CN105331589A - 可再生辅酶nad+的水型nadh氧化酶及其编码基因与应用 - Google Patents

可再生辅酶nad+的水型nadh氧化酶及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域中的NADH氧化酶，具体是一种可再生辅酶NAD+的水型NADH氧化酶及其编码基因与应用，该氧化酶是如SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸序列。采用本发明所述水型NADH氧化酶，可以利用该酶与甘油脱氢酶体外串联转化甘油生成1,3-二羟基丙酮，与化学方法制备1,3-二羟基丙酮相比，该方法具有反应条件温和，对环境友好，操作简单，易于放大等优势。

Description

可再生辅酶NAD+的水型NADH氧化酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域中的NADH氧化酶，具体是一种可再生辅酶NAD+的水型NADH氧化酶及其编码基因与应用，该氧化酶能够利用O2作为底物将NADH氧化为NAD+，同时生成副产物H2O。
背景技术
随着氧化还原酶在生物催化制备手性醇、手性羟酮、羟基酸、氨基酸等方面显示越来越重要的作用，在制药，食品，精细化工，农药等领域均表现出广泛的用途，对该类型的酶的研究也成为当今研究的热点之一。但是氧化还原酶在反应过程中，需要消耗一定量辅酶，大约80％的氧化还原酶的辅酶为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+/NADH)，使得这类辅酶在工业和科研上的需求随之剧增。然而，辅酶的价格是非常昂贵的，有时甚至比酶催化反应所得到的产物的价格还要高，而其重复利用性和稳定性却很低。辅酶再生是实现氧化还原酶催化反应的必需步骤，是关系到氧化还原酶工业化应用的关键。而对于很多氧化还原酶的应用来讲，辅酶再生面临巨大的挑战。
辅酶再生的方法主要有生物法、酶法、化学法、电化学法和光化学法。酶法原位再生辅酶由于操作简单、效率高专一性强，而且可与其它酶兼容，受到人们的青睐。酶法再生辅酶的方法中，应用于还原性辅酶(NAD(P)H)的再生已经比较成熟，如甲酸脱氢酶再生NADH和葡萄糖脱氢酶再生NADPH。而氧化性辅酶(NAD(P)+)的再生方法却很少，实现氧化性辅酶的再生，对于在生物催化过程中生产难以制备的酮类化合物或对应体纯的醇类化合物是非常关键的。目前应用比较多的方法主要有：醇脱氢酶还原丙酮生成异丙醇再生辅酶NAD+；乳酸脱氢酶还原丙酮酸生成乳酸再生辅酶NAD+；谷氨酸脱氢酶还原α-酮戊二酸生成谷氨酸使NAD+再生。但是这些方法仍然还难以满足工业化生产的需求，因为这些方法通常需要加入辅底物，并有辅产物生成，使下游提取过程更加困难，生产成本也大大增加，有时甚至会产生酶抑制现象影响反应效率。
最近几年，通过NADH氧化酶再生辅酶逐渐得到了人们的重视，NADH氧化酶(NADHoxidase,NOX,EC1.6.99.3)是一种黄素蛋白，在O2存在条件下，该酶催化NADH氧化为NAD+的同时O2还原为H2O或H2O2。根据O2还原后产物的不同，NOX可分为两类：一类还原为H2O2，反应过程产生2个电子的转移，称之为H2O2型NADH氧化酶；另一类还原为H2O，反应过程中产生4个电子的转移，称之为H2O型NADH氧化酶。H2O2型NADH氧化酶，由于产生的过氧化氢对氧化还原酶有失活作用，而且在应用过程中需要加入过氧化氢酶分解H2O2，这样使得反应体系更加复杂，因此在应用上该型酶受到一定限制。鉴于以上原因，H2O型NADH氧化酶的研究越来越受到人们的重视，因为它的产物为水，对反应体系基本没有多大影响，操作简单且容易分离，可用于再生NAD+，具有广阔的应用前景，是非常有潜力的氧化态辅酶再生体系之一。目前，国外已有不少关于不同来源的NOX的研究报道，但是能应用于工业化生产的H2O型NADH氧化酶还是比较少，所以挖掘开发更多新型高活性H2O型NADH氧化酶是非常有必要的，目前国内专门针对该类型酶的研究还比较少。
发明内容
本发明旨在提供一种可再生辅酶NAD+的水型NADH氧化酶及其编码基因与应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：可再生辅酶NAD+的水型NADH氧化酶，是如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。
上述水型NADH氧化酶的制备步骤为：
S1：将如SEQIDNO.2所示的水型NADH氧化酶编码基因插入到质粒中得到重组表达载体；
S2：将所述重组表达载体转移到宿主微生物中得到基因工程菌；
