JPH0578310B2

JPH0578310B2 -

Info

Publication number: JPH0578310B2
Application number: JP59211986A
Authority: JP
Inventors: Shigeki Hamaguchi; Yoshio Nakamura; Masanori Asada; Hidetoshi Kutsuki; Takehisa Oohashi; Kyoshi Watanabe; Kenji Takahara
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1984-10-09
Filing date: 1984-10-09
Publication date: 1993-10-28
Also published as: JPS6192595A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、一般式【式】（式中、ＲはC₂〜C₈の脂肪族炭化水素基）で
表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボ
ン酸エステルを不斉的に加水分解して、構造式
（Ｒ）− 【式】で表わされる光学活性（Ｒ）−インドリン−２−
カルボン酸を生成させる立体選択的エステラーゼ
活性を有するバチルス（Bacillus）属に属する微
生物或いはバチルス（Bacillus）属もしくはアス
ペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物又
は哺乳動物臓器由来の酵素を作用させることによ
り、ラセミ体を光学活性な化合物インドリン−
２−カルボン酸（Ｒ）− と一般式（Ｓ）− 【式】（Ｒは前記と同じ）で表わされる光学活性イン
ドリン−２−カルボン酸エステルとに光学分割
し、夫々の光学活性体を分離、採取し、更に必要
に応じ、採取した（Ｓ）− を加水分解して（Ｒ）
− の対掌体（Ｓ）− を生成させ、採取するこ
とを特徴とする光学分割によるインドリン−２−
カルボン酸エステルの製造方法に関する。本発明は、使用する立体選択的エステラーゼを
選ぶことにより、（Ｒ）−インドリン−２−カルボ
ン酸と（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸エス
テル、及び（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸
を随意採取することができる。これら光学活性インドリン−２−カルボン酸類
化合物は種々医薬品の原料となりうる。例えば、
（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸はアンジオテ
ンシン変換酵素の阻害剤として有効な血圧降下
剤である（Ｓ）−１−〔（Ｓ）−３−メルカプト−２
−オキソプロピル〕−インドリン−２−カルボン
酸【式】に利用できる〔文献 J.Med.Chem.，26，394
（1983）〕。（従来の技術）これら光学活性なインドリン−２−カルボン酸
類の製造については、下記に示すような光学分割
剤を用いる方法が知られている。【化】（文献：特開昭57−81460号公報）【化】〔文献：M.Vicent etal.，Tetrahedron
Letlers，23，1677（1982）〕【化】（但し、母液側から（Ｓ）体を抽出）〔文献：J.Med.Chem.，26，1267（1983）〕（発明が解決しようとする問題点）これら分割剤を用いた光学分割法は操作が煩雑
であり、大量生産に適した簡便な方法により光学
活性インドリン−２−カルボン酸又は光学活性イ
ンドリン−２−カルボン酸エステルを得る方法の
開発が望まれていた。（問題点を解決するための手段及び作用効果）本発明者らは、インドリン−２−カルボン酸の
カルボン酸部位を種々アルコールを用いてエステ
ル化し、このエステル体に微生物菌体或いは酵素
を作用させて不斉加水分解を行えば光学活性体を
取得できると考え、検討を重ねてきた。その結
果、バチルス（Bacillus）属又はアスペルギルス
（Aspergillus）属に属する微生物或いは該微生物
から得られる酵素、又は哺乳動物臓器由来の酵素
を（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸エス
テルに作用させ不斉的に加水分解し、（Ｒ）−イン
ドリン−２−カルボン酸と（Ｓ）−インドリン−
２−カルボン酸エステルを生成させた後、有機溶
媒で分割、抽出することにより（Ｒ）−インドリ
ン−２−カルボン酸（Ｒ）− と（Ｓ）−インドリ
ン−２−カルボン酸エステル（Ｓ）− を夫々採
取することができること、更に採取した（Ｓ）−
