CN101205523B - 一种酿酒酵母及其在制备β-羟基苯丙酸乙酯中的应用 - Google Patents
一种酿酒酵母及其在制备β-羟基苯丙酸乙酯中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种微生物新菌种酿酒酵母CGMCC No.2230，及其在微生物转化制备β-羟基苯丙酸乙酯中的应用。所述的酿酒酵母CGMCC No.2230保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏号CGMCC No.2230。所述的应用为：以β-羰基苯丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，在水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中，于25～30℃下，转化反应时间为8～72小时，转化液经分离纯化得到产物β-羟基苯丙酸乙酯。该微生物转化方法环境友好，反应条件温和，产物分离简单，底物转化率高，产品纯度好，催化剂可重复利用，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物新菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2230，及其在微生物转化制备β-羟基苯丙酸乙酯中的应用。
背景技术
β-羟基苯丙酸乙酯(Beta-hydroxy-benzenepropanoic acid ethylester)，分子式为C11H14O3，分子量194.23。β-羟基苯丙酸乙酯是合成抗抑郁药物重要的中间体，可以分别用于抗抑郁药物托莫西汀、氟西汀和尼索西汀的合成。其中，氟西汀是抗抑郁的一线用药。《世界卫生报告》指出：目前，抑郁症已是全球继癌症、卒中和慢性阻塞性肺病之后的第四大慢性疾病，成为一个不容忽视的严重的公共卫生问题。受社会竞争加剧和老龄化的影响，我国抑郁症的发病率已呈现出上升趋势。β-羟基苯丙酸乙酯的有效绿色合成对于生产上述抗抑郁药具有积极的推动作用。
β-羟基苯丙酸乙酯的合成途径主要有化学法和生物转化法两种。在化学催化剂或生物催化剂的作用下，还原β-羰基苯丙酸乙酯可以获得β-羟基苯丙酸乙酯。化学催化剂的制备过程复杂，与化学合成法相比，生物法合成β-羟基苯丙酸乙酯具有反应条件温和、成 本低廉、环境友好的特点，以产生羰基还原酶的微生物细胞作为生物催化剂廉价易得，为β-羟基苯丙酸乙酯的绿色合成途径。生物转化羰基还原反应需要提供还原剂，微生物细胞不仅含有羰基还原酶，还含有还原剂辅酶NADH或NADPH，所以采用微生物全细胞还原羰基化合物可以实现辅酶的原位再生，为反应过程提供大量的还原剂。因此，利用微生物细胞转化技术生产β-羟基苯丙酸乙酯是-种科学、经济、环境友好的合成方法。
采用微生物转化法还原β-羰基苯丙酸乙酯制备β-羟基苯丙酸乙酯未见专利报道，只有少数公开发表的文章报道如下：
2005年，巴西科学工作者Joyce Benzaquem Ribeiro等人采用游离的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、汉逊酵母(Hansenula sp.)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和白地霉(Geotrichumsp.)在水相中不对称还原β-羰基苯丙酸乙酯制备β-羟基苯丙酸乙酯。
2006年，德国科学工作者H.Engelking等人采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在水相中不对称还原β-羰基苯丙酸乙酯制备β-羟基苯丙酸乙酯。
1995年，中国科学院上海有机研究所潘冰峰等人采用白地霉、黑曲霉和啤酒酵母在水相中不对称还原β-羰基苯丙酸乙酯制备β-羟基苯丙酸乙酯。
上述的研究中共同的特点有两个：一是均采用游离的细胞进行生物转化。但是，游离细胞的生物转化过程不利于产物的后续分离提取 和生物催化剂的重复利用，不利于大规模生产应用。二是均在水相中进行生物转化。由于有机底物β-羰基苯丙酸乙酯在水中的溶解度极小，造成β-羰基苯丙酸乙酯与细胞接触机会很小，有机底物对细胞也会造成一定的毒害作用，因此生物转化生产能力较低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可供生物转化β-羰基苯丙酸乙酯为β-羟基苯丙酸乙酯的微生物新菌种：酿酒酵母CGMCCNo.2230，以及利用该菌株生物催化β-羰基苯丙酸乙酯合成β-羟基苯丙酸乙酯的方法。
酿酒酵母CGMCC No.2230，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所内，保藏号CGMCC No.2230，保藏日期2007年10月24日。
菌株来源：本发明中所述的微生物菌株酿酒酵母CGMCCNo.2230是从杭州西湖啤酒厂附近的土壤中筛选得到。将土壤中分离得到的菌株用于转化β-羰基苯丙酸乙酯，得到酿酒酵母CGMCCNo.2230具有良好的转化β-羰基苯丙酸乙酯生产β-羟基苯丙酸乙酯的能力。
所述酿酒酵母CGMCC No.2230的菌落特征和生化特性：在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，菌落质地均匀。
所述酿酒酵母CGMCC No.2230可用于微生物转化制备β-羟基 苯丙酸乙酯。
所述的应用具体为：以β-羰基苯丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，在水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中，于25～30℃转化反应8～72小时，转化液经分离纯化得到产物β-羟基苯丙酸乙酯。
在上述转化中，所述水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中底物β-羰基苯丙酸乙酯的初始浓度推荐为5.15～51.5mmol/L。每L水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为3.0～10.0g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在液体培养基中增殖培养16～72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重；所述发酵液中菌体浓度定义为：菌体干重/发酵液体积。