S3：培养所述基因工程菌得到重组NADH氧化酶，即本发明所述水型NADH氧化酶。
上述水型NADH氧化酶来源于戊糖乳杆菌LactobacilluspentosusATCC8041。所述水型NADH氧化酶具有如下酶学性质：(a)利用O2作为底物，将NADH氧化为NAD+，同时生成副产物H2O；(b)最佳pH为5.0～10.0、最佳温度为10～50℃情况下酶活最高；(c)通过SDS-PAGE测定的分子量为45-55kDa；(d)酶活最大为124U/mg，Km为99μM，kcat/km为62.6min-1μM-1；(e)与短乳杆菌L.breviDSM20054中获得的LbNox具有的64％氨基酸序列同源性。
另外，本发明提供了可再生辅酶NAD+的水型NADH氧化酶在甘油转化生成1,3-二羟基丙酮中的应用。
针对该应用，所述甘油转化生成1,3-二羟基丙酮的方法为：在水型NADH氧化酶、甘油脱氢酶及辅酶存在下，底物甘油发生氧化反应生成1,3-二羟基丙酮。其转化生成路线如下：
式中：glycerol指甘油；GlyDH指甘油脱氢酶；LpNox指水型NADH氧化酶；1,3-dihydroxyacetone指1,3-二羟基丙酮(DHA)。
优选的，该方法是在pH为5.0～10.0的磷酸缓冲液中实现的；另外，所述的辅酶为NADH及NAD+中的一种或两种以任意比例混合的混合物。还有，该方法的反应温度为10～50℃。
具体应用时，所述水型NADH氧化酶在反应体系中的用量为1-20U/mL。所述辅酶的加入量在反应体系中的用量为0.002-2.0mM。
采用本发明所述水型NADH氧化酶，可以利用该酶与甘油脱氢酶体外串联转化甘油生成1,3-二羟基丙酮，与化学方法制备1,3-二羟基丙酮相比，该方法具有反应条件温和，对环境友好，操作简单，易于放大等优势。
附图说明
图1为LpNox经蛋白纯化后聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
图2为LpNox最佳pH研究结果示意图。
图3为LpNox最适催化温度的研究结果示意图。
图4为LpNox温度稳定性的研究结果示意图。
图5为LpNox与甘油脱氢酶体外串联转化甘油生成1,3-二羟基丙酮的时间进程示意图。
具体实施方式
下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述。
SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(SK8141)购于生工生物工程(上海)股份有限公司。SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(SK8192)购于生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR扩增试剂dNTP，Buffer，Taq酶购于生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性内切酶BamHI、XhoI购于Takara；连接酶和ligationbuffer购于SCIENTIFIC；PCR引物购于生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA上样缓冲液，DNA标准分子量Marker购于生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白双染色Marker购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
下列实施中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
1.在本发明的下述实施例中，使用的大肠杆菌培养基配制方法如下：
(1)LB培养基
1L的LB液体培养基中加入10.0gNaCl，10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母浸粉，定容到1L后，用pH计检测其pH，一般显碱性，然后用5mol/L的NaOH慢慢调节pH至7.0。若是配置固体培养基，可在配好的液体培养基的基础上，按1.5％的含量加入琼脂粉。密封好后，用高压蒸汽灭菌锅在121℃下，灭菌30min，待冷却后放在4℃低温冰箱中保存待用。
(2)TB培养基
将下列组分溶解在0.9L水中：胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。将各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加入100mL灭过菌的磷酸缓冲液(2.31g的KH2PO4和12.54g的K2HPO4溶于100mL水中。)。
