎ−ヘキ
サン，ｎ−ヘプタン，ｎ−オクタンのような脂肪族炭化
水素溶媒，シクロペンタン，シクロヘキサン，シクロヘ
プタンのような脂環式炭化水素溶媒又はこれらの混合溶
媒が好適な溶媒として挙げられる。固定化微生物の場合
にもまったく同様の溶媒を用いることができる。
を溶出するのに用いる低極性溶媒は、固定化酵素の場
合、担体に吸着している酵素を脱着しない溶媒であっ
て、かつ親水性化合物（Ｓ）−IIは殆んど溶解せず、一
方疎水性の化合物（Ｒ）−Ｉはよく溶解する溶媒が望ま
しい。そのような溶媒としては、例えばベンゼン、トル
エン、キシレンのような芳香族炭化水素溶媒，ｎ−ヘキ
サン，ｎ−ヘプタン，ｎ−オクタンのような脂肪族炭化
水素溶媒，シクロペンタン，シクロヘキサン，シクロヘ
プタンのような脂環式炭化水素溶媒又はこれらの混合溶
媒が好適な溶媒として挙げられる。固定化微生物の場合
にもまったく同様の溶媒を用いることができる。
【００３２】固定化酵素、あるいは固定化微生物を用い
た反応液からのインドリン−２−カルボン酸、及びイン
ドリン−２−カルボン酸エステルの精製、採取は以下の
ようにすればよい。光学活性インドリン−２−カルボン
酸（Ｓ）−IIを含む緩衝液画分を硫安で飽和後、ｐＨを
５．０付近に調整し、（Ｓ）−IIを酢酸エチル、塩化メ
チレン等の有機溶媒で抽出することにより高純度の光学
活性化合物（Ｓ）−IIを得ることができる。必要に応じ
て、さらにアセトン等の有機溶媒中で晶析してもよい。
た反応液からのインドリン−２−カルボン酸、及びイン
ドリン−２−カルボン酸エステルの精製、採取は以下の
ようにすればよい。光学活性インドリン−２−カルボン
酸（Ｓ）−IIを含む緩衝液画分を硫安で飽和後、ｐＨを
５．０付近に調整し、（Ｓ）−IIを酢酸エチル、塩化メ
チレン等の有機溶媒で抽出することにより高純度の光学
活性化合物（Ｓ）−IIを得ることができる。必要に応じ
て、さらにアセトン等の有機溶媒中で晶析してもよい。
【００３３】疎水性溶媒中に回収された光学活性インド
リン−２−カルボン酸エステルは、そのまま濃縮すれば
高光学純度のエステル体で得られるが、更に次のように
して光学活性インドリン−２−カルボン酸とすることが
できる。即ち、光学活性インドリン−２−カルボン酸エ
ステル（Ｒ）−Ｉを室温下、ｐＨ１０〜１３．５の範囲
で２〜５時間アルカリ加水分解を行えば、（Ｒ）−IIが
生成する。また、（Ｒ）−Ｉを加水分解する能力を有す
る酵素、例えばステアプシンを作用させて加水分解を行
えば、（Ｒ）−IIを得ることができる。
リン−２−カルボン酸エステルは、そのまま濃縮すれば
高光学純度のエステル体で得られるが、更に次のように
して光学活性インドリン−２−カルボン酸とすることが
できる。即ち、光学活性インドリン−２−カルボン酸エ
ステル（Ｒ）−Ｉを室温下、ｐＨ１０〜１３．５の範囲
で２〜５時間アルカリ加水分解を行えば、（Ｒ）−IIが
生成する。また、（Ｒ）−Ｉを加水分解する能力を有す
る酵素、例えばステアプシンを作用させて加水分解を行
えば、（Ｒ）−IIを得ることができる。
【００３４】このようにして得られた加水分解液は、ｐ
Ｈを４〜６、好ましくは５．０付近に調整後、塩化メチ
レン、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出し、濃縮後、アセ
トン等の有機溶媒中で晶析することにより高光学純度の
（Ｒ）−IIを得ることができる。
Ｈを４〜６、好ましくは５．０付近に調整後、塩化メチ
レン、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出し、濃縮後、アセ
トン等の有機溶媒中で晶析することにより高光学純度の
（Ｒ）−IIを得ることができる。
【００３５】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。 参考例１ （Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸アミルの製造 （Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｒ，Ｓ）−
II ５０ｇをアミルアルコール５００mlに溶解し、更に
濃塩酸１００mlを添加し、９５〜１００℃の範囲で３時