をアルアリ加水分解又は酵素分解を行つて
（Ｓ）− を生成させ、採取することができること
を見い出し、本発明を完成した。以下に、本発明
を更に詳細に説明する。本発明の基質として用いられる、一般式【式】で表わされるインドリン−２−カルボン酸エステルは、Ｒが
C₂〜C₈の脂肪族炭化水素基の化合物であり、好
ましくはエチル、ブチル、アミル、ヘキシル基か
らなるエステルである。インドリン−２−カルボン酸エステルは次の
ようにして得られる。即ち（Ｒ，Ｓ）−インドリ
ン−２−カルボン酸に溶媒と反応試剤とを兼ねた
アルコールを加え、インドリン−２−カルボン酸
の濃度５〜20％（ｗ／ｖ）の範囲で、強酸性下、
50℃〜還流温度の範囲で１〜５時間縮合反応を行
う。更に、この反応液をPH7.0に調整後、減圧濃
縮により過剰のアルコールを除去する。濃縮液に
水又は飽和重炭酸ソーダを加え、酢酸エチル又は
ヘキサン等のような疎水性有機溶媒を用いて抽出
し、更に濃縮すれば高純度の（Ｒ，Ｓ）−インド
リン−２−カルボン酸エステルが得られる。ラセミ体を不斉的に加水分解してＲ− を生
成させる立体選択的なエステラーゼを有する微生
物としては、例えばバチルス（Bacillus）属或い
はアスペルギルス（Aspergllus）属等に属する微
生物があり、更に詳しくは、バチルス・サブチリ
ス（Bacillus subtilis）IFO 3013或いはアスペル
ギルス・メレウス（Aspergillus melleus）IFO
4420）がある。これら微生物の培養は、微生物が生育できる栄
養培地であれば良く、例えばグルコース、ペプト
ン、酵母エキス、肉エキス等から成る栄養培地が
用いられる。培地中の培養温度は10〜40℃、好ま
しくは25〜35℃であり、PHは３〜８、好ましくは
６〜７であり、好気的に培養し、通常24〜48時間
行えば良い。インドリン−２−カルボン酸エステルの微生物
による不斉加水分解反応においては、培養の開始
と同時に培地中と基質即ち化合物を添加し、培
養と並行して加水分解を行う方法、培養により得
られた菌体含有培養液に化合物を添加する、あ
るいは培養後、遠心分離または濾過を行つて得た
菌体を緩衝液に懸濁させた菌体懸濁液中で、化合
物と接触させて加水分解を行う方法等がある
が、望ましくは、菌体を遠心分離あるいは濾過等
で濃縮後、高濃度菌体懸濁液とし、このものに化
合物を添加する方法が反応後の生産物回収の立
場から秀れている。化合物の水に対する溶解度は一般に低いが、
攪拌すれば本反応にとつて支障とはならない。
又、例えばアセトン、メタノール等の有機溶媒や
界面活性剤等を反応に支障とならない程度加えて
も良い。反応条件は温度10〜40℃、好ましくは25〜35℃
の範囲であり、PHは５〜８、好ましくは6.5〜7.5
の範囲で行い、反応時間は基質及び菌体量の比に
より変化するが、未反応のエステルと生成物のカ
ルボン酸がモル比50％に達したところで止めれば
良い。但し、菌体の反応活性の観点から通常24〜
72時間で50％に達するように基質の添加量を決め
るのが望ましい。酵素を用いる方法としては、該微生物菌体を破
砕後、硫安分画やアセトン処理して得られる粗酵
素、或いは更にカラムクロマトグラフイー操作を
行い、得られる精製酵素が使用できる。市販され
ている酵素としては、（Ｒ）− を生成させる場
合、ビオプラーゼAL−15（起源；バチルス・サブ
チリス、長瀬産業(株)製）、プロテアーゼ「アマノ」
Ｐ（起源；アスペルギルス・メレウス、天野製薬
(株)製）、ステアプシン（豚膵臓、和光純薬(株)製）、
膵臓性消化酵素TA（天野製薬(株)製）などが使用
できる。不斉加水分解反応は、基質のラセミ体を濃度
２〜80％（ｗ／ｖ）の範囲で反応液に懸濁し、酵
素を適量、例えば酵素と基質の重量比として１：
５ないし１：1000の割合で加え、温度10〜40℃、
好ましく25〜35℃の範囲で反応を行い、高速液体
クロマトグラフイーによつてカルボン酸の生成量
及びカルボン酸エステルの減少量を測定し、反応
液中の（Ｓ）− と（Ｒ）− のモル比50％になつ
た時点で反応を止めれば良い。また加水分解を行
う際のPH範囲は４〜8.5であれば良いが、加水分
解反応が進むに従い、反応液中のPHが酸性側に傾
くので、中和剤例えばNaOH溶液等でPHを６〜
７に保持するのが望ましい。更に、上記の不斉加
水分解反応を、例えば微生物菌体或いは酵素を固
定化させることにより繰り返し行うこともでき
る。微生物或いは酵素を用いて不斉加水分解した
後、反応液中（Ｒ）− と（Ｓ）− を分離する方
法としては、疎水性の有機溶剤例えばヘキサン、
シクロヘキサン、トルエン等で疎水性の光学活性
インドリン−２−カルボン酸エステル（Ｓ）−
のみを抽出し、親水性の光学活性インドリン−２
