CN107849584A - 以高碳效率生产1‑丁醇的电化学生物反应器模块和工程代谢路径 - Google Patents

以高碳效率生产1‑丁醇的电化学生物反应器模块和工程代谢路径 Download PDF

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Abstract

本文公开了一种用于传递还原当量至细胞的电化学装置和位于所述细胞内的工程改造的代谢路径的组合，所述细胞内的工程改造的代谢路径能够利用所述电化学方式提供的还原当量。这样的组合使化学品的发酵生产具有更高的碳效率。

Description

以高碳效率生产1-丁醇的电化学生物反应器模块和工程代谢 路径
相关申请的交叉援引
本申请要求2015年2月23日提交的美国临时申请号62/119,265的优先权和权益，其全部内容通过引用纳入本文。
技术领域
本文公开的内容主要涉及例如电化学生物反应器(EBM)的装置与任选表达于合适宿主细胞内的一个或多个工程改造的代谢路径组合用于以超过现有1-丁醇的发酵生产过程的碳效率将葡萄糖或其它可发酵的碳源转化成1-丁醇。
背景技术
四碳化合物1-丁醇，作为液体燃料和化学品都具有重要的价值和实用性。特别是，目前对于使用生物丁醇作为运输燃料的兴趣与日俱增。已有多种方法用于生产1-丁醇，包括石化原料丙烯催化反应、乙醇催化二聚反应和ABE发酵，这些方法都有明显的缺陷。对于生产丁醇，特别是生产生物丁醇的新方法的需求十分迫切。
1-丁醇通常由石油化工原料丙烯来生产。在氢和一氧化碳存在的情况下，用钴或铑催化剂进行丙烯氢甲酰化反应。这一过程要求100℃至200℃的温度和高达300atm的压力，并且生成大约88％1-丁醇和12％异丁醇的混合物。该反应如下所示。
乙醇作为一种二碳醇，可以使用戈尔伯特化学法(Geurbert chemistry)经二聚来生产1-丁醇。这一方法可以使用生物乙醇，从而使得生成的1-丁醇同样是生物源性的。戈尔伯特化学法自19世纪末便被人们所知晓，并且使用此化学法以乙醇生产1-丁醇的专利可追溯到20世纪30年代(美国专利号1992480)。这一过程采用进行一系列反应(氧化、醛醇缩合、脱水和还原)的催化剂，生成较高级醇和一摩尔的水。该反应如下所示。
因此，通过催化反应以丙烯或乙醇来生产1-丁醇需要昂贵的催化剂和/或苛刻的反应条件。
1-丁醇还可以使用乙酰丁醇梭菌(Clostridium acetylbutylicum)，通过发酵进行生产。这一发酵过程被称为“丙酮-丁醇-乙醇(ABE)法”，其于20世纪早期由Fernbach和Weizmann申请专利，他们的方法分别在1912和1915年获得专利；Weizmann法(英国专利4845,6，1919年3月)最终主宰了丙酮和丁醇的工业制造。发酵生成丙酮、1-丁醇、乙醇三种溶剂，三种溶剂以大致3:6:1的比例产出。随着分子生物学工具的应用，出现了超高产的布氏梭菌(Clostridium beijerincki)菌株，其总溶剂的产率达到了165g/L 1-丁醇(N.Qureshi,H.P.Blaschek,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.,2001,27,287-291)。
用于ABE发酵的梭状芽胞杆菌(Clostridia)的代谢是复杂的，其间经过产酸阶段，在该阶段中乙酸和丁酸生成并从细胞中分泌，其后进入产溶剂阶段，在该阶段中乙酸和丁酸被细胞摄取并且还原成乙醇，丙酮和丁醇。代谢路径经工程改造后，宿主生物体能够避免这一复杂的反应，并且使用如下一系列的酶由乙酰辅酶A生成1-丁醇：乙酰辅酶-乙酰基转移酶(AtoB)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶(Hdb)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱水酶(Crt)、反式-烯酰基-辅酶A还原酶(Ter)和醛/醇脱氢酶(AdhE2)(Shota Atsumi等,MetabolicEngineering 10(2008)305–311)。
不考虑细胞的代谢或原有路径，按照化学计量平衡的碳效率是三分之二，也就是说，初始葡萄糖(C6H12O6)的6个碳原子中只有4个包含在产出的1-丁醇(C4H10O)中；其余2个碳原子以2分子二氧化碳的形式流失。如以下平衡方程式所示，这是理论上葡萄糖发酵生产1-丁醇的最大碳效率。
方程式I：C6H12O6→C4H10O+2CO2+H2O
美国总计1300亿加仑/年的汽车燃料市场中生物燃料现在约占10％。通过将1-丁醇生产的理论碳效率从66.6％提高至100％，也就是说，如果初始葡萄糖的全部碳元素都能够包含在产生的1-丁醇中，这将使原材料的产率提高50％。以1-丁醇为例的高级生物燃料持续渗透进入汽车燃料市场，目标是到2020年达到360亿加仑。提高的碳效率能够用现今工艺生产240亿加仑所需的生物质和淀粉生产360亿加仑，从而使得生物燃料更加具有竞争力。
因此，迫切地需要提高葡萄糖发酵生产1-丁醇的碳效率。