間、縮合反応を行った。反応後、一旦冷却してから１０
％苛性ソーダ液でｐＨを７．０に調整した。更に過剰量
のアミルアルコール及び水を減圧濃縮操作により除去し
た。濃縮液中には、目的物の（Ｒ，Ｓ）−インドリン−
２−カルボン酸アミル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ及び無機塩が含
まれている。この濃縮液に酢酸エチル１リットルを加
え、飽和重炭酸ソーダ水２００mlで２回（計４００ml）
洗浄後、酢酸エチル層を濃縮したところ（Ｒ，Ｓ）−Ｉ
ａが６０．８ｇ、８５％の収率で得られた。
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。 参考例１ （Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸アミルの製造 （Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｒ，Ｓ）−
II ５０ｇをアミルアルコール５００mlに溶解し、更に
濃塩酸１００mlを添加し、９５〜１００℃の範囲で３時
間、縮合反応を行った。反応後、一旦冷却してから１０
％苛性ソーダ液でｐＨを７．０に調整した。更に過剰量
のアミルアルコール及び水を減圧濃縮操作により除去し
た。濃縮液中には、目的物の（Ｒ，Ｓ）−インドリン−
２−カルボン酸アミル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ及び無機塩が含
まれている。この濃縮液に酢酸エチル１リットルを加
え、飽和重炭酸ソーダ水２００mlで２回（計４００ml）
洗浄後、酢酸エチル層を濃縮したところ（Ｒ，Ｓ）−Ｉ
ａが６０．８ｇ、８５％の収率で得られた。
【００３６】参考例２ （Ｒ）−選択的エステラーゼ活性を有するリパーゼ（ス
テアプシン）（和光純薬株式会社製）１０ｇをｐＨ７．
０の０．１Ｍリン酸緩衝液１００mlに加えて混和し、濾
過によって不溶物を除いた。濾液にローム・アンド・ハ
ース社製メタクリレート系多孔質吸着剤アンバーライト
ＸＡＤ−７をメタノールと水で洗浄後、湿重量６０ｇ
（含水率７１％）を加え、低温室（４℃）で一夜ゆっく
り攪拌し、酵素を吸着固定化した。固定化酵素懸濁液を
グラスフィルターを用いて吸引濾過し、さらにｐＨ７．
０の０．１Ｍリン酸緩衝液１００mlで３回洗浄後、吸引
濾過して湿潤固定化酵素を得た。この固定化リパーゼを
内径２．２cmのカラムに高さ１５cmに充填し、３３℃に
保温してラセミ体のインドリン−２−カルボン酸アミル
（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ ５ｇを負荷し、ｐＨ７．０の０．１
Ｍリン酸緩衝液を毎時６mlの流速で流して反応させた。
カラムからの溶出液を１２mlずつフラクションコレクタ
ーで分取し、液体クロマトグラフィーで分析した。この
リン酸緩衝液画分には、不斉加水分解され生成した親水
的なインドリン−２−カルボン酸のみが含まれていた。
該リン酸緩衝液の画分１８０mlに飽和になるまで硫酸ア
ンモニウムを加え、更にｐＨを５．０に調整した。次に
等量の酢酸エチルを加え、３回該インドリン−２−カル
ボン酸を抽出し、脱水後、減圧濃縮し、乾固物をアセト
ン−ヘキサン（５ml−１ml）で再結した。真空で乾燥
後、比旋光度〔α〕25 D −３２．５°〔ｃ＝１．０、ジ
メチルホルムアミド（以下ＤＭＦＡという）〕（文献
値、D. H. Kim et al, J. Med. Chem., 26, 394 (198
3), 〔α〕25 D ＋３４．５°（ｃ＝０．９１，ＤＭＦ
Ａ）〕を有する白色の粉末（Ｒ）−インドリン−２−カ
ルボン酸（Ｒ）−IIが１．２６ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−Ｉａよ
りの収率７２％〕得られた。リン酸緩衝液を１８０ml流
した時点で、リン酸緩衝液にかえてヘキサンを毎分１．
０mlの流速で流し、カラム内の固定化酵素の担体に吸着
していた未反応の疎水的なインドリン−２−カルボン酸
アミルを溶出した。カラムからの溶出ヘキサン溶液を１
０mlずつフラクションコレクターで分取し、インドリン