−カルボン酸（Ｒ）− と容易に分離することが
できる。分離して得られた光学活性インドリン−２−カ
ルボン酸エステルは、そのまま濃縮すれば高光学
純度のエステル体で得られるが、更に次のように
して光学活性インドリン−２−カルボン酸とする
ことができる。即ち、光学活性インドリン−２−
カルボン酸エステル（Ｓ）− を室温下、PH10〜
13.5の範囲で２〜５時間アルカリ加水分解を行え
ば（Ｓ）− が生成する。また、（Ｓ）− を加水分解する能力を有する酵
素、例えばリポプロテインリパーゼアマノ３
を作用させて前記酵素による加水分解条件下に加
水分解を行えば、（Ｓ）− を得ることができる。このようにして得られた加水分解液はPHを４〜
６、好ましくは5.0付近に調整後、塩化メチレン、
酢酸エチル等の有機溶媒で抽出し、濃縮後、アセ
トン等の有機溶媒中で晶析することにより高光学
純度の（Ｓ）− が得られる。一方、抽出分離の際、水層側に残つている光学
活性インドリン−２−カルボン酸も上記した如
く、PH４〜６、好ましくは5.0付近に調整後、同
様の抽出精製操作を行うことにより高光学純度の
（Ｒ）− を容易に得ることができる。なお微生物菌体を用いる不斉加水分解反応で
は、有機溶媒で抽出分離した後、水層側に菌体が
残るが、引き続きPHを下げて有機溶媒抽出操作を
行えば、目的物光学活性インドリン−２−カルボ
ン酸を採取するのに支障とはならない。また微生
物菌体を遠心もしくは濾過によつて除去した後、
前記の方法に基づいて、インドリン−２−カルボ
ン酸とインドリン−２−カルボン酸エステルとを
分離、抽出することができる。（実施例）以下、実施例により本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。参考例１（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸アミ
ルの製造（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸（Ｒ，
Ｓ）− 50ｇをアミルアルコール500mlに溶解し、
更に濃塩酸100mlを添加し、95〜100℃の範囲で３
時間、縮合反応を行つた。反応後、一旦冷却して
から10％苛性ソーダ液でPHを7.0に調整した。更
に過剰量のアミルアルコール及び水を減圧濃縮中
により除去した。濃縮液中には、目的物の（Ｒ，
Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸アミル−（Ｒ，
Ｓ）−ａ及び無機塩が含まれている。この濃縮
液に酢酸エチル１を加え、飽和重炭酸ソーダ水
200mlで２回（計400ml）洗浄後、酢酸エチル層を
濃縮したところ（Ｒ，Ｓ）−ａが6.08ｇ、85％
の収率で得られた。実施例１ 100mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に、ステ
アプシンを1.0ｇ及び基質（Ｒ，Ｓ）−インドリン
−２−カルボン酸アミルａ【式】10ｇを添加し、1N NaOH溶液でPHを7.0に調整しながら、攪拌下、
30℃で24時間不斉加水分解反応を行つた。この反
応液を100mlのヘキサンで２回抽出操作を行い、
ヘキサン層を無水硫酸ソーダで脱水後、減圧濃縮
したところ、比旋光度〔α〕²⁵ _D＋5.8°（ｃ＝1.0、エ
タノール）を有するシロツプ（Ｓ）−ａが4.7ｇ
（Ｒ，Ｓ）−ａからの収率94％）得られた。¹H
NMR（90MHz）測定値は次の通りであつた。¹ H NMR（CDCl₃）δppm：0.8〜1.8（9H，ｍ，
CH₃CH₂CH₂ CH ₂−），3.2〜3.45（2H，ｄ，−
CH₂Ｏ−），4.0〜4.4（4H）， 6.45〜7.05（4H，ｍ，Ar−）得られた（Ｓ）−Iaの4.7ｇを25mlの1N NaOH
溶液に添加し、室温下、約３時間加水分解を行
い、反応液を1N塩酸でPH5.0に調整後、酢酸エチ
ル50mlで４回抽出操作を行つた。更に無水硫酸ソ
ーダで脱水処理後、減圧濃縮し、乾固物をアセト
ン−ヘキサン（５ml−１ml）で再結する比旋光度
〔α〕²⁵ _D＋32.4°（ｃ＝1.0、ジメチルホルムアミド）
（文献値、J.Med.Chem.，26，394（1983），〔α〕²⁵
_Ｄ＋34.5°（ｃ＝1.0、ジメチルホルムアミド）を有
する白色の粉末（Ｓ）−インドリン−２−カルボ
ン酸（Ｓ）− が2.45ｇ（（Ｒ，Ｓ）−ａより収
率69％）得られた。¹ H NMR（90MHz）測定値は次の通りであつ
た。 ¹H NMR（DMSO−d6）δppm：2.85〜3.45
（2H），4.10〜4.35（1H），6.40〜7.05（4H，ｍ，
Aryl），7.2〜9.0（2H，broad）。一方、ヘキサン抽出後の水層を1N塩酸でPH5.0