方程式I中另一个问题是CO2的生成，它是没有转换成目标1-丁醇产物而流失的碳。许多年前人们就已经意到生物方法和非生物方法中的CO2流矢并希望能够回收CO2(P.G.Russell等,J.Electrochem.Soc.1977,124(9),1329-1338)。用电化学方法(NeilS.Spinner等,Catal.Sci.Technol.,2012,2,19–28)、光化学方法(Michele Aresta等,Beilstein J.Org.Chem.2014,10,2556–2565)和标准化学方法将二氧化碳还原为甲醇可见于出版物(Robyn Obert等,J.Am.Chem.Soc.1999,121,12192-12193；Song-wei Xu等,Ind.Eng.Chem.Res.2006,45,4567-4573；Xiaoli Wang等,ACS Catal.2014,4,962-972；Torsten Reda et al.,PNAS 2008 105(31),10654–10658)和专利(美国专利号6440711B1，2002年8月27日)。
有人提出了将电化学产生的还原当量用于某种形式的人工光合作用，在该方法中，电化学提供的还原当量取代了那些原本由光合系统I提供的还原当量(“在燃烧后捕获二氧化碳化学研究中的最新进展(In Recent Advances in Post-Combustion CO2Capture Chemistry)”；Attalla,M.；美国化学学会讨论会(ACS Symposium Series)；美国化学学会(American Chemical Society):Washington,DC,2012)。然而，这个方案仅仅生成了淀粉，并且还消耗了一些丙酮酸来转化为乙醇和二氧化碳以平衡ATP的需求。
人们探索从工业废气捕获CO2来提高碳效率(Michele Aresta,AngelaDibenedetto,Antonella Angelini,Chem.Rev.,2014,114(3),1709–1742；MicheleAresta,Angela Dibenedetto,Dalton Trans.,2007,2975-2992)，即将CO2还原成甲酸盐，这存在着液体内气体传输的问题，并且要在还原成甲酸之前由CO2形成碳酸和碳酸氢盐。
CO2还原成甲酸盐从能量上讲是不利的(Colin Finn,Sorcha Schnittger,LesleyJ.Yellowlees,Jason B.Love,Chem.Commun.,2012,48,1392–1399；F.Suhan Baskaya,Xueyan Zhao,Michael C.Flickinger,Ping Wang,Appl Biochem Biotechnol(2010)162:391–398)，并且当可能同时需要为了避免液体内气体传输的问题而先用碳酸酐酶催化CO2转化为碳酸时(Paul K.Addo,Robert L.Arechederra,Abdul Waheed,James D.Shoemaker,William S.Sly,Shelley D.Minteer,Electrochemical and Solid-State Letters,14(4)E9-E13(2011))，以捕获CO2作为一种提高碳效率的方式在任何系统中都是没有吸引力的。
因此，需要一个解决以上所有问题的改进的系统和方法用于生产1-丁醇，并且该方法能够降低生产成本(通过例如避免昂贵的催化剂)、提高碳效率和避免CO2生成。
附图说明
图1显示了电化学反应池的整体电化学过程和总体布置。中性红被作为阴极和氧化还原辅因子NAD(P)+之间电子传递介质的一个示例。
图2显示了使用AtoB、Hdb、Crt、Ter和AdhE2酶由乙酰辅酶A生成1-丁醇的工程改造的代谢路径。
图3显示了工程改造的路径在宿主细胞中的应用，其中用于产生琥珀酸、乳酸、乙酸和乙醇的酶被去除或失活，从而迫使所有的碳由葡萄糖形成丙酮酸。接下来丙酮酸经丙酮酸脱氢酶(Pdh)形成乙酰辅酶A，同时产生CO2。
图4显示了第一和第二工程改造的路径的一个实施方式。第一工程改造的丁醇路径和第二路径中的甲醛脱氢酶所需的还原当量都可以通过EBM以电化学的方式提供。
发明内容
本文公开了一种代谢工程和电化学生物反应器技术的新型组合用于生产1-丁醇，其组合方式避免了现有技术中的缺点。例如，采用代谢工程和基于生物的生产过程避免了昂贵催化剂和不可再生石油原料的使用。相较于ABE发酵法，在此公开的系统和方法避免了在糖酵解途径的末端生成二氧化碳，碳以甲酸盐的形式被捕获并通过RuMP路径的酶循环回到糖酵解途径的开始。以此方式，并通过提供外源性电化学生成的还原当量，由葡萄糖生产1-丁醇的碳效率能从66％升高，至100％。
一方面，提供了用于生产1-丁醇的系统，其包括：电化学生物反应器模块，用于提供还原当量；第一工程改造的路径，用于由乙酰辅酶A生成1-丁醇；和第二工程改造的路径，用于由丙酮酸盐回收甲酸盐形式的碳，并将回收的甲酸盐转化为果糖-6-磷酸；其中，还原当量被提供给第一和/或第二工程改造的路径中的一种或多种氧化还原酶；任选地，所述第一和第二工程改造的路径可以包含在工程改造的细胞中。
