CN102719496B - 一种微生物转化苯甲酰甲酸乙酯制备(s)-(+)-扁桃酸乙酯的方法 - Google Patents
一种微生物转化苯甲酰甲酸乙酯制备(s)-(+)-扁桃酸乙酯的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC No.2266为生物催化剂，生物催化苯甲酰甲酸乙酯制备(S)-(+)-扁桃酸乙酯的方法。所述方法包括：以苯甲酰甲酸乙酯为底物，以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC No.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，在水和正己烷两相体系中，于20~35℃下进行转化反应8~120小时，转化液经分离纯化得到所述(S)-(+)-扁桃酸乙酯；该微生物转化方法反应条件温和，环境友好，产物光学纯度高，底物转化率高，分离纯化过程简单，催化剂可重复利用，适于工业化生产。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC No.2266为生物催化剂，生物催化苯甲酰甲酸乙酯制备(S)-(+)-扁桃酸乙酯的方法。
（二）背景技术
(S)-(+)-扁桃酸乙酯(Ethyl(S)-(+)-mandelate)，CAS登录号：13704-09-1，分子式C10H12O3，分子量180.2。它是一种重要的手性药物中间体，可以广泛地用于合成手性酸，手性醇，手性胺类化合物，手性氨基醇和手性硫醇等。(S)-(+)-扁桃酸乙酯水解后制备的(S)-(+)-扁桃酸在医药工业中可用于头孢羟唑、血管扩张药环扁桃酸酯、滴眼药羟苄唑等的中间体，也可作防腐剂。
(S)-(+)-扁桃酸乙酯的合成途径主要有化学法和生物转化法。在化学催化剂或生物催化剂的作用下，还原苯甲酰甲酸乙酯可以获得(S)-(+)-扁桃酸乙酯。采用化学法不对称还原苯甲酰甲酸乙酯需要在价格昂贵的手性催化剂的催化下才能完成。化学还原过程中手性催化剂价格昂贵、制备过程繁琐。采用含有羰基还原酶的微生物细胞为生物催化剂不对称还原苯甲酰甲酸乙酯具有反应条件温和、立体选择性好、成本低廉的特点。
生物转化过程可以在不同的反应体系中进行。最为传统的反应体系是水相体系，在水相体系中进行生物转化微生物的催化活性较高，但是有机底物浓度过高时生物转化效率会急剧下降。为了解决高底物浓度对细胞催化活性的抑制作用，采用生物相容性好的有机溶剂用于生物转化过程，在生物相容性较好的有机溶剂中微生物能够保持较好地催化活性，有机底物能够很好地分散于反应溶剂中，从而避免底物和产物在反应溶剂中局部浓度不均一而导致催化效率降低的现象。也可以采用水/有机溶剂两相体系作为反应介质，可以确保微生物在水溶液中具有良好的生物学活性。底物和产物在有机介质中具有较大的溶解度，有利于实现产物的分离提取。采用固定化细胞进行生物转化可以较大程度保护细胞的催化活性，同时有利于产物的分离提取，有利于微生物细胞的重复利用，提高生产效率。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC No.2266为生物催化剂，生物催化苯甲酰甲酸乙酯制备(S)-(+)-扁桃酸乙酯的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种苯甲酰甲酸乙酯微生物转化制备(S)-(+)-扁桃酸乙酯的方法，所述方法包括：以苯甲酰甲酸乙酯为底物，以酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）CGMCC No.2266在发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，在水和正己烷两相体系中，于20~35℃下进行转化反应8~120小时，转化液经分离纯化得到所述(S)-(+)-扁桃酸乙酯；所述水和正己烷两相体系中，水与正己烷体积比为1:0.2~5（优选1:1），在所述水和正己烷两相体系中，底物苯甲酰甲酸乙酯的初始浓度为1~200mmol/L（优选5~50mmol/L）。
本发明中所用的菌株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCCNo.2266是从杭州西湖啤酒厂附近的土壤中筛选得到的，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2007年11月26日，已在CN101230319A中披露。该菌株菌落特征：在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均匀的菌落形态。
所述含酶菌体细胞可直接以发酵液形式参与反应，也可经过滤后以湿菌体细胞形式参与反应，或者经固定化之后作为生物催化剂参与反应。
优选的，所述含酶菌体细胞经固定化之后作为生物催化剂，其用量为：每L水和正己烷两相体系中含有的生物催化剂相当于以包埋法将1.0~4.0g（以干重计）的含酶菌体细胞固定化后再经增殖培养16~72小时获得的固定化细胞颗粒。
所述生物催化剂（固定化细胞颗粒）制备方法如下：将酿酒酵母菌株CGMCC No.2266发酵培养获得的菌体浓度为3.0~10.0g/L的发酵液与等体积质量浓度1~5%的海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入足量质量浓度为2.5~4.0%的氯化钙溶液中，连续搅拌得到固定化悬浮液，放置于35~38℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤后，分散于发酵培养基中进行增殖培养16~72h获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，即为生物催化剂。所述的固定化细胞颗粒的直径可通过注射器的针头尺寸来控制，推荐为1~5mm，最优选2mm。
所述发酵培养基组成如下：葡萄糖26~32g/L，酵母粉2~4g/L，硫酸铵3~6g/L，无水MgSO4 0.2~0.4g/L，K2HPO4·3H20 0.5~1.5g/L，KH2PO40.6～1.5g/L，pH自然，溶剂为水。
所述分离纯化方法如下：将转化液过滤除去生物催化剂，滤液静置分层后得到正己烷层，将正己烷减压蒸馏，分离得到产物(S)-(+)-扁桃酸乙酯。
在包埋处理过程中，海藻酸钠的浓度推荐为1~5％，最优选2％。