−２−カルボン酸アミルを含む画分９０mlを濃縮し、比
旋光度〔α〕25 D ＋５．６°（ｃ＝１．０，エタノー
ル）を有するシロップ（Ｓ）−Ｉａが２．３８ｇ
〔（Ｒ，Ｓ）−Ｉａからの収率９５％〕得られた。得ら
れた（Ｓ）−Ｉａ ２．３８ｇに１Ｎ苛性ソーダ１５ml
加え、室温下約３時間加水分解を行い、反応液を１Ｎ塩
酸でｐＨ５．０に調製後、酢酸エチル１５mlで４回抽出
操作を行った。無水硫酸ソーダで脱水処理後、減圧濃縮
し、乾固物をアセトン−ヘキサン（５ml−１ml）で再結
すると比旋光度〔α〕25 D ＋３３．９°（ｃ＝１．０，
ＤＭＦＡ）を有する白色の粉末（Ｓ）−インドリン−２
−カルボン酸（Ｓ）−IIが１．２３ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−Ｉ
ａよりの収率７０％〕得られた。なお、上記リン酸緩衝
液およびヘキサンによる溶出において酵素の脱着は認め
られなかった。
テアプシン）（和光純薬株式会社製）１０ｇをｐＨ７．
０の０．１Ｍリン酸緩衝液１００mlに加えて混和し、濾
過によって不溶物を除いた。濾液にローム・アンド・ハ
ース社製メタクリレート系多孔質吸着剤アンバーライト
ＸＡＤ−７をメタノールと水で洗浄後、湿重量６０ｇ
（含水率７１％）を加え、低温室（４℃）で一夜ゆっく
り攪拌し、酵素を吸着固定化した。固定化酵素懸濁液を
グラスフィルターを用いて吸引濾過し、さらにｐＨ７．
０の０．１Ｍリン酸緩衝液１００mlで３回洗浄後、吸引
濾過して湿潤固定化酵素を得た。この固定化リパーゼを
内径２．２cmのカラムに高さ１５cmに充填し、３３℃に
保温してラセミ体のインドリン−２−カルボン酸アミル
（Ｒ，Ｓ）−Ｉａ ５ｇを負荷し、ｐＨ７．０の０．１
Ｍリン酸緩衝液を毎時６mlの流速で流して反応させた。
カラムからの溶出液を１２mlずつフラクションコレクタ
ーで分取し、液体クロマトグラフィーで分析した。この
リン酸緩衝液画分には、不斉加水分解され生成した親水
的なインドリン−２−カルボン酸のみが含まれていた。
該リン酸緩衝液の画分１８０mlに飽和になるまで硫酸ア
ンモニウムを加え、更にｐＨを５．０に調整した。次に
等量の酢酸エチルを加え、３回該インドリン−２−カル
ボン酸を抽出し、脱水後、減圧濃縮し、乾固物をアセト
ン−ヘキサン（５ml−１ml）で再結した。真空で乾燥
後、比旋光度〔α〕25 D −３２．５°〔ｃ＝１．０、ジ
メチルホルムアミド（以下ＤＭＦＡという）〕（文献
値、D. H. Kim et al, J. Med. Chem., 26, 394 (198
3), 〔α〕25 D ＋３４．５°（ｃ＝０．９１，ＤＭＦ
Ａ）〕を有する白色の粉末（Ｒ）−インドリン−２−カ
ルボン酸（Ｒ）−IIが１．２６ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−Ｉａよ
りの収率７２％〕得られた。リン酸緩衝液を１８０ml流
した時点で、リン酸緩衝液にかえてヘキサンを毎分１．
０mlの流速で流し、カラム内の固定化酵素の担体に吸着
していた未反応の疎水的なインドリン−２−カルボン酸
アミルを溶出した。カラムからの溶出ヘキサン溶液を１
０mlずつフラクションコレクターで分取し、インドリン
−２−カルボン酸アミルを含む画分９０mlを濃縮し、比
旋光度〔α〕25 D ＋５．６°（ｃ＝１．０，エタノー
ル）を有するシロップ（Ｓ）−Ｉａが２．３８ｇ
〔（Ｒ，Ｓ）−Ｉａからの収率９５％〕得られた。得ら
れた（Ｓ）−Ｉａ ２．３８ｇに１Ｎ苛性ソーダ１５ml
加え、室温下約３時間加水分解を行い、反応液を１Ｎ塩
酸でｐＨ５．０に調製後、酢酸エチル１５mlで４回抽出
操作を行った。無水硫酸ソーダで脱水処理後、減圧濃縮
し、乾固物をアセトン−ヘキサン（５ml−１ml）で再結
すると比旋光度〔α〕25 D ＋３３．９°（ｃ＝１．０，
ＤＭＦＡ）を有する白色の粉末（Ｓ）−インドリン−２
−カルボン酸（Ｓ）−IIが１．２３ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−Ｉ
ａよりの収率７０％〕得られた。なお、上記リン酸緩衝
液およびヘキサンによる溶出において酵素の脱着は認め
られなかった。
【００３７】実施例１ 参考例２において、酵素を（Ｓ）選択的エステラーゼ活