に調整し、酢酸エチルを100mlづつ用いて４回抽
出を繰返し、以下（Ｓ）− の場合と同様の操作
を行い、（Ｒ）− が2.6ｇ（（Ｒ，Ｓ）−ａから
の収率74％）得られた。比旋光度〔α〕²⁵ _D−33.1°
（ｃ＝1.0、ジメチルホルムアミド）であつた。実施例２〜６基質及び酵素をかえて、実施例１と同様の操作
を行い、表１の結果を得た。なお実施例５の基質であるインドリン−２−カ
ルボン酸ブチルｂの¹H NMR（90MHz）測定値
は以下の通りであつた。¹ H NMR（CDCl₃）δppm：0.8〜1.8（7H，ｍ，
CH₃CH₂CH₂−），3.25〜3.4（2H，ｄ，−CH₂Ｏ
−），4.05〜4.45（4H），6.55〜7.1（4H，ｍ，Ar
−）。また実施例６の基質であるインドリン−２−カ
ルボン酸エチルｃの¹H NMR（90MHz）測定値
は次の通りであつた。 Ic：¹H NMR（CDCl₃）δppm：1.1〜1.4（3H，
ｔ，CH₃），3.2〜3.4（2H，ｄ，CH₃CH₂Ｏ−），
4.0〜4.4（4H），6.55〜7.1（4H，ｍ，Ar−）。【表】実施例７〜８実施例７のバチルス・サブチリスは、実施例６
と同様に培養し、実施例８のアスペルギルス属の
微生物の培養はグルコース8.0％、ポリペプトン
1.0％、イーストエキス0.5％、リン酸二アンモニ
ウム0.2％、リン酸−カリウム0.1％（PH6.5）の培
地を用い、温度を28℃とした他は実施例６と同様
に行つた。各菌株は、培養後、バチルス・サブチリスは遠
心分離にて、アスペルギルス層の微生物は濾過
で、それぞれ菌体を集め、0.1Mリン酸緩衝液PH
7.0に懸濁し、基質（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−
カルボン酸アミルａを2.0ｇ添加した。これを
500ml容器内で攪拌下、1N NaOH溶液でPHを7.0
に調整しながら、30℃、18時間反応させた。反応
後、遠心分離して得た上清を各200mlのヘキサン
で４回抽出分離を行い、次いで実施例１に準じて
同様の操作を行い、表２に示す結果を得た。【表】（発明の効果）本発明によれば、立体選択性をもつ加水分解酵
素エステラーゼ又は、同加水分解能を有する微生
物を適宜選んで使用することにより、（Ｒ，Ｓ）−
インドリン−２−カルボン酸エステルから該エス
テルの光学活性体の（Ｓ）体を、あるいは光学活
性なインドリン−２−カルボン酸の（Ｒ）体もし
くは（Ｓ）体を得ることが出来る。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式【式】（式中、ＲはC₂〜C₈の脂肪族炭化水素基）で
表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボ
ン酸エステルを不斉的に加水分解して、構造式
（Ｒ）− 【式】で表わされる光学活性（Ｒ）−インドリン−２−
カルボン酸を生成させる立体選択的エステラーゼ
活性を有するバチルス（Bacillus）属に属する微
生物或いはバチルス（Bacillus）属もしくはアス
ペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物又
は哺乳動物臓器由来の酵素を作用させることによ
り、ラセミ体を光学活性な化合物インドリン−
２−カルボン酸（Ｒ）− と一般式（Ｓ）− 【式】（Ｒは前記と同じ）で表わされる光学活性イン
ドリン−２−カルボン酸エステルとに光学分割
し、夫々の光学活性体を分離、採取することを特
徴とする光学分割によるインドリン−２−カルボ
ン酸の製造方法。２一般式【式】（式中、ＲはC₂〜C₈の脂肪族炭化水素基）で
表わされる（Ｒ，Ｓ）−インドリン−２−カルボ
ン酸エステルを不斉的に加水分解して、構造式
（Ｒ）− 【式】で表わされる光学活性（Ｒ）−インドリン−２−
カルボン酸を生成させる立体選択的エステラーゼ
活性を有するバチルス（Bacillus）属に属する微
生物或いはバチルス（Bacillus）属もしくはアス
ペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物又
は哺乳動物臓器由来の酵素を作用させることによ
り、ラセミ体を光学活性な化合物インドリン−
２−カルボン酸（Ｒ）− と一般式（Ｓ）− 【式】（Ｒは前記と同じ）で表わされる光学活性イン
ドリン−２−カルボン酸エステルとに光学分割
し、夫々の光学活性体を分離、採取し、さらに
（Ｓ）− を加水分解して化合物（Ｒ）− の対掌
体である光学活性インドリン−２−カルボン酸
（Ｓ）− を生成させ、採取することを特徴とする
光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方
法。