2.1,3-二羟基丙酮含量的检测方法:
取反应液液50μL，加水稀释至500μL，取稀释液离心后的上清液50μL，加入二苯胺溶液450μL，沸水浴加热14min，流水冷却。以二苯胺溶液为空白，于608nm处测吸光度，根据标准曲线计算反应液中产物1,3-二羟基丙酮的含量。
实验例1NADH氧化酶基因的筛选和分析
通过对NCBI基因数据库进行筛选和分析，确定在戊糖乳杆菌LactobacilluspentosusATCC8041基因组中与短乳杆菌NADH氧化酶具有较高同源性的蛋白基因序列为候选研究对象，基因序列SEQIDNO.2所示。
实验例2重组表达载体pET28a-LpNox和pET28a-GlyDH构建
根据基因序列(LpNox基因及GlyDH基因)设计引物，LpNox基因上游引物为CGCGGATCCATGAAAGTTATCGTAATTGGTTGTACTCAT，下游引物为CCGCTCGAGTTATTCCGTCACTTTTTCAGCCGC；GlyDH基因上游引物为CGCGGATCCATGGACCGCATTATTCAATCACCGG，下游引物为CCGCTCGAGTTATTCCCACTCTTGCAGGAAACGC，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。下划线部分为BamHI和XhoI酶切位点。再以戊糖乳杆菌基因组和大肠杆菌基因组为模板PCR扩增得到LpNox基因和GlyDH基因，琼脂糖凝胶电泳结果表明扩增得到的基因大小与理论值一致。将回收的LpNox基因，GlyDH基因和pET28a，用限制性内切酶BamHI和XhoI在37℃水浴中酶切2小时，经纯化回收的目的片段与质粒在T4连接酶的作用下室温过夜连接，得到重组表达载体pET28a-LpNox和pET28a-GlyDH。将重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，在含有卡纳抗性的平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单菌落PCR验证挑选阳性子。
可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得所述重组表达转化体。所述宿主微生物可以是本领域的各种常见宿主微生物，只要该微生物可以稳定的自行复制重组表达载体，且能有效的表达所携带的本发明的LpNox基因和GlyDH基因即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
实验例3大肠杆菌重组LpNox的表达及纯化
所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可以是本领域内常规的任何可使转化体生长并且产生本发明LpNox的培养基，对于大肠杆菌接种时优选LB培养基，扩培时优选TB培养基。培养方法和培养条件没有特殊限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行选择，只要能使转化体生长并且产生本发明LpNox即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。
对于大肠杆菌菌株本发明选用下述方法：将实施例2中构建好的菌株，接种至含卡纳的LB培养基中，37℃180r振荡培养8h，按2％的接种量接入装有50mLTB培养基的摇瓶中，37℃180r培养，当培养液的OD600达到0.6时加入终浓度为0.2mM的IPTG，20℃，180r诱导12h。4℃，8000r离心10min收集菌体，用100mMpH为7.0的磷酸钠缓冲液洗涤两次。将获得的菌体用100mMpH为7.0的磷酸钠缓冲液悬浮，冰浴中超声破碎，离心收集上清，即为LpNox的粗酶液。上清液中的重组蛋白经过镍柱进行纯化，500mM咪唑进行洗脱，获得纯化的LpNox，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果见图1。
实施例4LpNox酶活测定
利用酶标仪检测340nm吸光值的变化计算重组NADH氧化酶LpNox的酶活。
LpNox活力测定方法如下：于300μL孔板中加入295μL磷酸钾缓冲液，3μLNADH，2μL酶液，迅速混匀，在340nm波长下进行动力学循环光度测量，测得吸光度进行酶活的计算。
NADH氧化酶活力单位定义：在上述条件下，每分钟生成1μmolNAD+为一个酶活单位(U)。
公式：酶活(U)＝ΔA·(Ts/Sv)/(ε·min·L)