性をもつリポプロテイン リパーゼアマノ３（ＬＰＬ）
にかえてアンバーライトＸＡＤ−７に同様に固定化し
た。この固定化ＬＰＬを内径２．２cmのカラムに高さ１
５cmに充填し、以下参考例２と同様の操作を行い、イン
ドリン−２−カルボン酸アミル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａの不斉
加水分解と生成物の分離を１０回くり返して行った。そ
の結果、各回のリン酸緩衝液画分から、比旋光度〔α〕
25 D ＋１９．８°（ｃ＝１．０，ＤＭＦＡ）から〔α〕
25 D ＋２２．３°（ｃ＝１．０，ＤＭＦＡ）を有する
（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−IIを１．
２６ｇ〜１．３２ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−Ｉａからの収率７２
％〜７６％〕の範囲で得た。また各回のヘキサン溶出画
分から比旋光度〔α〕25 D −２５．１°（ｃ＝１．０，
ＤＭＦＡ）から〔α〕25 D −２７．５°（ｃ＝１．０，
ＤＭＦＡ）を有する（Ｒ）−インドリン−２−カルボン
酸（Ｒ）−IIを１．０３ｇ〜１．１１ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−
Ｉａからの収率５９％〜６４％〕の範囲で得た。
性をもつリポプロテイン リパーゼアマノ３（ＬＰＬ）
にかえてアンバーライトＸＡＤ−７に同様に固定化し
た。この固定化ＬＰＬを内径２．２cmのカラムに高さ１
５cmに充填し、以下参考例２と同様の操作を行い、イン
ドリン−２−カルボン酸アミル（Ｒ，Ｓ）−Ｉａの不斉
加水分解と生成物の分離を１０回くり返して行った。そ
の結果、各回のリン酸緩衝液画分から、比旋光度〔α〕
25 D ＋１９．８°（ｃ＝１．０，ＤＭＦＡ）から〔α〕
25 D ＋２２．３°（ｃ＝１．０，ＤＭＦＡ）を有する
（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−IIを１．
２６ｇ〜１．３２ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−Ｉａからの収率７２
％〜７６％〕の範囲で得た。また各回のヘキサン溶出画
分から比旋光度〔α〕25 D −２５．１°（ｃ＝１．０，
ＤＭＦＡ）から〔α〕25 D −２７．５°（ｃ＝１．０，
ＤＭＦＡ）を有する（Ｒ）−インドリン−２−カルボン
酸（Ｒ）−IIを１．０３ｇ〜１．１１ｇ〔（Ｒ，Ｓ）−
Ｉａからの収率５９％〜６４％〕の範囲で得た。
【００３８】実施例２ 参考例２において、酵素を変えて参考例２と同様の操作
を行い、表１の結果を得た。基質の負荷量は５ｇであ
る。
を行い、表１の結果を得た。基質の負荷量は５ｇであ
る。
【００３９】
【表１】
【００４０】実施例３ 下記の組成からなる栄養液体培地を調製し、２リットル
坂口フラスコに４００mlずつ分注後、１２０℃、１５分
殺菌した。 〔培地組成〕グルコース４％、イーストエキス０．３
％、肉エキス０．３％、ペプトン０．３％、リン酸二ア
ンモニウム０．２％、リン酸−カリウム０．１％（ｐＨ
６．８） これとは別に同じ組成の培地にて前培養をしたシュード
モナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa) IFO
3080の種菌液１０mlを前培養培地に接種し、３０℃、２
４時間振とうを行った。合計５本培養し、培養液計２リ
ットルを得た。この培養液を遠心し、菌体を集めた。こ
の湿菌体２０ｇを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
４０mlに懸濁し、それにウレタンプレポリマーＰＵ−３
（東洋ゴム工業株式会社製）２０ｇを加え、４０℃にて
すばやく攪拌後４℃に冷却し、３０分間放置した。こう
して得られた固定化微生物を約２mm角に切断し、内径
２．２cmのカラムに高さ１５cmに充填し、３３℃に保温
してｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝液を５０ml流して
から基質インドリン−２−カルボン酸アミル（Ｒ，Ｓ）