上述生物催化剂通过酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵获得的发酵液以包埋法制得，具体制备步骤可按照如下进行：将经酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵培养获得的发酵液与等体积1～5％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液中菌体浓度为3.0～10.0g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入质量浓度为2.5～4.0％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于35～38℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒。将得到的固定化细胞颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养16～72h获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为本发明所用的生物催化剂。
所述的固定化细胞颗粒的直径可通过注射器的针头尺寸来控制，推荐为1～5mm，最优选2mm。
在包埋处理过程中，海藻酸钠的浓度推荐为1～5％，最优选2％。
本发明采用固定化细胞颗粒作为催化剂，将β-羰基苯丙酸乙酯还原为β-羟基苯丙酸乙酯的生物转化机理如下：
本发明所述的转化反应在水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中进行，推荐所述的水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系的组成如下：将水与邻苯二甲酸二丁酯以等体积混合构成两相体系。
本发明所述的应用可按如下方法获得发酵液：
(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2230菌体接种到斜面培养基，26～35℃培养4～6天得环菌体；所述的斜面培养基组成(g/L)：麦芽汁0.5～1.5％，酵母粉0.2～0.4％，蛋白胨0.4～0.6％，葡萄糖0.7～1.2％，琼脂1.5～2.5％，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；
(2)种子培养：从斜面培养基取一环菌体转接到种子培养基，26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～26h得种子液；所述的种子培养基组成(g/L)：葡萄糖2.6～3.2％，酵母粉0.2～0.4％，硫酸铵0.3～0.6％，无水MgSO4 0.02～0.04％，K2HPO4·3H20 0.05～0.15％，KH2PO4 0.06～0.15％，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20分钟， 灭菌后冷却，即得种子培养基；
(3)发酵培养：取种子液，以10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～30h得到发酵液；所述的发酵培养基的组成同种子培养基。
具体推荐按照如下步骤获得生物催化剂：将前面所得到的发酵液与等体积2％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为4.30g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入质量浓度为3.5％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于37℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒；得到的固定化细胞颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养24h，得到增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂。
具体推荐所述的应用为：以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂，以β-羰基苯丙酸乙酯为底物，在体积比1∶1的水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中，于30℃、180r/min条件下转化反应72h，转化液经分离纯化得到产物β-羟基苯丙酸乙酯；所述的分离纯化可采用如下步骤：将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，得到的滤液静置分层，萃取分出有机相，将有机相层旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯，得到有机溶质混合物，得到的溶质混合物采用硅胶柱层析分离，获得产物β-羟基苯丙酸乙酯。在水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中，底物β-羰基苯丙酸乙酯的初始浓度为5.15～51.5mmol/L，每L水/邻 苯二甲酸二丁酯两相体系中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为4.3g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在发酵培养基中增殖培养24小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重。
得到的纯品用气相色谱-质谱联用仪进行检测确定产物的纯度和分子量。
过滤得到的固定化细胞颗粒可重复使用于微生物转化制备β-羟基苯丙酸乙酯的反应。
本发明的有意效果体现在以下几个方面：