在一些实施方式中，所述第一工程改造的路径包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶(AtoB,EC 2.3.1.9)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶(Hbd,EC 1.1.1.157)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱水酶(Crt,EC 4.2.1.5)、反式-烯酰基-辅酶A还原酶(Ter,EC1.3.1.38)和醛/醇脱氢酶(AdhE2,EC 1.2.157/EC 1.1.1.1)。所述第二工程改造的路径包括丙酮酸:甲酸裂解酶(Pfl,EC 2.3.1.54)、甲醛脱氢酶(Fld,EC 1.2.1.46)、己酮糖-6-磷酸合酶(HPS,EC4.1.2.43)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(HPI,EC 5.3.1.27)。
在一些实施方式中，在工程改造的细胞中，内源性丙酮酸脱氢酶(Pdh,EC1.2.4.1)被失活、去除或以其它方式使其无功能。内源性富马酸还原酶(FrdBC,EC1.3.1.6)、乳酸脱氢酶(Ldh,EC 1.1.1.27)、乙醛脱氢酶(AdhE,EC 1.2.1.10)和/或乙酰辅酶A-磷酸乙酰基转移酶(Pta,EC 2.3.1.8)已被失活、去除或以其它方式使其无功能。
所述一种或多种氧化还原酶可选自：甲醛脱氢酶(Fld,EC 1.2.1.46)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶(Hbd,EC 1.1.1.157)、反式-烯酰基-辅酶A还原酶(Ter,EC 1.3.1.38)和醛/醇脱氢酶(AdhE2,EC 1.2.157/EC 1.1.1.1)。
另一方面，提供了一种用于生产1-丁醇的系统，其包括：电化学生物反应器模块，用于提供还原当量；工程改造的细胞，用于接收和利用所述还原当量生产1-丁醇，其中所述工程改造的细胞包含外源引入的选自以下所述的酶：丙酮酸:甲酸裂解酶(Pfl,EC2.3.1.54)、甲醛脱氢酶(Fld,EC 1.2.1.46)、己酮糖-6-磷酸合酶(HPS,EC 4.1.2.43)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(HPI,EC 5.3.1.27)，并且，所述工程改造的细胞中内源性丙酮酸脱氢酶()已被失活、去除或以其它方式使其无功能。
在一些实施方式中，工程改造的细胞还包含外源引入的乙酰辅酶A乙酰基转移酶(AtoB,EC 2.3.1.9)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶()、3-羟基丁酰基-辅酶A脱水酶(Crt,EC4.2.1.5)、反式-烯酰基-辅酶A还原酶(Ter,EC 1.3.1.38)和醛/醇脱氢酶(AdhE2,EC1.2.157/EC 1.1.1.1)。在某些实施方式中，工程改造的细胞的内源性富马酸还原酶(FrdBC,EC 1.3.1.6)、乳酸脱氢酶(Ldh,EC 1.1.1.27)、乙醛脱氢酶(AdhE,EC 1.2.1.10)和/或乙酰辅酶A-磷酸乙酰基转移酶(Pta,EC2.3.1.8)被失活、去除或以其它方式使其无功能。如权利要求12至14中任一项所述系统，其中还原当量通过电子传递介质(ETM)传递。
与本文所公开的各种系统有关的某些实施方式中，还原当量通过电子传递介质(ETM)传递，其选自例如以下所述一种或多种：中性红、亚甲基蓝、甲基紫精、醌、NAD+和NADP+。
在一些实施例中细胞可以是细菌或真菌。细菌可以选自：大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Actinobacillus succinogenes)、胞菌梭菌(Clostridium acetylbutylicum)或其他梭菌(Clostridium species)。真菌可以选自：酿酒酵母()、嘉吉公司(Cargill)的CB1酵母()、毕赤酵母类()或曲霉类()。
此外，还提供了用于生产1-丁醇的方法，其包括在碳源存在下，提供本文所述的任一系统。在一些实施方式中，所述碳源是葡萄糖。
发明详述
本文提供了以需要添加还原当量的一种或多种氧化还原酶来生产例如1-丁醇的日用、专业、功能或精细化学品的系统和方法。系统允许方便地改变操作条件，从而使得给定的酶促介导的氧化还原反应或系列反应实现最大电化学效率。在一些实施方式中，系列反应在体外或体内由一种或多种工程改造的代谢路径组织而成。某些实施方式中，可采用体内系统，例如以大肠杆菌、胞菌梭菌和酿酒酵母为例的宿主细胞，细胞内不需要的内源性基因已经被去除或以其它方式灭活，并且引入外源性基因以提供外加的催化反应。在一些实施方式中，工程改造的代谢路径的一种或多种酶可以通过重组技术在体外环境(例如，无细胞系统)中提供。
一方面，本文公开了一种代谢工程和电化学生物反应器技术的新型组合用于生产1-丁醇，避免了二氧化碳的生成。CO2一般在将葡萄糖转化为丙酮酸的糖酵解途径的末端生成。在一些实施方式中，碳以甲酸盐形式被捕获并通过核酮糖单磷酸盐(RuMP)路径中工程改造的酶循环回到糖酵解途径的开始。以这样的方式，并通过提供外源性电化学生成的还原当量，由葡萄糖生产1-丁醇的碳效率能从66％升高，至100％。此外，通过在糖酵解途径的末端生成甲酸盐而非CO2，可以避免必须捕获CO2并将其还原成甲酸盐以实现碳回收的问题。
定义
