CN101230319A - 酿酒酵母CGMCC No.2266及其在制备(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株微生物新菌株酿酒酵母CGMCC No.2266及其在微生物转化制备(S)－(－)－β－羟基苯丙酸乙酯中的应用。酿酒酵母CGMCC No.2266，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCCNo.2266，保藏日期2007年11月26日。本发明提供了一株可供生物转化β－羟基苯丙酸乙酯为(S)－(－)－β－羟基苯丙酸乙酯的新菌株，利用本发明方法生产的(S)－(－)－β－羟基苯丙酸乙酯对映体过剩值大于99.0％，底物摩尔转化率可以达到92.2％，产品纯度达到99.8％，硅胶柱层析产物提取收率为95.6％，固定化细胞颗粒可以重复利用10次。

Description

酿酒酵母CGMCC No.2266及其在制备(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一株微生物新菌株酿酒酵母CGMCC No.2266及其在微生物转化制备(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯中的应用。

(二)背景技术

(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯((S)-(-)-Beta-hydroxy-benzenepropanoic acidethyl ester)，分子式为C₁₁H₁₄O₃，分子量194.23。(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯是合成(S)-氟西汀的重要中间体。(S)-氟西汀在人体内的作用时间是(R)-氟西汀的3倍。盐酸氟西汀商品名百忧解，是一种选择性的5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)，其能有效地抑制神经元从突触间隙中摄取5-羟色胺，增加间隙中可供实际利用的这种神经递质，从而改善情感状态，治疗抑郁性精神障碍。适应于各种抑郁性精神障碍、包括轻性或重性抑郁症、双相情感性精神障碍的抑郁症，心因性抑郁及抑郁性神经症。

(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯的合成途径主要有化学法和生物转化法两种。在化学催化剂或生物催化剂的作用下，还原β-羰基苯丙酸乙酯可以获得(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯。采用化学法不对称还原β-羰基苯丙酸乙酯需要在手性催化剂的催化下才能完成，化学还原过程中手性催化剂价格昂贵、制备过程繁琐。采用含有羰基还原酶的微生物细胞为生物催化剂不对称还原β-羰基苯丙酸乙酯具有反应条件温和、立体选择性好、成本低廉的特点，又被称为手性化合物的绿色合成技术。微生物细胞中含有羰基还原酶的辅酶NAD(P)H，可以为还原过程提供供氢体，有利于实现辅酶NAD(P)H的原位再生，提高还原反应效率。利用微生物细胞转化技术生产(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯是一种科学、经济、环境友好的合成方法。

采用微生物转化法还原β-羰基苯丙酸乙酯制备(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯未见专利报道，只有少数公开发表的文章报道如下：

2005年，巴西科研工作者Joyce Benzaquem Ribeiro等人采用游离的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、汉逊酵母(Hansenula sp.)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和白地霉(Geotrichum sp.)在水相中不对称还原β-羰基苯丙酸乙酯制备(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯。

2006年，德国科研工作者H.Engelking等人采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在水相中不对称还原β-羰基苯丙酸乙酯制备(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯。

上述的研究中共同的特点有两个：一是，均采用游离的细胞进行生物转化。游离细胞的生物转化过程不利于产物的后续分离提取和生物催化剂的重复利用。二是，均在水相中进行生物转化。由于有机底物β-羰基苯丙酸乙酯在水中的溶解度极小，有机底物对细胞也会造成一定的毒害作用，细胞催化忍受不了大量的底物，因此生物转化生产能力较低。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种可供生物转化β-羰基苯丙酸乙酯为(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯的微生物新菌种酿酒酵母CGMCC No.2266，以及利用该菌株生物转化β-羰基苯丙酸乙酯合成(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯的方法。

本发明采用的技术方案是：

酿酒酵母CGMCC No.2266，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCCNo.2266，保藏日期2007年11月26日。

菌株来源：本发明中所述的微生物菌株酿酒酵母CGMCC No.2266是从杭州西湖啤酒厂附近的土壤中筛选得到。将土壤中分离得到的菌株用于转化β-羰基苯丙酸乙酯，得到酿酒酵母CGMCC No.2266具有良好的转化β-羰基苯丙酸乙酯生产(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯的能力。