本发明所述的应用可按如下方法获得发酵液：
（1）斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2266菌体接种到斜面培养基，26~35℃培养4~6天得到斜面培养的菌体；所述的斜面培养基组成如下：麦芽汁5~15g/L，酵母粉2~4g/L，蛋白胨4~6g/L，葡萄糖7~12g/L，琼脂15~25g/L，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；
（2）种子培养：从斜面培养基取一环菌体转接到种子培养基，26~35℃，摇床转速为150~200r/min，培养18~26h得种子液；所述的种子培养基组成如下：葡萄糖26~32g/L，酵母粉2~4g/L，硫酸铵3~6g/L，无水MgSO4 0.2~0.4g/L，K2HPO4·3H20 005~1.5g/L，KH2PO4 0.6~1.5g/L，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，即得种子培养基；
（3）发酵培养：取种子液，以10~20%的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26~35℃，摇床转速为150~200r/min，培养18~30h得到发酵液；所述的发酵培养基的组成同种子培养基。
具体推荐按照如下步骤获得生物催化剂：将前面所得到的发酵液与等体积2%的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为4.30g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入质量浓度为3.5%的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于37℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒；得到的固定化细胞颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养24h，得到增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂。
具体推荐所述的方法为：以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂，以苯甲酰甲酸乙酯为底物，在水和正己烷两相体系（体积比1:1）中，于30℃、180r/min条件下转化反应72h，转化液经分离纯化得到产物(S)-(+)-扁桃酸乙酯；所述的分离纯化可采用如下步骤：将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将反应液静置分层后得到正己烷层。将正己烷减压蒸馏，分离得到产物(S)-(+)-扁桃酸乙酯。在水和正己烷中，底物苯甲酰甲酸乙酯的初始浓度为1~200.0mmol/L，每L水和正己烷两相体系中含有的生物催化剂相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为4.3g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在发酵培养基中增殖培养24小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒。
得到的(S)-(+)-扁桃酸乙酯纯品用气相色谱－质谱联用仪进行检测确定产物的纯度和分子量。
摩尔转化率和产物(S)-(+)-扁桃酸乙酯对映体过剩值（ee%）的确定：
采用安捷伦7820气相色谱仪分析检测。色谱柱为手性柱，型号为Chiral CYCLODEX-B（0.25mm×30m×0.25μm），载气为氮气，流速为1ml/min。手性柱可以检测到(R)-(-)-扁桃酸乙酯和(S)-(+)-扁桃酸乙酯两种对映体的含量，进一步计算出反应的摩尔转化率和(S)-(+)-扁桃酸乙酯的对映体过剩值（ee%）。
过滤得到的固定化细胞颗粒可重复使用于微生物转化制备(S)-(+)-扁桃酸乙酯的反应。
本发明采用固定化细胞在水和正己烷两相体系中催化苯甲酰甲酸乙酯转化制备(S)-(+)-扁桃酸乙酯，为(S)-(+)-扁桃酸乙酯的制备提供了一条经济有效的合成途径。
利用本发明方法生产的(S)-(+)-扁桃酸乙酯对映体过剩值大于99.0%，底物摩尔转化率可以达到99.0%，产品纯度达到98.0%，固定化细胞颗粒可以重复利用9次。
本发明微生物转化法制备(S)-(+)-扁桃酸乙酯具有以下优点：①生产所用的菌株安全无毒。②固定化细胞作为生物催化剂有利于实现产物的分离提取。③固定化细胞作为生物催化剂有利于实现催化剂的重复利用，节约成本。④生产操作简便，生物转化率较高。⑤生物催化剂比化学催化剂成本低廉。⑥不受季节影响，易于实现大规模工业化生产。⑦环境友好，反应条件温和，常温常压下即可顺利进行转化。⑧正己烷可以溶解大量的底物和产物，可以降低有机底物和产物对生物催化反应过程的抑制作用，提高底物的转化量，提高生物转化的生产效率。
（四）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
斜面培养：将CGMCC No.2266菌种接种至斜面培养基，30℃培养4～6天。所述斜面培养基组成如下：麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH值，溶剂为水，121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。
种子培养和发酵：种子和发酵培养基均采用液体培养基，成分为：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgSO4 0.25g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却。用接种针从斜面培养基中取一环菌体接种在含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180r/min的条件下培养24h获得种子液。将种子液以10%的接种量接种于含有100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180r/min的条件下培养24h获得发酵液，用获得的发酵液用于菌体的固定化。