−Ｉａ ４ｇを負荷した。ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸
緩衝液を毎時４mlの流速で流し不斉加水分解反応を行わ
せ、カラムからの溶出液を１２mlずつフラクションコレ
クターで分取し、液体クロマトグラフィーで分析した。
このリン酸緩衝液画分には不斉加水分解され生成した親
水的なインドリン−２−カルボン酸のみが含まれてい
た。このリン酸緩衝液の画分１８０mlに飽和になるまで
硫酸アンモニウムを加え、更にｐＨを５．０に調整し、
等量の酢酸エチルで３回該インドリン−２−カルボン酸
を抽出した。酢エチ層を分離し、脱水後、減圧濃縮し、
乾固物をアセトン−ヘキサン（５ml−１ml）で再結し
た。真空で乾燥後、比旋光度〔α〕25 D ＋２３．７°
（ｃ＝１．０，ＤＭＦＡ）を有する（Ｓ）−インドリン
−２−カルボン酸（Ｓ）−IIが０．８９ｇ得られた。リ
ン酸緩衝液を１８０ml流した時点で、リン酸緩衝液に変
えてヘキサンを毎分１．０mlの流速で流し、カラム内の
固定化微生物の担体に吸着していたインドリン−２−カ
ルボン酸アミルを溶出した。ヘキサン溶液を１０mlずつ
フラクションコレクターで分取し、インドリン−２−カ
ルボン酸アミルを含む画分８０mlを濃縮し、比旋光度
〔α〕25 D −３．９°（ｃ＝１．０，エタノール）を有
するシロップ（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸アミ
ル（Ｒ）−Ｉａが１．１５ｇ得られた。得られた（Ｒ）
−Ｉａ １．１５ｇに１Ｎ苛性ソーダ１０mlを加え、室
温下約３時間加水分解を行い、反応液を１Ｎ塩酸でｐＨ
５．０に調整後、酢酸エチル１０mlで４回抽出操作を行
った。脱水処理後、減圧濃縮し、乾固物をアセトン−ヘ
キサン（２．５ml−０．５ml）で再結すると比旋光度
〔α〕25 D −２１．７°（ｃ＝１．０，ＤＭＦＡ）を有
する（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｒ）−IIが
０．５８ｇ得られた。
坂口フラスコに４００mlずつ分注後、１２０℃、１５分
殺菌した。 〔培地組成〕グルコース４％、イーストエキス０．３
％、肉エキス０．３％、ペプトン０．３％、リン酸二ア
ンモニウム０．２％、リン酸−カリウム０．１％（ｐＨ
６．８） これとは別に同じ組成の培地にて前培養をしたシュード
モナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa) IFO
3080の種菌液１０mlを前培養培地に接種し、３０℃、２
４時間振とうを行った。合計５本培養し、培養液計２リ
ットルを得た。この培養液を遠心し、菌体を集めた。こ
の湿菌体２０ｇを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
４０mlに懸濁し、それにウレタンプレポリマーＰＵ−３
（東洋ゴム工業株式会社製）２０ｇを加え、４０℃にて
すばやく攪拌後４℃に冷却し、３０分間放置した。こう
して得られた固定化微生物を約２mm角に切断し、内径
２．２cmのカラムに高さ１５cmに充填し、３３℃に保温
してｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝液を５０ml流して
から基質インドリン−２−カルボン酸アミル（Ｒ，Ｓ）
−Ｉａ ４ｇを負荷した。ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸
緩衝液を毎時４mlの流速で流し不斉加水分解反応を行わ
せ、カラムからの溶出液を１２mlずつフラクションコレ
クターで分取し、液体クロマトグラフィーで分析した。
このリン酸緩衝液画分には不斉加水分解され生成した親
水的なインドリン−２−カルボン酸のみが含まれてい
た。このリン酸緩衝液の画分１８０mlに飽和になるまで
硫酸アンモニウムを加え、更にｐＨを５．０に調整し、
等量の酢酸エチルで３回該インドリン−２−カルボン酸
を抽出した。酢エチ層を分離し、脱水後、減圧濃縮し、
乾固物をアセトン−ヘキサン（５ml−１ml）で再結し
た。真空で乾燥後、比旋光度〔α〕25 D ＋２３．７°
（ｃ＝１．０，ＤＭＦＡ）を有する（Ｓ）−インドリン
