JP6720420B2 - メチロピラ及びその選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用 - Google Patents
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Description
(1)細胞固定化方法によって前記メチロピラcxzy−L013の菌液に処理を行い、固定化分割酵素を含む固定化菌剤を得るステップと、
(2)(R,S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸エチルを基質として、一定量の水を加えて前記固定化菌剤と分割反応させ、(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸エチルを得るステップと、
(3)固定化エステル加水分解酵素による加水分解又はアルカリによる加水分解によって(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩を得るステップと、を含む。
グリセリンチューブにおけるメチロピラcxzy−L013菌株でLB斜面試験管に画線し、30℃で2〜3日間培養した。
斜面の菌体をシード培地に接種し、30℃で2〜3日間培養し、シード液を得た。前記シード培地の濃度配合は、MgSO4・7H2O 1.0g/L、K2HPO4 1.8g/L、(NH4)2SO4 1.0g/L、粉末酵母エキス5.0g/L、体積分率75%のメチルアルコール溶液5.0mL/L(接種前加入)であり、アンモニア水でpH7.0に調節した。
シード液を接種量1〜10v/v%で発酵缶に接種して発酵温度30℃で発酵する。アンモニア水でpH6.5〜7.0に調節し、0.5〜1vvmの通気量で、100〜1000r/minで機械的に撹拌し、発酵過程において濃度5.0mL/Lの75%メチルアルコールを間接的に追加し、発酵期間は3〜4日間である。pHが低下しなくて上昇する場合、缶を開けて菌体を収集すれば良い。この場合、OD600≧40であり、菌体の湿重は70〜90g/Lに達することができる。
A=W0/(W1−W2)×100%
の式によって算出される。
(式において、Aは固定化分割酵素の酵素活性の回収率であり、W1は追加された遊離酵素の全活性であり、W2は固定化後の上澄みにおける酵素の全活性であり、W0は固定化分割酵素の全活性である。)
B=(W1−W2)/W1×100%
の式によって算出される。
(式において、Bは固定化分割酵素の吸着率であり、W1は追加された遊離酵素の全活性であり、W2は固定化後の上澄みにおける酵素の活性である。)
メチロピラcxzy−L013(Methylopila Sp.cxzy−L013)は、中国典型培養物保存センター(CCTCC)に保存された(所在地:中国武漢大学、430072、保存日付:2016年9月18日、保存番号:CCTCC NO.M2016494)。
実施例1で得られたメチロピラcxzy−L013を更に培養して活性化させ、発酵させてメチロピラcxzy−L013の菌液を得た。具体的なステップは以下のとおりである。
グリセリンチューブにおけるメチロピラcxzy−L013でLB斜面試験管に画線し、30℃で2〜3日間培養した。
斜面の菌体をシード培地に接種し、30℃で2〜3日間培養し、シード液を得た。前記シード培地の濃度配合は、MgSO4・7H2O 1.0g/L、K2HPO4 1.8g/L、(NH4)2SO4 1.0g/L、粉末酵母エキス5.0g/L、体積分率75%のメチルアルコール溶液5.0mL/L(接種前加入)であり、アンモニア水でpH7.0に調節した。
シード液を7L発酵缶に接種して発酵させる。接種量は100mLであり、発酵温度は30℃であり、発酵液の初期体積は5Lであり、アンモニア水でpH6.5〜7.0に調節し、通気量は0.5vvmであり、DO≧30%になるように機械的撹拌を100r/minから900r/minに徐々に増加させ、発酵過程において濃度5.0mL/Lの75%メチルアルコールを間接的に追加し、3日間発酵し、pHが低下しなくて上昇する場合、缶を開けて菌体を収集すれば良い。この場合、OD600≧40であり、菌体の湿重は70〜90g/Lに達することができる。
実施例1のメチロピラcxzy−L013を利用し、以下のようなステップを含む方法によって立体選択的に分割して(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩を調製した。
本実施例は実施例3に基くが、ステップ(1)における細胞固定化方法のステップは更に改良された。好適例として、湿菌体質量分率50%の菌懸濁液20gをギ酸アンモニウム緩衝液100mL(pH7.0)に溶かし、撹拌して均一に混合し、ケイソウ土又は活性炭0.4〜0.8gを加え、5%ポリエチレンイミン3〜4.5mLを加えて1時間架橋し、そして25%グルタルアルデヒド1〜1.5mLを加えて1時間架橋し、最後に真空吸引ろ過して固定化分割酵素を含む固定化菌剤を得、水道水で2回洗浄して吸引ろ過し、4℃で冷蔵保存した。固定化分割酵素の酵素活性の回収率は90%以上であり、吸着率は95%以上である。
本実施例は実施例3の方法に基いて、固定化エステル加水分解酵素として日本天野エンザイム株式会社製のProtin AP Conc.脂肪酵素を選択して利用し、(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩を得た。
細胞固定化菌剤であり、この菌剤によれば、(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸エチルをラセミ体の溶液から分割させることができ、固定化分割酵素の酵素活性の回収率は90%以上であり、吸着率は95%以上であり、固定化菌剤を繰り返して利用できる回数は35回以上である。前記細胞固定化菌剤は以下のような方法によって得られたものである。
本実施例は実施例3に基いて、ステップ(2)における(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸エチルの分割ステップを更に説明する。
実施例8〜実施例13の分割方法は実施例7とほぼ同じであるが、細胞固定化菌剤の投入量、利用基質のトルエン溶液における濃度、基質の反応系における濃度は異なり、表3から見れば、異なる実施例の分割効果の差が分かる。
機器:UV検出器付き高速液体クロマトグラフィー
クロマトカラム:CHIRALPAK AS−H 250×4.6mm 5μm
移動相:n−ヘキサン:イソプロピルアルコール:トリフロロ酢酸=80:20:0.2(%V/V/V)