方便起见，将说明书、实施例和所附权利要求中使用的特定术语汇集在此。除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本文所属领域普通技术人员通常所理解的含义。
本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或一个以上的(即至少一个)该冠词语法上的宾语。举例而言，“一个元件”表示一个元件或者一个以上的元件。
本文所述术语“电化学生物反应器模块”(EBM)指利用氧化还原反应组合的系统，或者用于产生有用的电能，或者利用电能驱动有用的氧化还原反应组合。可用于本文的示例性EMB包括PCT公开号WO2014039767和PCT申请号PCT/US2015/058560中所公开的那些，两者的内容均通过引用其全文纳入本文。通用术语“氧化还原”反应是氧化－还原反应的简写。氧化还原反应涉及电子从一种化学物质向另一种化学物质的转移。
通过质子进行平衡的电子被称为“还原当量”或“还原力”。还原当量通常通过例如烟酰胺腺嘌呤二核苷(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP)、醌和黄嘌呤腺嘌呤二核苷(FAD)等辅因子提供给氧化还原酶。
本文中，术语“电子传递介质”或“ETM”指自身能够接受一个或多个电子然后将电子传递到另一分子的分子，包括将电子传递到酶分子。一个典型的、周知的ETM是中性红，其也被用作pH指示剂。其他可用作ETM的化合物包括亚甲基蓝、甲基紫精和醌。最通常地，可以使用其还原电势比NAD+更低的化合物，这包括通常称为氧化还原染料的各种化合物。例如，在先前描述的情形下，中性红通过促进电子从阴极到NAD+辅因子的移动而充当电子传递介质，从而有助于NAD+还原成NADH。
术语“电子传递介质”或“ETM”可包括促进电子转移到酶分子的分子，因此在广义上辅因子(例如，NADH、FMN、FAD，铁氧还蛋白等)也可以被认为是电子传递介质。然而，在一些例子中，术语“电子传递介质”或ETM仅意在描述促进电子转移的那些分子，但其在其它情况下通常不被认为是氧化还原酶系统的天然存在的辅因子，例如，NADH、FMN、FAD、铁氧还蛋白等。
在本公开的上下文中，ETM通常被认为是促进电子从实际阴极表面转移到氧化还原酶系统的辅因子所需要的。然而，氧化还原酶系统的辅因子自身能直接从阴极表面吸收电子而不需要ETM分子的介导。因此，在通常情况下，ETM的使用是任选的，尽管本文一些实施方式优选采用ETM。
本文中，“氧化还原酶”是指催化令被作用分子的化学氧化状态发生变化的反应的酶，被作用的的分子称为“底物”。在反应过程中，底物分子通过氧化还原酶接受电子以产生比底物分子化学还原程度更高的分子。该被还原的分子为“还原产物”，或更简洁地，“产物”。示例性产物包括商业或工业上重要的产物，例如琥珀酸(例如从富马酸盐还原形成)、甲烷(例如从CO2还原形成)、丁二醇、乙醇、丁醇、脂肪酸和其它醇。在一个实施方式中，1-丁醇是目标产物。
本文使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”、“涉及”及其变化意为涵盖其后列出的项目和其等同物以及外加的项目。“由……组成”应被理解为封闭式的，与之相关的是有限范围的元素或特征。“基本由……组成”将范围限制在特定的元素或步骤但不排除那些并不实质上影响相关发明基础和新颖特征的元素或步骤。
本文所使用的重组核酸技术、代谢工程和电化学领域内的其它术语，本领域的普通技术人员可以理解。
电化学生物反应器模块
提高发酵生产1-丁醇的碳效率需要添加氢。葡萄糖比1-丁醇氧化态高，即葡萄糖含有更少的氢。因此，必须加入额外的氢，从而使初始葡萄糖的所有碳都被转化成1-丁醇产物，避免碳以CO2的形式流失。通过提供氢，初始葡萄糖的所有碳能够被转化成1-丁醇产物，没有以CO2形式流失的碳，如以下平衡方程式所示。显然，通过提供足够的氢，初始葡萄糖原料的所有碳被转化成目标产物1-丁醇，如以下方程式II所示，1-丁醇的得率能够提高50％。
方程式II：C6H12O6+6H2→1.5C4H10O+4.5H2O
虽然将氢气输送到发酵过程是可行的，但这需要氢气处于发酵罐的顶部空间，并且还需要处理易燃易爆气体的特殊结构。向发酵过程中加入气体还需要消耗大量能源进行搅拌，以增强大体积气相气体中各个分子的转移，使其通过整个液相与发酵液中的细胞接触。因此，希望能避免使用氢气而同时仍然提供氢还原力。
相较于提供氢气，根据本文公开的内容之一，必要的还原当量可以通过电化学方法提供给发酵过程。
还原态的电子穿梭体可以将电子传递给数种不同的吸电子化合物，例如偶氮染料、多卤代化合物、硝基芳族化合物和准金属氧化物。Van der Zee和Cervantes综述了电子穿梭体催化的还原生物转化过程的结果(Van der Zee等.生物技术进展(BiotechnologyAdvances)27:265-277,2009)。为了使电化学生物反应器具备商业可行性，必须对常规系统的硬件设计和工艺设计做出改变，以将产率和效率提高到实用水平。