1、本发明采用的微生物转化制备β-羟基苯丙酸乙酯与化学合成法相比具有以下优点：①环境友好，反应条件温和，常温常压下即可顺利进行转化。②生物催化剂比化学催化剂成本低廉。③生产操作简便，生物转化率较高。④不受季节影响，易于实现大规模工业化生产。⑤生产所用的菌株安全无毒。
2、本发明中采用固定化细胞在水/邻苯二甲酸二丁酯介质中进行生物转化与传统的生物转化相比具有如下优点：①固定化细胞作为生物催化剂有利于实现产物的分离提取。②固定化细胞作为生物催化剂有利于实现催化剂的重复利用，节约成本。③易于实现大规模工业化生产。④反应介质中水的存在有利于保持固定化细胞的催化活力，减少有机底物和产物对生物催化剂的毒害作用，提高催化效率。⑤反应介质中邻苯二甲酸二丁酯的存在可以溶解大量的底物和产物，可以降低有机底物和产物对生物催化反应过程的抑制作用，提高底物的转 化量，提高生物转化的生产效率。
利用本发明方法生产β-羟基苯丙酸乙酯，底物摩尔转化率可以达到87％，产品纯度达到99.3％，硅胶柱层析产物提取收率为95.8％，固定化细胞颗粒可以重复利用10次。
附图说明
图1为实施例1的工艺流程示意图。
具体实施方式
下面以具体实施例来进一步阐释本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
实施例1
斜面培养：将CGMCC No.2230菌种接种在含麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH值的培养基中进行培养。30℃培养4～6天。
种子培养和发酵：种子和发酵培养基均采用液体培养基，成分为葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgSO4 0.25g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L。用接种针从斜面培养基中取一环菌体接种在含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180r/min的条件下培养24h获得种子。将种子液以10％的接种量接种于含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180r/min的条件下培养24h获得发酵液，用获得的发酵液用于菌体的固定化。
将5瓶菌体干重为430 mg的100ml发酵液分别与等体积浓度为1％、2％、3％、4％和5％的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液分别装入注射器，滴入3.5％(w/v)CaCl2溶液中形成固定化颗粒，颗粒直径大小为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在液体培养基中增殖培养24h。
将5种增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入到300ml水/邻苯二甲酸二丁酯(体积比1∶1)的反应体系中，加入15.45mmol β-羰基苯丙酸乙酯，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化过程中每隔8h取样，采用气相色谱测定产物含量，结果如表1所示。结果表明，固定化过程中，海藻酸钠的浓度对固定化细胞颗粒的生物转化能力有影响，当海藻酸钠的浓度为最佳浓度2％时，生物转化的摩尔转化率可以达到70.1％。
表1 不同浓度的海藻酸钠溶液固定化CGMCC No.2230转化β-羰基苯丙酸乙酯
| 摩尔转化率 (％) 海藻酸钠浓度(％) 转化时间(h) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 8 | 10.8 | 18.2 | 16.2 | 11.1 | 10.1 |
| 16 | 18.9 | 26.5 | 24.3 | 19.5 | 18.5 |
| 24 | 27.8 | 38.4 | 35.6 | 28.2 | 26.2 |
| 32 | 35.2 | 43.1 | 40.2 | 36.3 | 34.4 |
| 40 | 49.6 | 65.2 | 58.1 | 53.6 | 47.7 |
| 48 | 52.2 | 68.3 | 65.2 | 59.5 | 50.2 |
| 56 | 52.5 | 70.2 | 63.3 | 60.5 | 53.5 |
| 64 | 52.6 | 69.8 | 65.5 | 58.9 | 52.3 |
| 72 | 53.5 | 70.1 | 64.2 | 60.2 | 55.1 |
实施例2
将CGMCC No.2230按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将4瓶菌体干重为430mg的100ml发酵液分别与等体积浓度为2％的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液分别装入针头尺寸不同的注射器中，滴入3.5％(w/v)CaCl2溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径大小分别为2mm、3mm、4mm和5mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在液体培养基中增殖培养24h。
将4种增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入到300ml水/邻苯二甲酸二丁酯(体积比1∶1)的反应体系中，加入15.45mmol β-羰基苯丙酸乙酯，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化过程中每隔8h取样，采用气相色谱测定产物含量，结果如表2所示。结果表明，固定化细胞颗粒直径的不同对生物转化率有影响，当最佳固定化细胞颗粒直径为2mm时，生物转化率达到70.1％。
表2不同直径的固定化细胞颗粒转化β-羰基苯丙酸乙酯
| 摩尔转化率 (％)固定化颗粒直径(mm) 转化时间(h) | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 8 | 18.2 | 15.2 | 12.3 | 10.2 |