移動速度990.8mL/min、波長:210nm、カラム温度:30℃、運転時間:30min、サンプリング量:20μL
希釈液:移動相、ブランク液:希釈液
によって算出される。
(式において、[C]Sと[C]Rはそれぞれクロマトグラムが測定されたサンプルにおけるS型基質とR型基質の含有量であり、e.e.s(%)は分割反応による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸エチルの鏡像体過剰率であり、CPは生成物のモル濃度であり、CSは残された基質のモル濃度であり、C(%)は転化率である。
本発明は固定化方法において吸着剤と架橋剤を共に利用し、グルタルアルデヒドと共にポリエチレンイミンを利用して架橋効果を向上させ、細胞の固定効果が顕著に高めた。更に高濃度の有機基質と一緒に酵素触媒反応に参与する場合、工業的生産という目的を実現し易い。
検証方法:実施例4で得られた固定化菌剤5gを触媒としてラセミ(R,S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸エチル100mLを反応させ、前記ラセミ体基質のトルエンにおける含有量は500g/Lであり、反応系は300mLであり、30mLのNa2CO3溶液(20%、V/V)の消費を反応終点とし、反応が終了した後の固定化菌剤を吸引ろ過し、吸引ろ過された固定化菌剤を同じ反応系に投入し、同じ反応条件で次の反応を行った。
(付記1)
分類によってメチロピラ(Methylopila Sp.)cxzy−L013菌株と名づけ、2016年9月18日にCCTCC NO. M2016494という保存番号で中国典型培養物保存センターに保存されたメチロピラ。
メチロピラは、2016年9月18日でCCTCC NO.M2016494という保存番号で中国典型培養物保存センターに保存されたメチロピラcxzy−L013菌株である、前記メチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
(1)細胞固定化方法によってメチロピラの菌液に処理を行い、固定化分割酵素を含む固定化菌剤を得るステップと、
(2)(R,S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸エチルを基質とし、一定量の水を加えて前記固定化菌剤と分割反応させ、(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸エチルを得るステップと、
(3)固定化エステル加水分解酵素による又はアルカリによる加水分解によって(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩を得るステップと、
を含むことを特徴とする、付記2に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
前記メチロピラの菌液は、メチロピラを利用して斜面培養、シード液培養、接種発酵、濃縮というステップによって得られた50wt%以上の湿菌体を含む酵素含有菌懸濁液であることを特徴とする、付記3に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
前記細胞固定化方法は、メチロピラの菌液を緩衝液に溶かし、一種の吸着剤及び/又は一種の架橋剤を少なくとも加え、撹拌して吸引ろ過し、固定化菌剤を得るものであり、
前記吸着剤は、ケイソウ土及び活性炭から選ばれるいずれか1種であり、
前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、トリレンジイソシアネート及びジアゾベンジジンから選ばれるいずれか1種であることを特徴とする、付記3に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
前記細胞固定化方法によって実現される固定化菌剤における固定化分割酵素の酵素活性の回収率は90%以上であり、吸着率は95%以上であり、固定化菌剤を繰り返して利用できる回数は35回であることを特徴とする、付記5に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
前記細胞固定化方法は、まず吸着剤を加え、撹拌して均一になるまで混合してから架橋剤を加えるものであることを特徴とする、付記6に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
前記架橋剤を加える時、ポリエチレンイミンを加えることを特徴とする、付記7に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
前記分割反応は、その温度が25〜37℃であり、15〜25v/v%の炭酸ナトリウム水溶液を滴下して反応過程においてpH6.5〜8.5になるように調節し、2〜15時間反応することを特徴とする、付記3に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
前記分割反応において、(R,S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸エチルの反応系における質量濃度は160〜500g/Lであることを特徴とする、付記9に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
前記固定化菌剤は湿重量で、反応系における投入濃度が5〜25g/Lであることを特徴とする、付記10に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
分割反応が終了した後、HPLC検出による鏡像体過剰率e.e.s(%)は99.5以上であり、転化率は49%以上であることを特徴とする、付記11に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
前記ステップ(2)の後、水相における(R)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸を回収し、ラセミ化とエステル形成によって出発物の基質を得ることを特徴とする、付記3に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
前記ステップ(3)において、固定化エステル加水分解酵素による加水分解によって(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩を得た後、濃縮結晶してその粗製品を得ることを特徴とする、付記3に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
