CN109097412A - 一种生物法合成依折麦布中间体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物法合成依折麦布中间体的方法，以(4S)‑3‑[5‑(4‑氟苯基)‑1,5‑二氧代戊基]‑4‑苯基‑2‑恶唑烷酮为底物，采用酶法合成(4S)‑3‑[(5S)‑5‑(4‑氟苯基)‑5‑羟基戊酰基]‑4‑苯基‑1,3‑氧氮杂环戊烷‑2‑酮。采用膜反应器截留羰基还原酶，简化后续分离过程。针对膜生物反应器中辅酶再生困难等问题，通过加入NADH氧化酶过量表达的菌体，避免辅酶再生问题。本发明反应条件温和，反应速度快，成本低，操作稳定性好，转化率高，可达99.2％‑99.7％；制得的产物光学纯度高，适合工业化生产。

Description

一种生物法合成依折麦布中间体的方法

技术领域

本发明涉及一种医药中间体的制备方法，具体涉及一种生物法合成依折麦布中间体的方法。

背景技术

依折麦布是一种新型的抑制胆固醇吸收的降血脂药物，也是目前成功开发的第一个单环β内酰胺类胆固醇吸收抑制剂.临床证实依折麦布与他汀类联合用药在降脂及达到治疗目标水平上比他汀类单一用药更为安全和有效，他汀类药物在联用依折麦布后的多效性也得到了证实自上市以来，依折麦布的市场占有率和销售额强劲增长，因其良好的疗效和广阔的市场前景，引起国内外许多学者的兴趣。

依折麦布结构中有3个手性中心，两个手性中心在β-内酰胺上，另外一个是(S)-羟基的构建。构建(S)-羟基的方法为化学法或者生物法还原(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮，其中化学法得到的产物光学纯度较低，降低了产品品质；而生物法具有反应条件温和，反应转化率高，产物化学纯度和光学纯度高等优点。目前报道的生物催化酶主要有羰基还原酶。羰基还原酶在辅酶作用下就能催化底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮为(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮。但是，现有的羰基还原酶催化法仍然存在以下不足：(1)目前游离羰基还原酶反应结束后，需要采用活性炭等将羰基还原酶从反应体系中吸附出来，一方面，会有少量羰基还原酶残留在反应液中，且在后续精馏过程中也很难去除，从而影响了产品的品质；另一方面，活性炭在吸附羰基还原酶的同时也会吸附一部分(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮，从而影响产品的收率，尤其是增加了后处理的复杂程度。(2)目前固定化羰基还原酶方法，有效需要用化学法固载在载体上，酶活力损失大；其次酶占固定化酶中比例低于5％，增加了反应器体积，提高了投资成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种依折麦布中间体的生物法催化合成的制备方法，反应条件温和，反应速度快，酶易于和反应体系分离，避免了辅酶再生问题。成本低，产物得率高，光学纯度高，适合工业化生产。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种生物法合成依折麦布中间体的方法，包括如下步骤：

1)配制羰基还原酶和NADH氧化酶过量表达的菌体溶液；

2)将底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮加入到菌体溶液中。

所述步骤1)中的羰基还原酶浓度为1～50g/L，菌体浓度为4～80g/L。

以管式反应器为反应容器，管式反应器两端由膜材料封闭，管式反应器是由聚乙烯管材或不锈钢管材构成，管内径与管长比为1:5～1:20；所述膜材料为混合纤维酯微孔滤膜、硝酸纤维素滤膜或聚偏氟乙烯滤膜中的一种或两种以上。

所述步骤2)所述溶液的溶剂为缓冲溶液与异丙醇混合溶液，体积比例为1:2～4:1，底物浓度为5～30g/L，缓冲溶液为磷酸缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液，pH为7.5～8.5。

所述步骤1)所述的NADH氧化酶过量表达的菌体为商业化Lactococcus lactis菌株。

将菌体溶液加入到两端用膜材料封住的管式反应器中；管式反应器垂直放置；底物溶液于母液槽中泵出，通过管式反应器的底部端的膜材料加入管式反应器中，并通过管式反应器顶部端的膜材料循环回母液槽中；