比活力(U/mg):ΔA·(Ts/Sv)/(ε·min·L·m)
其中:ε为1/mol/cm消光系数NADH为6220
ΔA：吸光度变化Ts：总反应体积
Sv：样品体积L：光径1cm
m:酶液中蛋白含量(mg)
实验例5LpNox酶学性质
接取种子液后，在20℃诱导12h，收取菌液后进行细胞超声破碎10min，8000g、4℃离心5min，取上清液在酶标仪上测定OD340nm，测定LpNox酶活,进行酶学性质表征。
(1)LpNox最佳pH测定
分别取pH为5、6、7、8、9、测定LpNox的酶活，绘制酶活随pH的变化曲线，比较在不同pH值条件下LpNox酶活的大小，确定LpNox的最适催化pH。实验结果如图2所示。
(2)LpNox最佳温度测定
分别取温度为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，测定LpNox的酶活，绘制酶活随温度的变化曲线，比较在不同温度条件下LpNox酶活的大小，确定LpNox的最适催化温度。实验结果如图3所示。
(3)LpNox温度稳定性
分别取温度为冰浴，4℃、20℃、30℃、40℃，测定LpNox的酶活随时间的变化，绘制酶活随温度和时间的变化曲线，比较在不同温度条件下随时间变化，LpNox的残余酶活，确定LpNox的温度稳定性。实验结果如附图4所示。
(4)LpNox酶促反应动力学常数测定
分别取底物NADH的浓度为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM，测定LpNox的酶活，制作酶活随底物浓度的变化曲线，比较在不同底物条件下LpNox酶活的大小，计算LpNox的动力学常数。结果如表1所示。
表1LpNox底物动力学特征
实验例6甘油脱氢酶的酶活测定
GlyDH酶活测定方法如下：于300μL孔板中加入250μLpH8.0磷酸钾缓冲液，15μL甘油(1M)，15μLNAD+(100mM)，20μL酶液，迅速混匀，在340nm波长下进行动力学循环光度测量，测得吸光度进行酶活的计算。
甘油脱氢酶(GlyDH)催化甘油脱氢生成DHA，辅酶NAD+为电子受体得氢被还原为NADH，酶活测定根据30℃条件下NAD+还原成NADH的速率来定量。酶活单位定义为1国际单位(1U)等于每分种还原1μmol底物NAD+或生成1μmol产物NADH的酶量。
公式：酶活(U)＝ΔA·(Ts/Sv)/(ε·min·L)
比活力(U/mg):ΔA·(Ts/Sv)/(ε·min·L·m)
其中:ε为1/mol/cm消光系数NADH为6220
ΔA：吸光度变化Ts：总反应体积
Sv：样品体积L：光径1cm
m:酶液中蛋白含量(mg)
实验例7LpNox与甘油脱氢酶体外串联转化甘油生成1,3-二羟基丙酮
标准反应体系为5mL的100mMpH8.0的磷酸钾缓冲液，含有10g/L甘油，0～2.0mMNAD+,3U/mLGlyDH,1～20U/mLLpNox。反应液置于50mL反应瓶中，25℃，200r振荡反应0-8h，隔不同时间进行取样测定反应体系中1,3-二羟基丙酮的含量。取反应液液50μL，加水稀释至500μL，取稀释液离心后的上清液50μL，加入二苯胺溶液450μL，沸水浴加热15min，流水冷却。以二苯胺溶液为空白，于608nm处测吸光度。实验结果如图5及表2所示。实验结论：综合DHA的生成量，在具体使用过程中辅酶的加入量越少越好。
表2不同NADH加入量对DHA转化的影响对比
实施例8
一种甘油转化生成1,3-二羟基丙酮的方法，其步骤为：在100mMpH8.0磷酸钾缓冲液中，含有1.0g/L甘油，0.001mMNAD+，0.001mMNADH，1U/mLGlyDH，1U/mLLpNox。反应液置于50mL反应瓶中，25℃，200r振荡反应，底物甘油发生氧化反应生成1,3-二羟基丙酮。
实施例9
一种甘油转化生成1,3-二羟基丙酮的方法，其步骤为：在75mMpH10.0磷酸钾缓冲液中，含有50.0g/L甘油，0.02mMNADH，3U/mLGlyDH，10U/mLLpNox。反应液置于50mL反应瓶中，10℃，200r振荡反应，底物甘油发生氧化反应生成1,3-二羟基丙酮。
实施例10
一种甘油转化生成1,3-二羟基丙酮的方法，其步骤为：在50mMpH5.0磷酸钾缓冲液中，含有100.0g/L甘油，2.0mMNAD+，10U/mLGlyDH，20U/mLLpNox。反应液置于50mL反应瓶中，50℃，200r振荡反应，底物甘油发生氧化反应生成1,3-二羟基丙酮。
<110>太原理工大学
<120>可再生辅酶NAD+的水型NADH氧化酶及其编码基因与应用
<160>2
<210>1
<211>450
<212>PRT
<213>戊糖乳杆菌LactobacilluspentosusATCC8041