前記ステップ(3)において、アルカリによる加水分解に用いられるアルカリ液は200〜400g/Lのイオン膜によるアルカリ液であり、反応pHが13以下に低下しないように、反応温度10℃〜20℃で基質の加水分解反応が終了するまで反応した後、濃縮結晶してその粗製品を得ることを特徴とする、付記3に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
Claims (15)
- 分類によってメチロピラ(Methylopila Sp.)cxzy−L013菌株と名づけ、2016年9月18日にCCTCC NO. M2016494という保存番号で中国典型培養物保存センターに保存されたメチロピラ。
- メチロピラは、2016年9月18日でCCTCC NO.M2016494という保存番号で中国典型培養物保存センターに保存されたメチロピラcxzy−L013菌株である、前記メチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
- (1)細胞固定化方法によってメチロピラの菌液に処理を行い、固定化分割酵素を含む固定化菌剤を得るステップと、
(2)(R,S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸エチルを基質とし、一定量の水を加えて前記固定化菌剤と分割反応させ、(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸エチルを得るステップと、
(3)固定化エステル加水分解酵素による又はアルカリによる加水分解によって(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩を得るステップと、
を含むことを特徴とする、請求項2に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。 - 前記メチロピラの菌液は、メチロピラを利用して斜面培養、シード液培養、接種発酵、濃縮というステップによって得られた50wt%以上の湿菌体を含む酵素含有菌懸濁液であることを特徴とする、請求項3に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
- 前記細胞固定化方法は、メチロピラの菌液を緩衝液に溶かし、一種の吸着剤及び/又は一種の架橋剤を少なくとも加え、撹拌して吸引ろ過し、固定化菌剤を得るものであり、
前記吸着剤は、ケイソウ土及び活性炭から選ばれるいずれか1種であり、
前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、トリレンジイソシアネート及びジアゾベンジジンから選ばれるいずれか1種であることを特徴とする、請求項3に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。 - 前記細胞固定化方法によって実現される固定化菌剤における固定化分割酵素の酵素活性の回収率は90%以上であり、吸着率は95%以上であり、固定化菌剤を繰り返して利用できる回数は35回であることを特徴とする、請求項5に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
- 前記細胞固定化方法は、まず吸着剤を加え、撹拌して均一になるまで混合してから架橋剤を加えるものであることを特徴とする、請求項6に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
- 前記架橋剤を加える時、ポリエチレンイミンを加えることを特徴とする、請求項7に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
- 前記分割反応は、その温度が25〜37℃であり、15〜25v/v%の炭酸ナトリウム水溶液を滴下して反応過程においてpH6.5〜8.5になるように調節し、2〜15時間反応することを特徴とする、請求項3に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
- 前記分割反応において、(R,S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸エチルの反応系における質量濃度は160〜500g/Lであることを特徴とする、請求項9に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
- 前記固定化菌剤は湿重量で、反応系における投入濃度が5〜25g/Lであることを特徴とする、請求項10に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
- 分割反応が終了した後、HPLC検出による鏡像体過剰率e.e.s(%)は99.5以上であり、転化率は49%以上であることを特徴とする、請求項11に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
- 前記ステップ(2)の後、水相における(R)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸を回収し、ラセミ化とエステル形成によって出発物の基質を得ることを特徴とする、請求項3に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
- 前記ステップ(3)において、固定化エステル加水分解酵素による加水分解によって(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩を得た後、濃縮結晶してその粗製品を得ることを特徴とする、請求項3に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
- 前記ステップ(3)において、アルカリによる加水分解に用いられるアルカリ液は200〜400g/Lのイオン膜によるアルカリ液であり、反応pHが13以下に低下しないように、反応温度10℃〜20℃で基質の加水分解反応が終了するまで反応した後、濃縮結晶してその粗製品を得ることを特徴とする、請求項3に記載のメチロピラの選択的分割による(S)−α−エチル−2−オキソ−1−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
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