| 16 | 26.5 | 22.2 | 19.5 | 16.5 |
| 24 | 38.4 | 35.3 | 31.2 | 28.6 |
| 32 | 43.1 | 40.5 | 36.1 | 30.2 |
| 40 | 65.2 | 57.1 | 48.2 | 41.1 |
| 48 | 68.3 | 60.8 | 50.5 | 43.5 |
| 56 | 70.2 | 60.5 | 49.9 | 42.7 |
| 64 | 69.8 | 61.6 | 51.2 | 43.1 |
| 72 | 70.1 | 61.8 | 51.5 | 43.7 |
实施例3
将CGMCC No.2230按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将4瓶菌体干重为430mg的发酵液分别与等体积浓度为2％的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液分别装入注射器中，滴入3.5％(w/v)CaCl2溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的4瓶固定化细胞颗粒分别继续在液体培养基中增殖培养0h、24h、48h和72h。
将4种增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入到300ml水/邻苯二甲酸二丁酯(体积比1∶1)的反应体系中，加入15.45mmolβ-羰基苯丙酸乙酯，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化结束后，采用气相色谱测定产物含量，结果如表3所示。结果表明，固定化细胞颗粒的增殖培养时间越长越有利于生物转化率的提高，增殖培养时间达到72h的固定化细胞颗粒用于转化β-羰基苯丙酸乙酯摩尔转化率可以达到75％。
表3不同增殖培养时间的固定化细胞颗粒转化β-羰基苯丙酸乙酯
| 增殖培养时间(h) | 0 | 24 | 48 | 72 |
| 摩尔转化率(％) | 0 | 70.1 | 74.8 | 75.0 |
实施例4
将CGMCC No.2230按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将菌体干重为430mg的发酵液与等体积浓度为2％的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液装入注射器中，滴入3.5％(w/v)CaCl2 溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在液体培养基中增殖培养72h。
将增殖培养好的固定化细胞颗粒加入到300ml水/邻苯二甲酸二丁酯(体积比1∶1)的反应体系中，加入15.45mmol β-羰基苯丙酸乙酯，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化结束后过滤出固定化细胞颗粒，将固定化细胞颗粒重新悬浮在300ml水/邻苯二甲酸二丁酯(体积比1∶1)的反应体系中，加入15.45mmolβ-羰基苯丙酸乙酯，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，如此重复利用固定化细胞颗粒10次，每次都采用气相色谱测定产物含量。结果如表4所示。结果表明，固定化细胞颗粒可以很好的重复利用于β-羰基苯丙酸乙酯的生物转化，第10次的转化率为第一次转化率的40.8％。
表4固定化CGMCC No.2230转化β-羰基苯丙酸乙酯的重复利用
| 重复利用次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 摩尔转化率(％) | 75.0 | 70.9 | 68.8 | 62.6 | 58.5 | 52.6 | 46.2 | 40.1 | 38.5 | 30.6 |
实施例5
将CGMCC No.2230按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将菌体干重为430mg的100ml发酵液与等体积浓度为2％的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液装入注射器中，滴入3.5％(w/v)CaCl2溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在液体培养基中增殖培养72h。
将增殖培养好的固定化细胞颗粒加入到300ml水/邻苯二甲酸二丁酯(体积比1∶1)的反应体系中，转化开始时加入底物5.15mmol，间隔12h加入5.15mmol底物，共加入底物15.45mmol，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化结束后用气相色谱测定产物含量。结果表明，分批加入底物有利于提高反应的转化率。一次性加入底物15.45mmol的摩尔转化率为75％，即可以生成11.59mmol β-羟基苯丙酸乙酯。按上述方法分3次加入底物的总转化率为87％，即可以生成13.44mmol β-羟基苯丙酸乙酯。
Claims (10)
1.一种酿酒酵母菌株CGMCC No.2230，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏日期2007年10月24日，保藏编号CGMCC No.2230。
