CN109706192B - 一种c19～c21长链二元酸的发酵生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种C19～C21长链二元酸的发酵生产方法。本发明公开了一种利用热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468发酵生产C19～C21长链二元酸的方法，热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468能够在高温条件下生长，并且能够将不同碳链长度的C19～C21正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸衍生物高效转化为C19～C21长链二元酸，实现高温发酵和C19～C21长链二元酸的高效生产，可在实践中用于C19～C21长链二元酸的发酵生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和生物发酵领域，具体涉及一种C19～C21长链二元酸的发酵生产方法。
背景技术
长链二元酸是合成香料、尼龙工程塑料、热熔胶、树脂、耐寒性增塑剂、医药和农药等制品的重要原料，其结构式为HOOC(CH2) nCOOH，其中n为≥9的整数。长链二元酸中的十二碳二元酸(DC12) 和十四碳二元酸(DC14)分别是合成具有特殊性能和广泛用途的高级尼龙工程塑料——尼龙1212和尼龙1414等的重要原料。十二碳以上的长链二元酸在自然界中不存在，需要人工设计合成。化学法合成十二碳以上的长链二元酸具有反应路线长、反应需要高温高压、对催化剂要求比较苛刻等问题，合成较为困难，因此，在工业规模上的长链二元酸品种较少，目前仅有十二碳长链二元酸等少数品种。利用微生物的特异性底物转化能力，在常温常压下转化正烷烃或脂肪酸生成相应的长链二元酸，是目前长链二元酸生产的研究重点。生物法生产长链二元酸的主要优点在于，可以使用相同的微生物、相同的设备和培养基，通过添加不同的底物生产各种不同碳链长度的长链二元酸，而化学合成法在一次制备过程中仅能生产单一品种的长链二元酸。
关于长链二元酸发酵生产的现有技术中，中国专利CN1139659C (公布日为2002年9月18日)公开了一种利用微生物同步发酵正十四烷(nC14)高产十二烷1，1 2～二羧酸(DC14)的方法，为利用突变株 NP～6～5在以C11～C18各种正烷烃为基质的培养基中发酵，发酵的温度控制在27～31℃。中国专利CN1502700A(公布日为2004年6月9日) 公开了一种利用微生物氧化C14正烷烃高产α、ω～正长链十四碳二元酸(DCA14)的方法，发酵温度控制在28～35℃。中国专利CN1928100A (公布日为2007年3月14日)公开了一种利用生物合成生产长链α、ω～二羧酸的方法，特别是高产十二碳二元酸(DC12)的方法，其发酵温度控制在26～32℃。中国专利CN101225411A(公布日为2008年7 月23日)公开了一种利用生物合成生产长链α、ω～二羧酸的方法，特别是高产C11～C14混合长链二元酸(DCm)的方法，发酵温度控制在26～32℃。
在长链二元酸的发酵生产过程中，菌体自身的呼吸代谢作用导致发酵培养物温度的不断上升，尤其在环境温度较高时(如夏天)最为明显。在二元酸工业生产中，为了维持常用的发酵菌株热带假丝酵母的最适发酵温度(29℃～32℃)，需要利用大量冷却水为发酵体系冷却降温，环境温度较高时，用于冷却降温的水也需要预先冷却降温，从而使得二元酸发酵生产的电能消耗、设备投资、人员投入大幅度增加，导致生产成本的增加，并且不利于节能减排。更重要的是，碳链长度超过C18的长链二元酸(如C19、C20和C21)的发酵底物(长链烷烃、脂肪酸及其衍生物)在较低的温度条件下以固体或半固体形式存在，极大地降低了发酵菌株对于发酵底物的利用率，导致发酵的底物转化率较低，C19～C21长链二元酸的产量较低。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种 C19～C21长链二元酸的发酵生产方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明利用热带假丝酵母(Candidatropicalis)10468的耐高温特性以及能够高效转化底物生产C19～C21的长链二元酸的性能，开发了一种适用于C19～C21长链二元酸的高效发酵生产方法。根据热带假丝酵母(Candida tropicalis) 10468的特性、C19～C21的烷烃及其类似物的发酵底物以及C19～C21 长链二元酸产物的性质，通过优化发酵生产的温度、底物添加量、各级培养的培养基等发酵生产条件，得到了利用热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468高效发酵生产C19～C21长链二元酸的方法。
本发明所述的热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468为以长链二元酸生产菌株热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145(保藏编号为CCTCC NO:M2011192，中国专利CN 102839133A)为出发菌株，通过驯化和常规诱变方法进行诱变育种选育得到的一株耐高温热带假丝酵母，该菌株能够在高达41℃的温度条件下正常生长，并且能够在高温条件下高效地转化底物生产长链二元酸。本发明所述的热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468已于2017年4月1日进行生物保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号：CCTCC NO:M2017164，分类命名为Candida tropicalis。。
首先，本发明提供热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468在生产长链二元酸中的应用，所述长链二元酸为C19～C21长链二元酸中的一种或多种。