此外，虽然其他人之前已经认识到向生物系统提供外部电子的适宜性，但是用于实现这一点的方法要求以一定形式包含阳极以防止其与生物系统发生不期望的反应。因此，必须采取一些物理布置以提供向阳极的电子转移，同时保持阳极与发酵液(在全细胞的情况下)或缓冲系统(在分离的酶处于水性介质中的情况下)的物理隔离，这用各种膜、盐桥或其他物理手段来实现。希望能相比现有设计简化电化学反应池的设计，还希望能设计成用于连续、流通系统(例如通过大型发酵容器或化学反应器的环路)的反应池。甚至更希望以如下方式安排电化学反应池：所述方式在阳极利用简单的半反应，并且以避免使用盐桥来连接阳极室和阴极室的方式进行操作，且当采用膜来分隔阳极室和阴极室时减轻膜污染。
以上优点采用PCT公开号WO2014039767和PCT申请号PCT/US2015/058560中所公开内容来实现。
在一些实施方式中，本文使用了在PCT公开号WO2014039767和PCT申请号PCT/US2015/058560中所描述的“电化学生物反应器模块”(EBM)，两者的内容均通过引用其全文纳入本文。EBM通常包括电化学反应池，其具有包含在阳极室中的阳极、包含在阴极室中的阴极、分隔所述两室的质子渗透膜。
图1显示了电化学反应池的整体电化学过程和总体布置。中性红被作为阴极和氧化还原辅助因子NAD(P)+之间电子传递中介的一个示例。为了清楚起见，化学计量以4电子转移显示(2乘2电子)，以避免出现分数摩尔的O2。对于电化学反应池所提供的每一对电子，一个NAD(P)还原成一个NAD(P)H并且消耗一分子水。在该过程中，每生成1摩尔的O2，形成2摩尔还原态的NAD(P)H。需要注意的是图1中所示的细胞膜是任选地，只适用于采用宿主细胞时。当在体外或无细胞的系统中使用时，细胞膜可以不存在。
在一些实施方式中，EMB可以包括分隔阳极室和阴极室的质子渗透膜。在一个实施方式中，质子渗透膜可以是改良的膜，其允许质子(如水合氢离子，H3O+)穿过它。质子渗透膜可以在阳极侧承载或容纳催化剂，用于产生氧气。
EMB还进一步包括具有集成仪器的电化学反应池，该仪器包括阳极侧氧收集系统、阴极侧气体收集系统、流速控制系统、温度测定和控制系统、电压和电流测定和调节系统、pH测定系统、溶解氧(DO)测定系统、电导率测定系统、代谢能力(荧光)测定系统。这样的集成系统能够实现以下非常有用的功能：电子和质子转移调节和优化、微生物副产物最小化、H2气体消除或最小化、所需产品优化、蒸馏水(DI)水纯度分析、完全质量平衡分析、流速控制、温度控制。
在本文中，阳极可以是允许有用的电流密度的任何合适的设计。最典型地，阳极可以是钛基底上涂以铂。
阳极室可以任何合适的设计，允许去离子水的输入、再循环和温度控制，同时允许在阳极表面处产生的气体，即氧气，的输出和任选的收集。
在使用中，阳极室可以被去离子水填充，并且施加足够的电压以引起水的电解。于是，阳极室中形成氧气，其可以释放到大气中或捕获用于其他用途。附带产生的水合氢离子(H3O+)沿着电梯度迁移并穿过隔离阳极室和阴极室的膜。这引起了水从阳极室进入阴极室的物理通量。
工程改造的代谢路径
在本公开中，第一工程改造的代谢路径由2摩尔的乙酰辅酶A生成1摩尔的1-丁醇，第二工程改造的代谢路径将丙酮酸转化成甲酸，其后转化成甲醛，并随后转化成果糖-6-磷酸，两路径可任选地包含在合适的宿主细胞中，以上用于以一种具备碳效率的方式生产1-丁醇。在各种实施方式中，电化学生物反应器用于为宿主细胞提供外源性的、电化学产生的还原当量。这能够使葡萄糖以100％的碳效率生产1-丁醇。
图2显示了使用AtoB、Hdb、Crt、Ter和AdhE2酶从乙酰辅酶A生成1-丁醇的第一工程改造的代谢路径。
AtoB表示乙酰辅酶A乙酰基转移酶(EC 2.3.1.9)
Hbd表示3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.157)
Crt表示3-羟基丁酰基-辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.5)
Ter表示反式-烯酰基-辅酶A还原酶(EC 1.3.1.38)
AdhE2表示醛/醇脱氢酶(EC 1.2.157/EC 1.1.1.1)
第一工程改造的代谢路径所涉及的各种酶公开在Atsumi等,代谢工程(MetabolicEngineering)10(2008)305–311中，其通过引用纳入本文。
在一些实施方式中，电化学产生的外部还原当量可以通过本文所述EBM提供给第一工程改造的代谢路径中的氧化还原酶，如Hbd、Ter和/或AdhE2。还原当量可以通过如中性红、亚甲基蓝、甲基紫精、醌、NAD+和/或NADP+的一种或多种电子传递介质提供。
图3显示了工程改造的路径在宿主细胞(例如，大肠杆菌)中的应用，其中用于生成琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇的内源性酶被去除或失活，从而迫使所有的碳由葡萄糖形成丙酮酸。丙酮酸接下来经丙酮酸脱氢酶(Pdh)形成乙酰辅酶A，同时生成CO2。粗体的数字表示在该路径中各种化合物的摩尔当量。在图3中：
Pdh表示丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.4.1)。
失活的或去除的酶
FrdBC表示富马酸还原酶(EC 1.3.1.6)。
LdhA表示乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27)。