所述酿酒酵母CGMCC No.2266的菌落特征：在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均匀的菌落形态。

酿酒酵母CGMCC No.2266可应用于微生物转化制备(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯。

具体的，所述应用为：以β-羰基苯丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母CGMCC No.2266发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，在邻苯二甲酸二丁酯中，于25～35℃转化反应8～72小时，转化液经分离纯化得到所述(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯。所述发酵培养可按常规方法进行，在常规适用于酿酒酵母的培养基中、常规适用于酿酒酵母发酵的条件下进行。

所述邻苯二甲酸二丁酯中底物β-羰基苯丙酸乙酯的初始浓度为5.15～100.0mmol/L。

催化剂用量为：每L邻苯二甲酸二丁酯中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为3.0～10.0g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在液体培养基中增殖培养16～72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重；所述发酵液中菌体浓度定义为：菌体干重与发酵液体积之比。

所述固定化细胞颗粒的固定化方法可采用常规方法进行，如包埋法、交联法、载体结合法等，其中包埋法最为常用，包埋法的原理是将微生物细胞截留在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络空间中，通过聚合作用或通过离子网络形成，或通过沉淀作用，或改变溶剂、温度、pH值使细胞截留、凝胶聚合物的网络可以阻止细胞的泄露，同时能让底物物质渗入进去和产物扩散出来。作为包埋载体，天然高分子多糖类的海藻酸钠和卡拉胶应用最多，它们具有固化、成形方便，对微生物毒性小及固定化密度高等优点。

本发明中所述固定化细胞颗粒推荐由如下方法制备得到：将经酿酒酵母CGMCC No.2266发酵培养获得的发酵液与等体积1～5％(w/w％)的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为3.0～10.0g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入浓度为2.5～4.0％(w/w％)的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于35～38℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒，将得到的固定化颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养16～72h获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂。

所述固定化细胞颗粒粒径可通过注射器的针头尺寸来控制，推荐为1～5mm，最优为2mm左右。

在包埋处理过程中，海藻酸钠的浓度推荐为1～5％，最优为2％。

推荐按如下方法获得发酵液：

(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2266接种至斜面培养基，26～35℃培养4～6天得到斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为：麦芽汁5～15g/L，酵母粉2～4g/L，蛋白胨4～6g/L，葡萄糖7～12g/L，琼脂15～25g/L，溶剂为水，pH自然；灭菌后冷却制成斜面；

(2)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基，28～32℃、150～200r/min培养18～28h，得种子液；种子培养基终浓度组成为：葡萄糖26～32g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵3～6g/L，无水MgSO₄ 0.2～0.4g/L，K₂HPO₄·3H₂0 0.5～1.5g/L，KH₂PO₄ 0.6～1.5g/L，溶剂为水，pH自然，灭菌后冷却；

(3)将种子液以体积比5～20％的接种量，接种至发酵培养基，28～32℃、150～200r/min培养18～28h，得发酵液；发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖26～32g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵3～6g/L，无水MgSO₄ 0.2～0.4g/L，K₂HPO₄·3H₂0 0.5～1.5g/L，KH₂PO₄0.6～1.5g/L，溶剂为水，pH自然，灭菌后冷却。

推荐按如下方法获得所述的生物催化剂：将发酵液与等体积2％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为4.3g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入3.5％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于37℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒；得到的固定化细胞颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养24h，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂。

本发明采用固定化细胞颗粒作为催化剂，将β-羰基苯丙酸乙酯还原为(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯的生物转化机理如下：

β-羰基苯丙酸乙酯    (S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯

具体的，所述的应用为：

以β-羰基苯丙酸乙酯为底物，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂，在邻苯二甲酸二丁酯中，于30℃、180r/min条件下转化反应72小时，转化液过滤，取滤液脱去溶剂邻苯二甲酸二丁酯，再经硅胶柱层析分离，得到所述(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯；邻苯二甲酸二丁酯中，底物β-羰基苯丙酸乙酯初始浓度为5.15～100mmol/L，每L邻苯二甲酸二丁酯中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为4.3g/L的发酵液制成固定化颗粒在发酵培养基中增殖培养24小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重。