−２−カルボン酸（Ｓ）−IIが０．８９ｇ得られた。リ
ン酸緩衝液を１８０ml流した時点で、リン酸緩衝液に変
えてヘキサンを毎分１．０mlの流速で流し、カラム内の
固定化微生物の担体に吸着していたインドリン−２−カ
ルボン酸アミルを溶出した。ヘキサン溶液を１０mlずつ
フラクションコレクターで分取し、インドリン−２−カ
ルボン酸アミルを含む画分８０mlを濃縮し、比旋光度
〔α〕25 D −３．９°（ｃ＝１．０，エタノール）を有
するシロップ（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸アミ
ル（Ｒ）−Ｉａが１．１５ｇ得られた。得られた（Ｒ）
−Ｉａ １．１５ｇに１Ｎ苛性ソーダ１０mlを加え、室
温下約３時間加水分解を行い、反応液を１Ｎ塩酸でｐＨ
５．０に調整後、酢酸エチル１０mlで４回抽出操作を行
った。脱水処理後、減圧濃縮し、乾固物をアセトン−ヘ
キサン（２．５ml−０．５ml）で再結すると比旋光度
〔α〕25 D −２１．７°（ｃ＝１．０，ＤＭＦＡ）を有
する（Ｒ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｒ）−IIが
０．５８ｇ得られた。
【００４１】
【発明の効果】本発明によれば、基質インドリン−２−
カルボン酸エステルの加水分解と、生成物インドリン−
２−カルボン酸の分離、回収とを同時に行うことができ
る。
カルボン酸エステルの加水分解と、生成物インドリン−
２−カルボン酸の分離、回収とを同時に行うことができ
る。
Claims (8)
- 【請求項１】 一般式Ｉ 【化１】 （式中、ＲはＣ2 〜Ｃ8 の脂肪族炭化水素基を表わす）
で表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸
エステルと、疎水性の担体に固定化された立体選択的エ
ステラーゼ活性を有するシュードモナス（Pseudomonas)
属又はアスペルギルス(Aspergillus) 属に属する微生物
由来の酵素を用いた固定化酵素もしくはシュードモナス
（Pseudomonas)属に属する微生物を用いた固定化微生物
とを接触、反応させて、構造式（Ｓ）−II 【化２】 で表わされる光学活性（Ｓ）−インドリン−２−カルボ
ン酸と、構造式（Ｒ）−Ｉ 【化３】 （Ｒは前記と同じ）で表わされる光学活性インドリン−
２−カルボン酸エステルとに不斉加水分解し、親水性の
インドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−IIを水または緩衝
液で回収、採取後、固定化用担体に吸着、保持されてい
るインドリン−２−カルボン酸エステル（Ｒ）−Ｉを低
極性有機溶剤で溶出、採取することを特徴とする光学活
性インドリン−２−カルボン酸の製造方法。 - 【請求項２】 不斉加水分解をカラムに充填した固定化
酵素もしくは固定化微生物で行う請求項１記載の製造方
法。 - 【請求項３】 不斉加水分解を回分式で行う請求項１記
載の製造方法。 - 【請求項４】 疎水性を持つ酵素或いは微生物の固定化
用担体が、合成吸着剤、疎水クロマトグラフィー用樹
脂、疎水性光架橋性樹脂又は疎水基を化学結合させて導
入した高分子物質である請求項１乃至３のいずれかの項
記載の製造方法。 - 【請求項５】 一般式Ｉ 【化４】 （式中、ＲはＣ2 〜Ｃ8 の脂肪族炭化水素基を表わす）
で表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸
エステルと、疎水性の担体に固定化された立体選択的エ
ステラーゼ活性を有するシュードモナス（Pseudomonas)
属又はアスペルギルス(Aspergillus) 属に属する微生物
由来の酵素を用いた固定化酵素もしくはシュードモナス
（Pseudomonas)属に属する微生物を用いた固定化微生物
とを接触、反応させて、構造式（Ｓ）−II 【化５】 で表わされる光学活性（Ｓ）−インドリン−２−カルボ
ン酸と、構造式（Ｒ）−Ｉ 【化６】 （Ｒは前記と同じ）で表わされる光学活性インドリン−
２−カルボン酸エステルとに不斉加水分解し、親水性の
インドリン−２−カルボン酸（Ｓ）−IIを水または緩衝
液で回収、採取後、固定化用担体に吸着、保持されてい
るインドリン−２−カルボン酸エステル（Ｒ）−Ｉを低