AdhE表示乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)。
Pta表示乙酰辅酶A-磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)
丁醇路径酶：
AtoB表示乙酰辅酶A乙酰基转移酶(EC 2.3.1.9)
Hbd表示3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.157)
Hbd表示3-羟基丁酰基-辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.5)
Ter表示反式-烯酰基-辅酶A还原酶(EC 1.3.1.38)
AdhE2表示醛/醇脱氢酶(EC 1.2.157/EC 1.1.1.1)。
已有这样的工程改造代谢路径，其重置细胞内代谢工程改造的代谢路径，以减少细胞生成的ATP为代价生成更多NADH或NADPH还原当量(Peters等,WO2008/293101)。然而，使用这一方法并不可能改变方程式I所示的由葡萄糖生产1-丁醇的化学计量，并且无法避免CO2的生成。
碳在糖酵解途径末端以CO2的形式流失，途径中酶复合体丙酮酸脱氢酶将一分子的丙酮酸盐裂解成一分子乙酰辅酶A和一分子CO2，产生一个NADH还原当量。在一些实施方式中，丙酮酸:甲酸裂解酶(Pfl)可以替代糖酵解途径末端的丙酮酸脱氢酶复合体。Pfl酶将一分子的丙酮酸盐裂解成一分子乙酰辅酶A和一分子甲酸盐；该过程中没有还原当量生成。通过防止由丙酮酸盐形成乙酰辅酶A释放的碳变成CO2而将其保持为溶液中离子物质状态的甲酸盐形式，避免了必须通过捕获CO2以实现碳回收的问题
在一些实施方式中，San等的美国专利号7709261(通过引用整体并入本文)公开的丙酮酸:甲酸裂解酶可与本文所公开的内容结合使用。需要注意的是，美国专利号7709261中丙酮酸:甲酸裂解酶所生成的甲酸盐后被用于生成NADH，甲酸盐被氧化成CO2而逸失。因此，不存在碳捕获。
在一些实施方式中，可用第二工程改造的路径来捕获流失的碳。例如，内源性甲酸脱氢酶可以替换成工程改造的丙酮酸:甲酸裂解酶，捕获的甲酸盐形态的碳可以再循环回到糖酵解途径。在一些实施方式中，首先通过甲醛脱氢酶(Fld)将甲酸盐还原成甲醛，并进一步用到核酮糖单磷酸(RuMP)路径中的酶。在该路径中，一分子甲醛与一分子核酮糖-5-磷酸盐在3-己酮糖-6-磷酸合酶(HPS)的作用下缩合生成一分子3-己酮糖-6-磷酸。该产物经酶6-磷酸-3-己酮糖异构酶(PHI)异构化得到果糖-6-磷酸酯，果糖-6-磷酸酯重新进入糖酵解途径，生成乙酰辅酶A和甲酸盐，如此重复该循环并且防止碳的流失。Marrs等的WO2010/104938 A1公开了一种乙醇生产过程，其中乙酰辅酶A被还原成乙醛，其后进一步将其还原成乙醇，采用了工程改造的代谢路径。WO2010/104938通过引用纳入本文。
在一些实施方式中，电化学产生的外部的还原当量可以通过本文EBM提供给第二工程改造的代谢路径中的氧化还原酶，如FLD。还原当量可以通过一种或多种电子传递介质传递，例如中性红、亚甲基蓝、甲基紫精、醌、NAD+和/或NADP+
图4显示了本文公开的一个实施方式，其中提供了第一和第二工程改造的路径，例如，它们可以任选地包含在工程改造的宿主细胞中。宿主细胞可以是细菌(例如大肠杆菌或胞菌梭菌)或真菌。粗体的数字表示在该路径中各种化合物的摩尔当量，和代谢步骤之间的摩尔通量。在图4中：
第一工程改造的路径
AtoB表示乙酰辅酶A乙酰基转移酶(EC 2.3.1.9)；
Hbd表示3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.157)；
Ctr表示3-羟基丁酰基-辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.5)；
Ter表示反式-烯酰基-辅酶A还原酶(EC 1.3.1.38)；
AdhE2表示醛/醇脱氢酶(EC 1.2.157/EC 1.1.1.1)。
第二工程改造的路径
ΔPdh表示丙酮酸脱氢酶活性缺失(EC 1.2.4.1)
Pfl表示丙酮酸:甲酸裂解酶(EC 2.3.1.54)；
Fld表示甲醛脱氢酶(EC 1.2.1.46)。
HPS表示3-己酮糖-6-磷酸盐合酶(EC 4.1.2.43)；
PHI表示6-磷酸-3-己酮糖异构酶(EC 5.3.1.27)
第一工程改造的路径使用AtoB、Hdb、Crt、Ter和AdhE2酶由乙酰辅酶A生成1-丁醇。第二工程改造的路径用丙酮酸:甲酸裂解酶(Pfl)替代丙酮酸脱氢酶，并使用甲醛脱氢酶(Fld)、3-己酮糖-6-磷酸盐合酶(HPS)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(PHI)这三种酶将丙酮酸:甲酸裂解酶产生的甲酸盐引入RuMP路径，以果糖-6-磷酸形式被回收，碳重新进入糖酵解途径。第一工程改造的丁醇路径和第二路径中甲醛脱氢酶所需的还原当量可以通过本文所述EBM以电化学的方式提供。