得到的(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯纯品用气相色谱-质谱联用仪进行检测确定产物的纯度和分子量。

摩尔转化率和产物(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯对映体过剩值(ee％)的确定：

采用安捷伦1200液相色谱仪分析检测。色谱柱为手性柱，型号为Daicel OB；流动相为正己烷/异丙醇(80/20)；紫外检测波长为254nm。手性柱可以检测到(R)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯和(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯两种对映体的含量，进一步计算出反应的摩尔转化率和(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯的对映体过剩值(ee％)。

采用的微生物转化法制备(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯与化学合成法相比具有以下优点：①生物催化剂比化学催化剂成本低廉。②环境友好，反应条件温和，常温常压下即可顺利进行转化。③生产所用的菌株安全无毒。④不受季节影响，易于实现大规模工业化生产。⑤生产操作简便，生物转化率较高。

采用固定化细胞在邻苯二甲酸二丁酯中进行生物转化与传统的生物转化相比具有如下优点：①固定化细胞作为生物催化剂有利于实现产物的分离提取。②固定化细胞作为生物催化剂有利于实现催化剂的重复利用，节约成本。③易于实现大规模工业化生产。④邻苯二甲酸二丁酯可以溶解大量的底物和产物，可以降低有机底物和产物对生物催化反应过程的抑制作用，提高底物的转化量，提高生物转化的生产效率。

本发明有益效果主要体现在：提供了一株可供生物转化β-羟基苯丙酸乙酯为(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯的新菌株，利用本发明方法生产的(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯对映体过剩值大于99.0％，底物摩尔转化率可以达到92.2％，产品纯度达到99.8％，硅胶柱层析产物提取收率为95.6％，固定化细胞颗粒可以重复利用10次。

(四)附图说明

图1为本发明实施例1工艺流程图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

工艺流程图参见图1。

斜面培养：

将CGMCC No.2266菌种接种至斜面培养基，30℃培养4～6天，得斜面菌种。斜面培养基配制：麦芽汁10g，酵母粉3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂20g，水1000g，pH自然，121℃灭菌20分钟，冷却制成斜面。

种子培养和发酵培养：

种子和发酵培养基均采用液体培养基，按如下组成配制：葡萄糖30g，酵母粉3g，硫酸铵5g，无水MgSO₄ 0.25g，K₂HPO₄·3H₂O 1g，KH₂PO₄ 1g，水1000g，pH自然，121℃灭菌20分钟，冷却备用。用接种针从斜面培养基中取一环斜面菌种接种在含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180r/min的条件下培养24h获得种子液。将种子液以体积比10％的接种量接种于含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180r/min的条件下培养24h获得发酵液，用获得的发酵液用于菌体的固定化。

将5瓶菌体干重为430mg的100ml发酵液分别与100ml的浓度为1％、2％、3％、4％和5％(w/w％)的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液分别装入注射器，滴入3.5％(w/w％)CaCl₂溶液中形成固定化颗粒，颗粒直径大小为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在液体培养基中增殖培养24h。

将上述5种增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入到含有15.45mmolβ-羰基苯丙酸乙酯的300ml邻苯二甲酸二丁酯中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化过程中每隔8h取样，采用液相色谱测定产物含量和对映体过剩值，结果如表1所示。结果表明，固定化过程中，海藻酸钠的浓度对固定化细胞颗粒的生物转化能力有影响，当海藻酸钠的浓度为最佳浓度2％时，生物转化的摩尔转化率可以达到72.8％，在5种不同浓度的海藻酸钠包埋条件下获得的固定化CGMCC No.2266颗粒转化底物所得到的(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0％。

表1：不同浓度的海藻酸钠溶液固定化CGMCCNo.2266转化β-羰基苯丙酸乙酯

实施例2：

将CGMCC No.2266按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将4瓶菌体干重为430mg的100ml发酵液分别与100ml浓度为2％(w/w％)的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液分别装入针头尺寸不同的注射器中，滴入3.5％(w/w％)CaCl₂溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径大小分别为2mm、3mm、4mm和5mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在液体培养基中增殖培养24h。

