CN103725724A - 一种固定化蜂房哈夫尼菌生产尸胺的方法 - Google Patents

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乔长晟
彭巧
林青
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Abstract

本发明涉及一种固定化蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)AS1.1009生产尸胺的方法，属于微生物发酵领域。发明旨在利用微生物包埋技术，提高尸胺的生产率。方法为：（1）蜂房哈夫尼菌菌种三级培养；（2）在无菌条件下利用包埋载体将菌液包埋固定；（3）将固定化菌体投加到发酵罐中发酵转化生产尸胺；发酵后尸胺的转化率达95.31%-97.42%。本发明包埋的高浓度的蜂房哈夫尼菌种，不仅提供了高浓度的菌种微生物，而且包埋微生物颗粒增加了菌种的稳定性和底物浓度的耐受性，增加了酶活性，从而增加了尸胺的生产率。

Description

一种固定化蜂房哈夫尼菌生产尸胺的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种固定化蜂房哈夫尼菌生产尸胺的方法。
背景技术
尸胺，即1,5-二氨基戊烷，属于多胺中的二胺类，是尸体腐败产生气味中的成分之一。五碳化合物1,5-戊二胺（尸胺）作为一种生物基的平台化合物受到越来越多的关注，特别是作为新型的高性能生物基聚合物的构建单体。研究其生产菌株和生产工艺，供应生物基的1,5-戊二胺及其衍生品所能带来的巨大的经济效益也引起人们极大地兴趣。L一赖氨酸脱梭酶(L-lysinedecarboxylase,简称LDC,EC4.1.1.15),是可逆的将赖氨酸脱C02生成尸胺(1,5一戊二胺)的酶，此酶是诱导性胞内酶,需磷酸毗哆醛为辅酶促进脱羧反应，LDC存在于大肠杆菌、尸杆菌、蜂房哈夫尼菌等大多数微生物中。近年来，国内外学者对1,5-戊二胺的研究不断深入，从实验室水平的代谢途径和遗传基因，到工业中的扩大培养和提取衍生化，为1,5-戊二胺的大规模工业化生产提供了理论基础和技术指导。日本东丽尖端融合研究所用高效表达的大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌生产尸胺。蒋丽丽，焦庆才等研究了蜂房哈夫尼菌(H.alvei)As1.1009中，L-赖氨酸脱羧酶对L-赖氨酸的脱羧作用，分析了温度、pH、培养基、激活剂等因素对酶活的影响。但是依然存在尸胺发酵过程复杂，尸胺生产率不高，且发酵后菌体和发酵液分离困难等缺点。
包埋固定化微生物技术因为其包裹的微生物密度高、抗冲击能力强、稳定性好，适应性广等优点备受关注。传统发酵法利用蜂房哈夫尼菌生产尸胺，因为其发酵菌株浓度低，菌种对底物浓度的耐受性低，LDC的活性低，发酵转化后菌体和发酵液分离困难等缺点，使得尸胺的转化效率低，增加了生产成本。为此，研究一种利用包埋固定蜂房哈夫尼菌发酵生产尸胺，在转化过程中增加了菌种浓度、提高菌种底物的耐受性的包埋蜂房哈夫尼菌的技术是很有研究前景的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种固定化蜂房哈夫尼菌生产尸胺的方法。
技术方案如下：
（1）蜂房哈夫尼菌菌种三级培养；
（2）在无菌条件下利用包埋载体将菌种包埋固定；
（3）将固定化菌体投加到发酵罐中发酵转化生产尸胺。
所述的蜂房哈夫尼菌三级培养过程如下：
（1）一级培养-斜面培养：将试管菌种接种于斜面培养基，于35℃培养24-36h。
斜面培养基组成为（g/L）：蛋白胨10，牛肉浸膏5，NaCl5，玉米浆5，琼脂20，pH7.2。
（2）二级培养-种子培养：自一级斜面取1环菌接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，35℃，170r/min震荡培养12h。
种子培养基组成为（g/L）：蛋白胨10，牛肉浸膏5，NaCl5，玉米浆5，pH7.2。
（3）三级培养-发酵培养：将二级培养的种子液按5%接种量接入发酵罐，于35℃，通气量(v/v)1：1.5，搅拌转速300-600rpm，溶氧20%，培养24h。