在一些实施方式中，在宿主细胞中，可以表达用于从乙酰辅酶A生产1-丁醇的第一工程改造的路径。第一工程改造的路径包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶(AtoB,EC 2.3.1.9)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶(Hbd,EC 1.1.1.157)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱水酶(Crt,EC4.2.1.5)、反式-烯酰基-辅酶A还原酶(Ter,EC 1.3.1.38)和醛/醇脱氢酶(AdhE2,EC1.2.157/EC 1.1.1.1)。
宿主细胞还可以包含第二工程改造的路径，用于将甲酸盐还原成甲醛并最终以果糖-6-磷酸形式回收甲醛。该第二工程改造的路径包括丙酮酸:甲酸裂解酶(Pfl,EC2.3.1.54)、甲醛脱氢酶(Fld,EC 1.2.1.46)、己酮糖-6-磷酸合酶(HPS,EC 4.1.2.43)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(HPI,EC 5.3.1.27)。为了使第二工程改造的路径能有用，细胞的丙酮酸脱氢酶(Pdh,EC 1.2.4.1)被失活、去除或以其它方式使其无功能，从而避免糖酵解途径末端CO2形式的碳流失。
某些实施方式中，宿主细胞内否则会催化由磷酸烯醇式丙酮酸(phospoenylpyruvate)生成琥珀酸(富马酸还原酶，FrdBC，EC 1.3.1.6)，由丙酮酸盐生成乳酸盐(乳酸脱氢酶，Ldh，EC 1.1.1.27)，由乙酰辅酶A生成乙醇(乙醛脱氢酶，AdhE，EC 1.2.1.10)或由乙酰辅酶A生成乙酸(乙酰辅酶A-磷酸乙酰基转移酶，Pta，EC 2.3.1.8)的酶被失活、去除或以其它方式使其无功能。
在各种实施方式中，包含本文所述工程改造的代谢路径的宿主细胞从EMB直接地或通过例如中性红的任选地电子传递介质接受电化学产生的还原当量。
在一些实施方式中，EBM的阴极室持续地接受含有合适的宿主细胞的物料流，所述宿主细胞中表达有第一和第二工程改造的路径。该物料流可以是用于培养宿主细胞的发酵液。宿主细胞可以是细菌或真菌，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、胞菌梭菌或其他梭菌种类、酿酒酵母、嘉吉公司(Cargill)的CB1酵母、毕赤酵母类或曲霉类。
在工作条件下，葡萄糖进入宿主细胞并且经糖酵解生成丙酮酸盐。生成的丙酮酸盐经丙酮酸:甲酸裂解酶裂解，产生乙酰辅酶A和甲酸盐。乙酰辅酶A经第一工程改造的路径生成1-丁醇，Hbd(3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶)、Ter(反式-烯酰基-辅酶A还原酶)和AdhE2(醛/醇脱氢酶)接受由EBM生成的外源性还原当量。由丙酮酸盐生成的甲酸盐被Fld(甲醛脱氢酶)并使用由EBM生成的还原当量还原。甲醛与核酮糖-5-磷酸由HPS(3-己酮糖-6-磷酸合酶)缩合形成D-阿拉伯糖-3-己酮糖-6-磷酸，核酮糖-5-磷酸来自宿主细胞的天然戊糖途径。该产物经HPI(6-磷酸-3-己酮糖异构酶)异构化生成果糖-6-磷酸重新进入糖酵解途径。以这种方式，所有的以葡萄糖进入整个系统的碳被转化成1-丁醇。
显然，本文中1-丁醇形成的过程中没有生成CO2，避免了回收CO2用于所需的代谢路径的相关问题。由此实现了100％的碳效率。
显然，本文中这种EBM系统的电力输入可以来自可再生资源(风能、太阳能、水力发电等)。
本文的各方面可以单独使用、联用或以前述实施方式未具体讨论的各种组合方式来使用，因此，其应用并不局限于前面描述或附图所示的细节和排布。例如，一个实施方式中各项内容可与其它实施方式中各项内容以任意方式组合。
权利要求中修饰所提要素的序数词“第一”、“第二”、“第三”等本身并不表示所提要素其一相对另一个的任何优先、居先或级别高低，或执行方法多个步骤的时间顺序，而仅仅用作标记把某一名称的要素与相同名称的另一要素(若非序数词无法区分)区分开来。
而且，本文所用的词语和术语是为了描述目的，而不是限制性的。本文使用“包含”、“包括”、或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化意味着涵盖其后列出的项目及其等价物，以及额外的项目。
等同形式
本文提供了用于向生物系统提供还原当量的新方法和装置。尽管讨论了本文的具体实施方式，但以上说明书仅为说明性而非限制性的。本领域的技术人员在阅读本说明书后将清楚了解本文的许多变化。本文的全部范围应该通过参考所附权利要求书连同其等同物的全部范围，以及说明书连同此类变化来确定。
通过引用纳入
本文中应用的所有公开、专利和专利申请通过引用全文纳入本文用于所有目的，就如同各公开、专利被具体地说明通过引用纳入本文一样。

Claims (21)

1.一种用于生产1-丁醇的系统，其包括：
电化学生物反应器模块，用于提供还原当量；
第一工程改造的路径，用于由乙酰辅酶A生成1-丁醇；和
第二工程改造的路径，用于由丙酮酸盐回收甲酸盐形式的碳，并且将所述回收的甲酸盐转化为果糖-6-磷酸；
其中，所述还原当量被提供给所述第一和/或第二工程改造的路径中的一种或多种氧化还原酶；并且其中所述第一和第二工程改造的路径任选地存在于工程改造的细胞中。