上述热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468在生产长链二元酸中的应用，利用了热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468的功能，因此，热带假丝酵母(Candidatropicalis)10468或含有热带假丝酵母 (Candida tropicalis)10468的菌剂在发酵生产C19～C21长链二元酸中的一种或多种中的应用，均在本发明的保护范围内。
具体地，所述应用为利用热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468 发酵生产长链二元酸，所述长链二元酸为C19、C20、C21直链饱和二元酸中的一种或多种；所述发酵的温度为29℃～41℃。
优选地，所述发酵的温度选自如下温度范围：29～41℃、29.5～41℃、 30～41℃、30.5～41℃、31～41℃、31.5～41℃、32～41℃、32.5～41℃、 33～41℃、33.5～41℃、34～41℃、34.5～41℃、35～41℃、35.5～41℃、 36～41℃、36.5～41℃、37～41℃、37.5～41℃、38～41℃、38.5～41℃、 39～41℃、39.5～41℃、40～41℃或40.5～41℃。高温条件有利于发酵底物的溶解，进而有利于提高底物转化率，因此，优选地，所述发酵的温度为33～41℃。
进一步地，本发明还提供一种长链二元酸的生产方法，其包括发酵热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468或含有所述热带假丝酵母 (Candida tropicalis)10468的菌剂，得到长链二元酸的步骤；所述长链二元酸为C19～C21长链二元酸。
本发明中，C19～C21长链二元酸即为碳原子数为C19、C20或C21 的长链二元酸，即十九碳长链二元酸、二十碳长链二元酸和二十一碳长链二元酸。
本发明提供的长链二元酸的生产方法中，所述长链二元酸为C19、 C20或C21直链饱和二元酸中的一种或多种；所述发酵的温度为29℃～41℃。优选地，所述发酵的温度选自如下温度范围：33～41℃、 33.5～41℃、34～41℃、34.5～41℃、35～41℃、35.5～41℃、36～41℃、 36.5～41℃、37～41℃、37.5～41℃、38～41℃、38.5～41℃、39～41℃、 39.5～41℃、40～41℃或40.5～41℃。
本发明中，所述发酵的底物为C19～C21的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种。
C19～C21的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种即为碳链长度为C19、C20、C21中的一种或多种的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种。
本发明中，碳链长度为C19、C20、C21的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯或直链饱和脂肪酸盐底物可以被热带假丝酵母 (Candida tropicalis)10468转化为发酵底物对应的碳链长度的长链二元酸，当发酵底物为不同碳链长度的混合物时，也可以被热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468转化为各种不同碳链长度的发酵底物对应的多种碳链长度的长链二元酸的混合物。即本发明中，可以根据需要生产的长链二元酸的碳链长度选择碳链长度相对应的发酵底物。
作为本发明的优选实施方式，所述发酵的底物的添加量为 100～400mL/L；所述底物的添加可以采用一次添加或在发酵过程中分批次添加。
具体地，本发明所述的长链二元酸的生产方法包括如下步骤：
(1)菌种活化培养：将所述的热带假丝酵母(Candida tropicalis) 10468接种于活化培养基，进行活化培养；
(2)种子培养：将活化的菌种接种于种子培养基中，在29℃～41℃培养至种子成熟；
优选地，种子培养时的温度选自如下温度范围或如下温度范围的任意组合：29～41℃、29.5～41℃、30～41℃、30.5～41℃、31～41℃、 31.5～41℃、32～41℃、32.5～41℃、33～41℃、33.5～41℃、34～41℃、 34.5～41℃、35～41℃、35.5～41℃、36～41℃、36.5～41℃、37～41℃、37.5～41℃、38～41℃、38.5～41℃、39～41℃、39.5～41℃、40～41℃或40.5～41℃；
(3)发酵培养：将获得的种子培养液接种于含有发酵底物的发酵培养基中，在29℃～41℃的温度条件下，进行长链二元酸的发酵生产。
本发明中，所述发酵培养可以选择本领域常用的发酵培养基，一般地，所述发酵培养的培养基含有碳源、氮源及无机离子。
所述碳源包括但不限于蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖和山梨醇中的一种或多种。
所述氮源包括但不限于酵母膏、玉米浆、尿素、氨水、硫酸铵、硝酸钾和硝酸铵中的一种或多种。
所述无机盐包括但不限于钾盐、钠盐、镁盐中的一种或多种。其中，所述钾盐包括但不限于氯化钾、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或多种；所述钠盐包括但不限于氯化钠、硝酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的一种或多种。
根据需要，所述培养基还可以包括铁离子、锰离子等微量元素或者氨基酸、维生素等营养成分。