发酵培养基组成为（g/L）：葡萄糖20，玉米浆20，酵母膏5，牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，硫酸铵2，维生素B61，pH7.0。
优选的发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，玉米浆20g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，硫酸铵2g/L，维生素B61g/L，pH7.0。
经过三级培养得到的发酵液菌体浓度为5.5×108-6.0×108个/ml。
所述的包埋载体各组分质量比为：海藻酸钠:聚乙烯醇=55-70：2-5。
所述菌种包埋固定的方法如下：称取55-70g的海藻酸钠加入1000mL蒸馏水中，然后加入2-5g聚乙烯醇混合均匀，放入高压灭菌锅内121℃，灭菌30min，在超净台内冷却至室温形成凝胶。将500mL蜂房哈夫尼菌发酵液离心收集菌体然后用10mL生理盐水重悬并加入到凝胶中，搅拌混合均匀后用无菌的10mL注射器滴加到含2%的经过灭菌的CaCl2溶液中，滴加完毕后放在超净台内室温继续交联10h，形成固定化小球，然后用经过灭菌的生理盐水洗涤3次既得包埋的蜂房哈夫尼菌颗粒。上述所有操作都必须在无菌条件下进行。
所述的发酵转化具体方法为：按5-10%w/v的接种量将包埋好的菌体加入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，培养基的初始pH为7.0，培养温度35℃，通气量(v/v)1：1.5，搅拌转速300-600rpm，溶氧20%，和搅拌相关联。发酵活化2h时，调节转速至70-100rpm，并关闭通风，用6mol/L的HCl在线调节发酵液的pH至5.5并维持恒定。连接灭菌后的200g/L的L-赖氨酸母液补料瓶，快速流加至发酵罐中L-赖氨酸的浓度为30g/L。转化过程中，每2h取样一次，用生物传感仪测定L-赖氨酸的浓度，当L-赖氨酸的浓度降至12g/L以下时，补加L-赖氨酸至30g/L。经过32h发酵后结束然后离心除去包埋的微生物颗粒。
所述的蜂房哈夫尼菌具体为蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)AS1.1009。
本发明的优点如下：（1）包埋的高浓度的蜂房哈夫尼菌种，不仅提供了高浓度的菌种微生物，而且包埋微生物颗粒增加了菌种的稳定性和底物浓度的耐受性，增加了酶活性，从而增加了尸胺的生产率。（2）包埋的高浓度蜂房哈夫尼菌种颗粒可长期保存，发酵使用方便，并且包埋颗粒可以重复使用，简化了发酵步骤、大大的缩短了发酵周期。（3）包埋的菌种微生物，在发酵转化过程中使用简便，且大大的简化了发酵液菌液分离的过程，大大降低了生产成本。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
一种包埋蜂房哈夫尼菌生产尸胺的方法，步骤如下：
1、将蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei AS1.1009)菌株进行活化6～8h，即将其从斜面培养基中取1环菌接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，35℃，170r/min震荡培养12h，得种子液。种子培养基组成为（g/L）：蛋白胨10，牛肉浸膏5，NaCl5，玉米浆5，pH7.2。
2、以5%的体积比将步骤2所得的种子液接到5L（装液量为3L）的发酵罐中，于35℃，通气量(v/v)1：1.5，搅拌转速300-600rpm，溶氧20%，培养24h。发酵培养基组成为（g/L）：葡萄糖20，玉米浆20，酵母膏5，牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，硫酸铵2，维生素B61，pH7.0。
3、菌种包埋固定：称取68g的海藻酸钠加入1000mL蒸馏水中，然后加入2g聚乙烯醇混合均匀，放入高压灭菌锅内121℃，灭菌30min，在超净台内冷却至室温形成凝胶。将500mL蜂房哈夫尼菌发酵液离心收集菌体然后用10mL生理盐水重悬并加入到凝胶中，搅拌混合均匀后用无菌的10mL注射器滴滴加到含2%的经过灭菌的CaCl2溶液中，滴加完毕后放在超净台内室温继续交联10h，形成固定化小球，然后用经过灭菌的生理盐水洗涤3次既得包埋微生物菌剂。上述所有操作都必须在无菌条件下进行。