<222>（1）…（450）
<400>1
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SerCysGlyIleAlaLeuTyrLeuGlyGlyGluValAlaAspProGlnGlyLeuPheTyr60
SerSerProGluGlnLeuAlaLysLeuGlyAlaAsnValHisMetGlnHisAspValThr80
AspValAspThrGluAsnHisGluIleThrValThrAspLeuLysThrGlyGluSerLys100
LysAspHisTyrAspLysLeuValValThrThrGlySerTrpProValIleProProIle120
AspGlyIleAspSerProAsnValTyrLeuCysLysAsnTrpThrHisAlaGlnSerLeu140
TrpGluAlaAlaLysProAlaLysArgValIleValIleGlyGlyGlyTyrIleGlyThr160
GluLeuValGluAlaTyrGlnLysGlnGlyLysGluValThrLeuIleAspGlyLeuPro180
ArgIleLeuAsnLysTyrLeuAspLysGlyPheThrAspArgValGluLysAspPheVal200
AspHisGlyIleLysMetAlaLeuAsnGlnMetValLysGlyPheSerAspAspGlyLys220
GluValThrValLysThrAspLysGlySerTyrThrAlaAspMetAlaIleLeuCysVal240
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IleLysThrAsnAspTyrMetGlnThrSerAspProAspIleTyrGlyAlaGlyAspSer280
ValAlaValHisTyrAsnProThrLysLysAspAlaTyrIleProLeuAlaThrAsnAla300
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TCGTTTCTTCTGGGATGACCTTGGAACATGCTCAAGCTGAAAAGGTACCT1050
GCAGAAGCCGTTACCTTTGAAGATAACTACCGTCCAGAATTTATGCCAAC1100
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TCTTAGGGGCCCAATTCATGAGTGAACATGACGTTTCACAATCGGCTAAC1200
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TAA1353

Claims (10)

1.可再生辅酶NAD+的水型NADH氧化酶，其特征在于，是如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。
2.可再生辅酶NAD+的水型NADH氧化酶编码基因，其特征在于，是如SEQIDNO.2所示的碱基序列。
3.如权利要求1所述的可再生辅酶NAD+的水型NADH氧化酶，其特征在于，所述的水型NADH氧化酶来源于戊糖乳杆菌LactobacilluspentosusATCC8041。
4.权利要求1或2或3所述的可再生辅酶NAD+的水型NADH氧化酶在甘油转化生成1,3-二羟基丙酮中的应用。
5.一种甘油转化生成1,3-二羟基丙酮的方法，其特征在于，其步骤为：在水型NADH氧化酶、甘油脱氢酶及辅酶存在下，底物甘油发生氧化反应生成1,3-二羟基丙酮。
6.根据权利要求5所述的一种甘油转化生成1,3-二羟基丙酮的方法，其特征在于，该方法是在pH为5.0～10.0的磷酸缓冲液中实现的。
7.根据权利要求5或6所述的一种甘油转化生成1,3-二羟基丙酮的方法，其特征在于，所述的辅酶为NADH及NAD+中的一种或两种以任意比例混合的混合物。
8.根据权利要求5或6所述的一种甘油转化生成1,3-二羟基丙酮的方法，其特征在于，该方法的反应温度为10～50℃。
9.根据权利要求5或6所述的一种甘油转化生成1,3-二羟基丙酮的方法，其特征在于，所述水型NADH氧化酶在反应体系中的用量为1-20U/mL。
10.根据权利要求5或6所述的一种甘油转化生成1,3-二羟基丙酮的方法，其特征在于，所述辅酶的加入量在反应体系中的用量为0.002-2.0mM。
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