2.如权利要求1所述的酿酒酵母菌株CGMCC No.2230在β-羰基苯丙酸乙酯微生物转化制备β-羟基苯丙酸乙酯中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以β-羰基苯丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，在水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中，于25～30℃转化反应8～72小时，转化液经分离纯化得到产物β-羟基苯丙酸乙酯，在水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中底物β-羰基苯丙酸乙酯的初始浓度为5.15～51.5mmol/L。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于每L水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为3.0～10.0g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在液体培养基中增殖培养16～72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重；所述发酵液中菌体浓度定义为：菌体干重/发酵液体积。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的生物催化剂通过酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵获得的发酵液以包埋法制得，具体制备步骤如下：将经酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵培养获得的发酵液与等体积1～5％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓 度为3.0～10.0g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入质量浓度为2.5～4.0％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于35～38℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒，将固定化细胞颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养16～72h获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒即为所述的生物催化剂。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的固定化细胞颗粒的直径为1～5mm。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系的组成如下：将水与邻苯二甲酸二丁酯以等体积混合构成两相体系。
8.如权利要求3～7之一所述的应用，其特征在于所述的应用按如下方法获得发酵液：
(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2230菌体接种到斜面培养基，26～35℃培养4～6天得菌体；所述的斜面培养基组成以g/L计为：麦芽汁0.5～1.5％，酵母粉0.2～0.4％，蛋白胨0.4～0.6％，葡萄糖0.7～1.2％，琼脂1.5～2.5％，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；
(2)种子培养：从斜面培养基取一环菌体转接到种子培养基，26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～26h得种子液；所述的种子培养基组成以g/L计为：葡萄糖2.6～3.2％，酵母粉0.2～0.4％， 硫酸铵0.3～0.6％，无水MgSO4 0.02～0.04％，K2HPO4·3H2O 0.05～0.15％，KH2PO4 0.06～0.15％，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，即得种子培养基；
(3)发酵培养：取种子液，以10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～30h得到发酵液；所述的发酵培养基的组成同种子培养基。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于将所述生物催化剂具体按如下方法获得：将发酵液与等体积2％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为4.3g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入质量浓度为3.5％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于37℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒；得到的固定化细胞颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养24h，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的应用为：以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂，以β-羰基苯丙酸乙酯为底物，在体积比1∶1的水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中，于30℃、180r/min条件下转化反应72小时，转化液经分离纯化得到β-羟基苯丙酸乙酯；所述分离纯化步骤如下：将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，得到的滤液静置分层，萃取分出有机相，将有机相层旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯，得到有机溶质混合物，得到的溶质混合物 采用硅胶柱层析分离，获得产物β-羟基苯丙酸乙酯；在水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中底物β-羰基苯丙酸乙酯的初始浓度为5.15～51.5mmol/L，每L水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为4.3g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在发酵培养基中增殖培养24小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20111109 Termination date: 20131214 |