将菌体干重为430mg的100ml发酵液与等体积的浓度为2%的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液装入注射器中，滴入3.5%CaCl2溶液（1000ml）中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在发酵培养基中增殖培养72h。
将增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入到8瓶含有5.5mmol苯甲酰甲酸乙酯的水和正己烷体积比分别为5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，1:3和1:4的300ml两相反应体系中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，结果如表1所示。结果表明，反应体系中水和正己烷的配比比例对生物转化反应的摩尔转化率有影响。水的含量相对过多，对转化率的影响不大。而随着反应体系中正己烷的含量增高，生物转化反应的摩尔转化率降低较多。反应体系中较佳的水和正己烷的体积比为1:1。在上述8种水和正己烷体积比不同的反应体系中进行生物转化后获得的产物(S)-(+)-扁桃酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0%。
表1：水和正己烷体积比对微生物转化苯甲酰甲酸乙酯的影响
| 水和正己烷体积比 | 5:1 | 4:1 | 3:1 | 2:1 | 1:1 | 1:2 | 1:3 | 1:4 |
| 摩尔转化率(％) | 95.2 | 96.0 | 96.7 | 98.2 | 99.0 | 95.2 | 89.7 | 78.5 |
实施例2：
将CGMCC No.2266按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将菌体干重为430mg的100ml发酵液与等体积的浓度为2%的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液装入注射器中，滴入3.5%CaCl2溶液（1000ml）中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在发酵培养基中增殖培养72h。
将增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入到5瓶含有2.2mmol、4.4mmol、5.5mmol、7.7mmol和10mmol苯甲酰甲酸乙酯的水和正己烷体积比为1:1的300ml反应体系中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，结果如表2所示。结果表明，反应的摩尔转化率随着底物初始添加量的提高而降低。当底物初始添加量小于5.5mmol时，反应的摩尔转化率均高于99.0%。在上述5种不同的底物初始添加量的生物转化中获得的产物(S)-(+)-扁桃酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0%。
表2：固定化CGMCC No.2266转化不同初始添加量的苯甲酰甲酸乙酯
实施例3：
将CGMCC No.2266按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将4瓶菌体干重为430mg的发酵液分别与等体积的浓度为2%的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液分别装入注射器中，滴入3.5%CaCl2（1000ml）溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的4瓶固定化细胞颗粒分别继续在发酵培养基中增殖培养0h、24h、48h和72h。
将4种增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入含有5.5mmol苯甲酰甲酸乙酯的水和正己烷体积比为1:1的300ml反应体系中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化结束后，采用气相色谱测定产物含量和对映体过剩值，结果如表3所示。结果表明，固定化细胞颗粒的增殖培养时间越长越有利于底物摩尔转化率的提高，增殖培养时间达到72h的固定化细胞颗粒用于转化苯甲酰甲酸乙酯摩尔转化率可以达到99.0％，以上述4种不同的增殖培养时间获得的固定化细胞颗粒为生物催化剂制备的(S)-(+)-扁桃酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0％。
表3：不同增殖培养时间的固定化细胞颗粒转化苯甲酰甲酸乙酯
| 增殖培养时间(h) | 0 | 24 | 48 | 72 |
| 摩尔转化率(%) | 0 | 63.5 | 80.2 | 99.0 |
实施例4：
将CGMCC No.2266按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将4瓶菌体干重为430mg的100ml发酵液分别与等体积的浓度为2%的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液分别装入针头尺寸不同的注射器中，滴入3.5%CaCl2（1000ml）溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径大小分别为2mm、3mm、4mm和5mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在发酵培养基中增殖培养72h。
将4种增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入到含有5.5mmol苯甲酰甲酸乙酯的水和正己烷体积比为1:1的300ml反应体系中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化过程中每隔8h取样，采用气相色谱测定产物含量和对映体过剩值，结果如表4所示。结果表明，当最佳固定化细胞颗粒直径为2mm时，生物转化的摩尔转化率达到99.0%，以上述四种直径的固定化颗粒作为催化剂制备的(S)-(+)-扁桃酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0%。