4、按5%w/v的接种量将包埋好的种子加入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，培养基的初始pH=7.0，培养温度35℃，通气量(v/v)1：1.5，搅拌转速300-600rpm，溶氧20%，和搅拌相关联。发酵至2h时，调节转速至70-100rpm，并关闭通风，用6mol/L的HCl在线调节发酵液的pH至5.5并维持恒定。连接灭菌后的200g/L的L-赖氨酸母液补料瓶，快速流加至发酵罐中L-赖氨酸的浓度为30g/L。转化过程中，每2h取样一次，用生物传感仪测定L-赖氨酸的浓度，当L-赖氨酸的浓度降至12g/L以下时，补加L-赖氨酸至30g/L。经过32h发酵后结束然后离心除去包埋的微生物颗粒。尸胺产量为59.21g/L，转化率达96.42%。
实施例2
1、种子液的制备和所用菌种同实施例1。
2、发酵液制备同实施例1。
3、菌种包埋固定：称取70g的海藻酸钠加入1000mL蒸馏水中，然后加入2g聚乙烯醇混合均匀，放入高压灭菌锅内121℃，灭菌30min，在超净台内冷却至室温形成凝胶。将500mL蜂房哈夫尼菌发酵液离心收集菌体然后用10mL生理盐水重悬并加入到凝胶中，搅拌混合均匀后用无菌的10mL注射器滴加到含2%的经过灭菌的CaCl2溶液中，滴加完毕后放在超净台内室温继续交联10h，形成固定化小球，然后用经过灭菌的生理盐水洗涤3次既得包埋微生物菌剂。上述所有操作都必须在无菌条件下进行。
5、按7%w/v的接种量将包埋好的种子加入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，培养基的初始pH=7.0，培养温度35℃，通气量(v/v)1：1.5，搅拌转速300-600rpm，溶氧20%，和搅拌相关联。发酵至2h时，调节转速至70-100rpm，并关闭通风，用6mol/L的HCl在线调节发酵液的pH至5.5并维持恒定。连接灭菌后的200g/L的L-赖氨酸母液补料瓶，快速流加至发酵罐中L-赖氨酸的浓度为30g/L。转化过程中，每2h取样一次，用生物传感仪测定L-赖氨酸的浓度，当L-赖氨酸的浓度降至12g/L以下时，补加L-赖氨酸至30g/L。经过32h发酵后结束然后离心除去包埋的微生物颗粒。尸胺产量为57.51g/L，转化率达93.42%。
实施例3
1、种子液的制备和所用菌种同实施例1。
2、发酵液制备同实施例1。
3、发酵罐种子液包埋：称取75g的海藻酸钠加入1000mL蒸馏水中，然后加入4g聚乙烯醇混合均匀，放入高压灭菌锅内121℃，灭菌30min，在超净台内冷却至室温形成凝胶。将500mL蜂房哈夫尼菌发酵液离心收集菌体然后用10mL生理盐水重悬并加入到凝胶中，搅拌混合均匀后用无菌的10mL注射器滴加到含2%的经过灭菌的CaCl2溶液中，滴加完毕后放在超净台内室温继续交联10h，形成固定化小球，然后用经过灭菌的生理盐水洗涤3次既得包埋微生物菌剂。上述所有操作都必须在无菌条件下进行。
5、按8%w/v的接种量将包埋好的种子加入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，培养基的初始pH=7.0，培养温度35℃，通气量(v/v)1：1.5，搅拌转速300-600rpm，溶氧20%，和搅拌相关联。发酵至2h时，调节转速至70-100rpm，并关闭通风，用6mol/L的HCl在线调节发酵液的pH至5.5并维持恒定。连接灭菌后的200g/L的L-赖氨酸母液补料瓶，快速流加至发酵罐中L-赖氨酸的浓度为30g/L。转化过程中，每2h取样一次，用生物传感仪测定L-赖氨酸的浓度，当L-赖氨酸的浓度降至12g/L以下时，补加L-赖氨酸至30g/L。经过32h发酵后结束然后离心除去包埋的微生物颗粒。尸胺产量为60.51g/L，转化率达97.12%。
实施例4：发酵生产对比试验