以高效液相色谱检测底物转化率，当底物转化率高于99.2％时终止循环，停止反应。

本发明具有如下的有益效果：

(1)本发明将羰基还原酶和菌体悬浊液通过膜材料密封在管式反应器中，使得酶在反应体系充分和底物接触，提高了反应效率，用膜材料截留酶和菌体，使后续分离简单。

(2)本发明用NADH氧化酶过量表达的菌体代替辅酶及其再生过程，简化了生产流程。

(3)本发明转化率高，可达99.2％-99.7％；没有副反应存在，制得的产物光学纯度高。

(4)本发明反应条件温和，反应速度快，成本低，操作稳定性好，适合工业化生产。

具体实施方式

现在结合实施例对本发明作进一步详细的说明，所述羰基还原酶购自北京百奥莱博科技有限公司，牌号为YT534；所述菌体购自北纳生物，为Lactococcus lactis菌株。

实施例1

1)将羰基还原酶和菌体溶于磷酸缓冲溶液中，配制200mL浓度为3g/L的羰基还原酶和4g/L菌体悬浊液，pH值为7.0。将200mL悬浊溶液加入到200mL管式反应器中，两端用膜材料，管材为不锈钢，膜材料选用混合纤维酯微孔滤膜，管径和管长比为1：20，管式反应器保温在25℃；

2)将4g底物溶于200mL溶剂中(异丙醇：磷酸缓冲溶液体积比＝1:4)，并保温在25℃，溶剂pH值为7.5；

3)开动蠕动泵，将底物溶液从管式反应器底部加入到管式反应器中，流速为10mL/min，高效液相色谱检测反应进程，循环反应12h后转化率达到99.3％，纯度达到99.6％，收率92％；

实施例2-6与实施例1基本相同，不同之处如表1。

表1

从实施例可以看出，本申请在常温下进行，反应条件温和，转化率高达99.7％，产物纯度高达99.5％，具备反应速度快，成本低，操作稳定性好，适合工业化生产等优势。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (6)

1.一种生物法合成依折麦布中间体的方法，包括如下步骤：

1)配制羰基还原酶和NADH氧化酶过量表达的菌体溶液；

2)将底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮加入到菌体溶液中。

2.如权利要求1所述的生物法合成依折麦布中间体的方法，其特征在于：步骤1)中的羰基还原酶浓度为1～50g/L，菌体浓度为4～80g/L。

3.如权利要求1所述的依折麦布中间体的酶法催化合成的制备方法，其特征在于：以管式反应器为反应容器，管式反应器两端由膜材料封闭，管式反应器是由聚乙烯管材或不锈钢管材构成，管内径与管长比为1:5～1:20；所述膜材料为混合纤维酯微孔滤膜、硝酸纤维素滤膜或聚偏氟乙烯滤膜中的一种或两种以上。

4.如权利要求1所述的依折麦布中间体的酶法催化合成的制备方法，其特征在于：步骤2)所述溶液的溶剂为缓冲溶液与异丙醇混合溶液，体积比例为1:2～4:1，底物浓度为5～30g/L，缓冲溶液为磷酸缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液，pH为7.5～8.5。

5.如权利要求1所述的生物法合成依折麦布中间体的方法，其特征在于：步骤1)所述的NADH氧化酶过量表达的菌体为商业化Lactococcuslactis菌株。

6.如权利要求1所述的生物法合成依折麦布中间体的方法，其特征在于：

将菌体溶液加入到两端用膜材料封住的管式反应器中；；底物溶液于母液槽中泵出，通过管式反应器的底部端的膜材料加入管式反应器中，并通过管式反应器顶部端的膜材料循环回母液槽中；

以高效液相色谱检测底物转化率，当底物转化率高于99.2％时终止循环，停止反应。