将上述4种增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入到含有15.45mmolβ-羰基苯丙酸乙酯的300ml邻苯二甲酸二丁酯中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化过程中每隔8h取样，采用液相色谱测定产物含量和对映体过剩值，结果如表2所示。结果表明，固定化细胞颗粒直径的不同对生物转化的摩尔转化率有影响，当最佳固定化细胞颗粒直径为2mm时，生物转化的摩尔转化率达到72.8％，以上述四种直径的固定化颗粒作为催化剂制备的(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0％。

表2：不同粒径的固定化细胞颗粒转化β-羰基苯丙酸乙酯

实施例3：

将CGMCC No.2266按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将4瓶菌体干重为430mg的发酵液100ml分别与100ml浓度为2％(w/w％)的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液分别装入注射器中，滴入3.5％(w/w％)CaCl₂溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的4瓶固定化细胞颗粒分别继续在液体培养基中增殖培养0h、24h、48h和72h。

将上述4种增殖培养好的固定化细胞颗粒分别加入含有15.45mmolβ-羰基苯丙酸乙酯的300ml邻苯二甲酸二丁酯中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化结束后，采用液相色谱测定产物含量和对映体过剩值，结果如表3所示。结果表明，固定化细胞颗粒的增殖培养时间越长越有利于摩尔转化率的提高，增殖培养时间达到72h的固定化细胞颗粒用于转化β-羰基苯丙酸乙酯摩尔转化率可以达到79.8％，以上述4种不同的增殖培养时间获得的固定化细胞颗粒为生物催化剂制备的(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0％。

表3：不同增殖培养时间的固定化细胞颗粒转化β-羰基苯丙酸乙酯

增殖培养时间(h)	0	24	48	72
					摩尔转化率(％)	0	72.8	76.5	79.8

实施例4：

将CGMCC No.2266按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将菌体干重为430mg的发酵液100ml与等100ml浓度为2％(w/w％)的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液装入注射器中，滴入3.5％(w/w％)CaCl₂溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在液体培养基中增殖培养72h。

将上述增殖培养好的固定化细胞颗粒加入到含有15.45mmolβ-羰基苯丙酸乙酯的300ml邻苯二甲酸二丁酯中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化结束后过滤出固定化细胞颗粒，将固定化细胞颗粒重新悬浮在300ml邻苯二甲酸二丁酯中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，如此重复利用固定化细胞颗粒10次，每次都采用液相色谱测定产物含量和对映体过剩值。结果如表4所示。结果表明，固定化细胞颗粒可以很好地重复利用于(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯的生物合成，产物(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0％，第10次的摩尔转化率为第一次摩尔转化率的48.4％。

表4：固定化CGMCC No.2266转化β-羰基苯丙酸乙酯的重复利用

重复利用次数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											摩尔转化率(％)	79.8	78.2	75.5	67.5	63.6	58.2	52.1	48.9	44.7	38.6

实施例5：

将CGMCC No.2266按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将菌体干重为430mg的100ml发酵液与100ml浓度为2％(w/w％)的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液装入注射器中，滴入3.5％(w/w％)CaCl₂溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在液体培养基中增殖培养72h。

将上述增殖培养好的固定化细胞颗粒加入到5瓶β-羰基苯丙酸乙酯初始浓度分别为17.17mmol/L、34.33mmol/L、51.5mmol/L、68.67mmol/L和85.83mmol/L的300ml邻苯二甲酸二丁酯中，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，结果如表5所示。结果表明，底物初始浓度对固定化细胞生物转化β-羰基苯丙酸乙酯的摩尔转化率有较大影响。反应的摩尔转化率随着底物浓度的提高而降低。说明底物的量增高对生物转化存在抑制作用。当底物初始浓度为17.17mmol/L时，反应的摩尔转化率可以达到92.2％。在上述5种不同的底物初始浓度条件下的生物转化过程中，产物(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯的对映体过剩值均大于99.0％。

表5：固定化CGMCCNo.2266转化不同初始浓度的β-羰基苯丙酸乙酯

β-羰基苯丙酸乙酯的初始浓度(mmol/L)	17.17	34.33	51.5	68.67	85.83
						摩尔转化率(％)	92.2	85.3	79.8	60.5	51.2