表4：不同直径的固定化细胞颗粒转化苯甲酰甲酸乙酯
实施例5：
将CGMCC No.2266按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将5瓶菌体干重为430mg的100ml发酵液分别与等体积的浓度为1%、2%、3%、4%和5%的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液分别装入注射器，滴入3.5%CaCl2（1000ml）溶液中形成固定化颗粒，颗粒直径大小为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在发酵培养基中增殖培养72h。
将5种增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入到含有5.5mmol苯甲酰甲酸乙酯的水和正己烷体积比为1:1的300ml反应体系中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化过程中每隔8h取样，采用气相色谱测定产物含量和对映体过剩值，结果如表5所示。结果表明，当海藻酸钠的浓度为最佳浓度2%时，生物转化的摩尔转化率可以达到99.0%，在五种不同浓度的海藻酸钠包埋条件下获得的固定化CGMCC No.2266颗粒转化底物所得到的(S)-(+)-扁桃酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0%。
表5：不同浓度的海藻酸钠溶液固定化CGMCC No.2266转化苯甲酰甲酸乙酯
实施例6：
将CGMCC No.2266按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将菌体干重为430mg的发酵液与等体积的浓度为2%的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液装入注射器中，滴入3.5%CaCl2（1000ml）溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在发酵培养基中增殖培养72h。
将增殖培养好的固定化细胞颗粒加入到含有5.5mmol苯甲酰甲酸乙酯的水和正己烷体积比为1:1的300ml反应体系中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化结束后过滤出固定化细胞颗粒，将固定化细胞颗粒重新悬浮在水和正己烷体积比为1:1的300ml反应体系中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，如此重复利用固定化细胞颗粒9次，每次都采用气相色谱测定产物含量和对映体过剩值。结果如表6所示。结果表明，固定化细胞颗粒可以很好地重复利用于(S)-(+)-扁桃酸乙酯的生物合成，产物(S)-(+)-扁桃酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0%，第9次的摩尔转化率为第一次摩尔转化率的17%。
表6：固定化CGMCC No.2266转化苯甲酰甲酸乙酯的重复利用
| 重复利用次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 摩尔转化率（%） | 99.0 | 82.6 | 70.6 | 62.1 | 58.9 | 43.2 | 39.1 | 28.2 | 16.9 |
Claims (5)
1.一种微生物转化苯甲酰甲酸乙酯制备(S)-(+)-扁桃酸乙酯的方法，所述方法包括：以苯甲酰甲酸乙酯为底物，以酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）CGMCC No.2266在发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，在水和正己烷两相体系中，于20~35℃下进行转化反应8~120小时，转化液经分离纯化得到所述(S)-(+)-扁桃酸乙酯；所述水和正己烷两相体系中，水与正己烷体积比为1:0.2~5，在所述水和正己烷两相体系中，底物苯甲酰甲酸乙酯的初始浓度为1~200mmol/L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含酶菌体细胞经固定化之后作为生物催化剂，其用量为：每L水和正己烷两相体系中含有的生物催化剂相当于以包埋法将1.0~4.0g的含酶菌体细胞固定化后再经增殖培养16~72小时获得的固定化细胞颗粒。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述生物催化剂制备方法如下：将酿酒酵母菌株CGMCC No.2266发酵培养获得的菌体浓度为3.0~10.0g/L的发酵液与等体积质量浓度1~5%的海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入质量浓度为2.5~4.0%的氯化钙溶液中，连续搅拌得到固定化悬浮液，放置于35~38℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤后，分散于发酵培养基中进行增殖培养16~72h获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，即为生物催化剂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖26~32g/L，酵母粉2~4g/L，硫酸铵3~6g/L，无水MgSO4 0.2~0.4g/L，K2HPO4·3H20 0.5~1.5g/L，KH2PO4 0.6~1.5g/L，pH自然，溶剂为水。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法如下：将转化液过滤除去生物催化剂，滤液静置分层后得到正己烷层，将正己烷减压蒸馏，分离得到产物(S)-(+)-扁桃酸乙酯。
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