2.如权利要求1所述系统，其中所述第一工程改造的路径包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶(AtoB,EC 2.3.1.9)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶(Hbd,EC 1.1.1.157)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱水酶(Crt,EC 4.2.1.5)、反式-烯酰基-辅酶A还原酶(Ter,EC 1.3.1.38)和醛/醇脱氢酶(AdhE2,EC 1.2.157/EC 1.1.1.1)。
3.如权利要求1或2所述系统，其中所述第二工程改造的路径包括丙酮酸:甲酸裂解酶(Pfl,EC 2.3.1.54)、甲醛脱氢酶(Fld,EC 1.2.1.46)、己酮糖-6-磷酸合酶(HPS,EC4.1.2.43)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(HPI,EC 5.3.1.27)。
4.如权利要求1或2所述系统，其中在所述工程改造的细胞中，内源性丙酮酸脱氢酶(Pdh,EC 1.2.4.1)已被失活、去除或以其它方式使其无功能。
5.如权利要求1或2所述系统，其中在所述工程改造的细胞中，内源性富马酸还原酶(FrdBC,EC 1.3.1.6)、乳酸脱氢酶(Ldh,EC 1.1.1.27)、乙醛脱氢酶(AdhE,EC 1.2.1.10)和/或乙酰辅酶A-磷酸乙酰基转移酶(Pta,EC 2.3.1.8)已被失活、去除或以其它方式使其无功能。
6.如权利要求1或2所述系统，其中所述一种或多种氧化还原酶选自：甲醛脱氢酶(Fld,EC 1.2.1.46)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶(Hbd,EC 1.1.1.157)、反式-烯酰基-辅酶A还原酶(Ter,EC 1.3.1.38)和醛/醇脱氢酶(AdhE2,EC 1.2.157/EC 1.1.1.1)。
7.如权利要求1至6中任一项所述系统，其中所述还原当量通过电子传递介质(ETM)传递。
8.如权利要求7所述系统，其中所述ETM选自以下一种或多种：中性红、亚甲基蓝、甲基紫精、醌、NAD+和NADP+。
9.如权利要求1至8中任一项所述系统，其中所述细胞是细菌或真菌。
10.如权利要求9所述系统，其中所述细菌选自：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、胞菌梭菌或其他梭菌。
11.如权利要求9所述系统，其中所述真菌选自：酿酒酵母、毕赤酵母类或曲霉类。
12.一种用于生产1-丁醇的系统，其包括：
电化学生物反应器模块，用于提供还原当量；
工程改造的细胞，用于接收和利用所述还原当量生产1-丁醇，其中所述工程改造的细胞包括外源引入的选自以下所述的酶：丙酮酸:甲酸裂解酶(Pfl,EC 2.3.1.54)、甲醛脱氢酶(Fld,EC 1.2.1.46)、己酮糖-6-磷酸合酶(HPS,EC 4.1.2.43)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(HPI,EC 5.3.1.27)，并且，在所述工程改造的细胞中，内源性丙酮酸脱氢酶(Pdh,EC1.2.4.1)已被失活、去除或以其它方式使其无功能。
13.如权利要求12所述系统，其中所述工程改造的细胞还包括外源引入的乙酰辅酶A乙酰基转移酶(AtoB,EC 2.3.1.9)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶(Hbd,EC 1.1.1.157)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱水酶(Crt,EC 4.2.1.5)、反式-烯酰基-辅酶A还原酶(Ter,EC 1.3.1.38)和醛/醇脱氢酶(AdhE2,EC 1.2.157/EC 1.1.1.1)。
14.如权利要求12或13所述系统，其中在所述工程改造的细胞中，内源性富马酸还原酶(FrdBC,EC 1.3.1.6)、乳酸脱氢酶(Ldh,EC 1.1.1.27)、乙醛脱氢酶(AdhE,EC 1.2.1.10)和/或乙酰辅酶A-磷酸乙酰基转移酶(Pta,EC 2.3.1.8)已被失活、去除或以其它方式使其无功能。
15.如权利要求12至14中任一项所述系统，所述还原当量通过电子传递介质(ETM)传递。
16.如权利要求15所述系统，所述ETM选自以下一种或多种：中性红、亚甲基蓝、甲基紫精、醌、NAD+和NADP+。
17.如权利要求12至16中任一项所述系统，所述的细胞是细菌或真菌。
18.如权利要求17所述系统，所述细菌选自：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、胞菌梭菌或其他梭菌。
19.如权利要求17所述系统，所述真菌选自：酿酒酵母、毕赤酵母类或曲霉类。
20.一种用于生产1-丁醇的方法，其包括在碳源存在下提供如权利要求1至19中任一项所述系统。
21.如权利要求20所述方法，所述碳源是葡萄糖。
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