实施例6：

将CGMCC No.2266按照实例1中的方法培养获得菌体发酵液。将菌体干重为430mg的100ml发酵液与100ml浓度为2％(w/w％)的海藻酸钠溶液混合制成混合液，将混合液装入注射器中，滴入3.5％(w/w％)CaCl₂溶液中形成固定化颗粒，形成的固定化颗粒直径为2mm，于37℃固化30min，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，洗去过量的钙离子和未捕获的细胞，将获得的固定化细胞颗粒继续在液体培养基中增殖培养72h。

将上述增殖培养好的固定化细胞颗粒加入到300ml邻苯二甲酸二丁酯中，转化开始时加入底物5.15mmol，间隔12h加入5.15mmol底物，共加入底物15.45mmol，30℃、180r/min的条件下进行生物转化72h，转化结束后用液相色谱测定产物含量和对映体过剩值。结果表明，分批加入底物有利于提高反应的转化率。一次性加入15.45mmol底物的摩尔转化率为79.8％，即可以生成12.33mmol(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯。按上述方法分3次加入底物的总转化率为92.0％，即可以生成14.21mmol(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯，产物的对映体过剩值大于99.0％。

Claims (10)

1.酿酒酵母CGMCC No.2266，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCCNo.2266，保藏日期2007年11月26日。

2.酿酒酵母CGMCC No.2266在微生物转化制备(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以β-羰基苯丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母CGMCC No.2266发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，在邻苯二甲酸二丁酯中，于25～35℃转化反应8～72小时，转化液经分离纯化得到所述(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述邻苯二甲酸二丁酯中底物β-羰基苯丙酸乙酯的初始浓度为5.15～100.0mmol/L。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：每L邻苯二甲酸二丁酯中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为3.0～10.0g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在液体培养基中增殖培养16～72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重；所述发酵液中菌体浓度定义为：菌体干重与发酵液体积之比。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述固定化细胞颗粒由如下方法制备得到：将经酿酒酵母CGMCC No.2266发酵培养获得的发酵液与等体积1～5％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为3.0～10.0g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入2.5～4.0％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于35～38℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒，将得到的固定化颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养16～72h获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述固定化细胞颗粒粒径为1～5mm。

8.如权利要求2～7之一所述的应用，其特征在于所述的应用按如下方法获得发酵液：

(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2266接种至斜面培养基，26～35℃培养4～6天得到斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为：麦芽汁5～15g/L，酵母粉2～4g/L，蛋白胨4～6g/L，葡萄糖7～12g/L，琼脂15～25g/L，溶剂为水，pH自然；灭菌后冷却制成斜面；

(2)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基，28～32℃、150～200r/min培养18～28h，得种子液；种子培养基终浓度组成为：葡萄糖26～32g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵3～6g/L，无水MgSO₄ 0.2～0.4g/L，K₂HPO₄·3H₂0 0.5～1.5g/L，KM₂PO₄ 0.6～1.5g/L，溶剂为水，pH自然，灭菌后冷却；

(3)将种子液以体积比5～20％的接种量，接种至发酵培养基，28～32℃、150～200r/min培养18～28h，得发酵液；发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖26～32g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵3～6g/L，无水MgSO₄ 0.2～0.4g/L，K₂HPO₄·3H₂0 0.5～1.5g/L，KH₂PO₄0.6～1.5g/L，溶剂为水，pH自然，灭菌后冷却。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于按如下方法获得所述的生物催化剂：将发酵液与等体积2％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为4.3g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入3.5％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于37℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒；得到的固定化细胞颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养24h，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的应用为：以β-羰基苯丙酸乙酯为底物，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂，在邻苯二甲酸二丁酯中，于30℃、180r/min条件下转化反应72小时，转化液过滤，取滤液脱去溶剂邻苯二甲酸二丁酯，再经硅胶柱层析分离，得到所述(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯；邻苯二甲酸二丁酯中，底物β-羰基苯丙酸乙酯初始浓度为5.15～100mmol/L，每L邻苯二甲酸二丁酯中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为4.3g/L的发酵液制成固定化颗粒在发酵培养基中增殖培养24小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重。

Images