極性有機溶剤で溶出、採取し、更に（Ｒ）−Ｉを加水分
解して構造式（Ｓ）−IIの対掌体である光学活性インド
リン−２−カルボン酸（Ｒ）−IIを生成させ、採取する
ことを特徴とする光学活性インドリン−２−カルボン酸
の製造方法。 - 【請求項６】 不斉加水分解をカラムに充填した固定化
酵素もしくは固定化微生物で行う請求項５記載の製造方
法。 - 【請求項７】 不斉加水分解を回分式で行う請求項５記
載の製造方法。 - 【請求項８】 疎水性を持つ酵素或いは微生物の固定化
用担体が、合成吸着剤、疎水クロマトグラフィー用樹
脂、疎水性光架橋性樹脂又は疎水基を化学結合させて導
入した高分子物質である請求項５乃至７のいずれかの項
記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13953593A JPH0779712B2 (ja) | 1993-05-17 | 1993-05-17 | 固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13953593A JPH0779712B2 (ja) | 1993-05-17 | 1993-05-17 | 固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59214725A Division JPH0616718B2 (ja) | 1984-10-13 | 1984-10-13 | 固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06296499A JPH06296499A (ja) | 1994-10-25 |
| JPH0779712B2 true JPH0779712B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=15247544
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13953593A Expired - Lifetime JPH0779712B2 (ja) | 1993-05-17 | 1993-05-17 | 固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0779712B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100463903C (zh) * | 2003-11-26 | 2009-02-25 | Sk股份有限公司 | 使用水解酶制备(s)-二氢吲哚-2-羧酸和(s)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100378741B1 (ko) * | 2000-06-01 | 2003-04-07 | 에스케이 주식회사 | 효소를 이용하여 R-폼 또는 S-폼의 α-치환 헤테로싸이클릭 카르복실산 및 이와 상반되는 광학특성을 갖는 α-치환 헤테로싸이클릭 카르복실산 에스테르를 제조하는 방법 |
| WO2001092553A1 (en) * | 2000-06-01 | 2001-12-06 | Sk Corporation | Method for optically resolving a racemic alpha-substituted heterocyclic carboxylic acid using enzyme |
-
1993
- 1993-05-17 JP JP13953593A patent/JPH0779712B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100463903C (zh) * | 2003-11-26 | 2009-02-25 | Sk股份有限公司 | 使用水解酶制备(s)-二氢吲哚-2-羧酸和(s)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06296499A (ja) | 1994-10-25 |
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