实验组为将包埋的菌种按8%w/v的接种量加入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，对照组为将与实验组含有同等菌体量的发酵液接入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，其他反应条件相同，如下：培养基的初始pH=7.0，培养温度35℃，通气量(v/v)1：1.5，搅拌转速300-600rpm，溶氧20%，和搅拌相关联。发酵至2h时，调节转速至70-100rpm，并关闭通风，用6mol/L的HCl在线调节发酵液的pH至5.5并维持恒定。连接灭菌后的200g/L的L-赖氨酸母液补料瓶，快速流加至发酵罐中L-赖氨酸的浓度为30g/L。转化过程中，每2h取样一次，用生物传感仪测定L-赖氨酸的浓度，当L-赖氨酸的浓度降至12g/L以下时，补加L-赖氨酸至30g/L。经过32h发酵后结束然后离心除去微生物等杂质，提取尸胺。结果如表1。
表1
发酵液直接用于发酵 包埋菌种用于发酵
尸胺产量 35.27g/L 60.54g/L
尸胺转化率 70.54g/L 97.32g/L

Claims (5)

1.一种固定化蜂房哈夫尼菌生产尸胺的方法，包括如下步骤：
（1）蜂房哈夫尼菌菌种三级培养；
（2）在无菌条件下利用包埋载体将菌种包埋固定；
（3）将固定化菌体投加到发酵罐中发酵转化生产尸胺；
所述的蜂房哈夫尼菌具体为蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)AS1.1009。
2.根据权利要求1所述的一种固定化蜂房哈夫尼菌生产尸胺的方法，其特征在于：所述的三级培养过程如下：
（1）一级培养-斜面培养：将试管菌种接种于斜面培养基，于35℃培养24-36h。所述斜面培养的培养基组成为（g/L）：蛋白胨10，牛肉浸膏5，NaCl5，玉米浆5，琼脂20，pH7.2；
（2）二级培养-种子培养：自一级斜面取1环菌接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，35℃，170r/min震荡培养12h；
所述种子培养的培养基组成为（g/L）：蛋白胨10，牛肉浸膏5，NaCl5，玉米浆5，pH7.2；。
（3）三级培养-发酵培养：将二级培养的种子液按5%接种量接入发酵罐，于35℃，通气量(v/v)1：1.5，搅拌转速300-600rpm，溶氧20%，培养24h；
所述发酵培养的培养基组成为（g/L）：葡萄糖20，玉米浆20，酵母膏5，牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，硫酸铵2，维生素B61，pH7.0。
3.根据权利要求1所述的一种固定化蜂房哈夫尼菌生产尸胺的方法，其特征在于：所述包埋载体各组分质量比为：海藻酸钠:聚乙烯醇=55-70：2-5。
4.根据权利要求1所述的一种固定化蜂房哈夫尼菌生产尸胺的方法，其特征在于：所述包埋固定的具体方法如下：称取55-70g的海藻酸钠加入1000mL蒸馏水中，然后加入2-5g聚乙烯醇混合均匀，放入高压灭菌锅内121℃，灭菌30min，在超净台内冷却至室温形成凝胶；将500mL蜂房哈夫尼菌发酵液离心收集菌体然后用10mL生理盐水重悬并加入到凝胶中，搅拌混合均匀后用无菌的10mL注射器滴加到含2%的经过灭菌的CaCl2溶液中，滴加完毕后放在超净台内室温继续交联10h，形成固定化小球，然后用经过灭菌的生理盐水洗涤3次既得包埋的蜂房哈夫尼菌颗粒；上述所有操作都必须在无菌条件下进行。
5.根据权利要求1所述的一种固定化蜂房哈夫尼菌生产尸胺的方法，其特征在于：
所述发酵转化生成尸胺的具体方法为：按5-10%w/v的接种量将包埋好的菌体加入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，培养基的初始pH为7.0，培养温度35℃，通气量(v/v)1：1.5，搅拌转速300-600rpm，溶氧20%，和搅拌相关联。发酵活化2h时，调节转速至70-100rpm，并关闭通风，用6mol/L的HCl在线调节发酵液的pH至5.5并维持恒定；连接灭菌后的200g/L的L-赖氨酸母液补料瓶，快速流加至发酵罐中L-赖氨酸的浓度为30g/L；转化过程中，每2h取样一次，用生物传感仪测定L-赖氨酸的浓度，当L-赖氨酸的浓度降至12g/L以下时，补加L-赖氨酸至30g/L；32h发酵结束后离心除去包埋的微生物颗粒。
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