根据热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468的特性、C19～C21 的烷烃底物以及C19～C21长链二元酸产物的性质，本发明进行了发酵培养基的筛选优化，作为本发明的优选实施方式，所述发酵培养基包括如下组分：蔗糖10～40g/L，玉米浆1～5g/L，酵母膏1～5g/L，磷酸二氢钾4～12g/L，硝酸钾4～10g/L，氯化钠0～3g/L，尿素0.5～3g/L，发酵的底物为C19～C21正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种，添加量为100～400mL/L。采用上述发酵培养基能够进一步促进热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468 生长代谢以及转化底物发酵生产C19～C21长链二元酸。
本发明中，所述发酵的底物的添加可以采用一次添加或在发酵过程中分批次添加，总添加量为100～400mL/L。
根据热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468的特性以及上述发酵培养基，本发明进一步进行了种子培养基的筛选和优化，作为本发明的优选实施方式，所述种子培养基包括如下组分：蔗糖10～20g/L，玉米浆2～4g/L，酵母膏3～8g/L，磷酸二氢钾4～12g/L，尿素0.5～4g/L；优选还含有发酵的底物如C19～C21正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种0～80mL/L。采用上述种子培养基有利于热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468的快速生长，获得活力较高的种子培养液，保证菌种在接种发酵培养基后能够快速适应，进入发酵阶段。
本发明中，所述发酵培养的pH为6.0～8.0。可以使用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH。
本发明中，所述种子培养的时间为12～48h。种子成熟为种子培养液的OD620为15～30，稀释30倍时OD620为0.5～1.0；所述发酵培养的种子培养液的接种量为10％～30％。
本发明中，所述菌种活化培养的活化培养基优选为YPD培养基，包括如下组分：葡萄糖2.0％(w/v)、酵母膏1.0％(w/v)、蛋白胨2.0％ (w/v)、琼脂2.0％(w/v)。
作为本发明的优选实施方式，所述长链二元酸的生产方法包括如下步骤：
(1)菌种活化培养：将热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468 接种于YPD培养基中，摇床振荡培养24～48h。
(2)种子培养：将活化的菌种接种于种子培养基中，在29～41℃的温度条件下培养36～48h。当种子培养基中含有发酵的底物如 C19～C21正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种，培养的温度进而优选33～41℃。
(3)发酵培养：当种子培养液的OD620为15～30(稀释30倍时 OD620为0.5～1.0)，将种子培养液接种至发酵培养基中，在29～41℃的发酵温度下，发酵生产长链二元酸。
进一步地，本发明还提供利用所述的生产方法制备得到的C19、 C20、C21长链二元酸。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468，生长和发酵的温度适应范围广：该菌株能够在29～41℃的温度条件下发酵培养，OD620可以达到15～30，而现有技术中的其它的热带假丝酵母在29～41℃下培养，OD620远低于15(稀释30倍后测定为0.5)，说明本发明菌株能够适应高温条件发酵生长；同时，热带假丝酵母 (Candida tropicalis)10468能够在温度高于35℃的条件下，将不同碳链长度的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸衍生物(如直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐)或上述底物中两种以上的混合物高效地转化为相应碳链长度的长链二元酸；利用该菌株的上述特性，本发明提供了高温发酵生产C19、C20、C21长链二元酸的方法，由于在高温条件下，C19、C20、C21的发酵底物能够以液态的状态存在，使得菌株对底物的转化效率显著提升，极大地提高了C19、C20、C21超长链二元酸的产量，实现了C19、C20、C21超长链二元酸的高效发酵生产。
(2)本发明中，高温发酵显著降低了发酵过程中控制低温的水电资源，降低了C19、C20、C21长链二元酸的发酵生产成本。
附图说明
图1为本发明实施例1的热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468 的第一代的菌落形态图片。
图2为本发明实施例1的热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468 的第六代的菌落形态图片。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中如无特殊说明，使用的培养基的配制方法为常规方法，于115℃灭菌20分钟。培养基中使用的酵母膏总氮含量为6.5wt％，所用玉米浆的总氮含量为2.5wt％。
以下实施例中使用的YPD活化培养基：葡萄糖2.0％(w/v)、酵母膏1.0％(w/v)、蛋白胨2.0％(w/v)、琼脂2.0％(w/v)，余量为水。培养温度29～30℃，摇床转速200rpm，培养时间24h。
以下实施例中发酵初始时，发酵液中的底物浓度100-400mL/L，均用NaOH溶液调节发酵培养基的pH至7.5。
以下实施例中采用气相色谱法测定二元酸，具体检测方法如下：
发酵液经前处理后进行气相色谱检测(内标法)，色谱条件如下：色谱柱：SupelcoSPB-50 30m*0.53mm*0.5μm(货号54983)；气相色谱仪(Shimadzu，GC-2014)。
检测方法：初温100℃，15℃/min升温至230℃,保持2min。载气为氢气，进样口温度280℃，FID温度280℃，进样量4μL。
根据产物的峰面积和已知浓度的内标的峰面积的比例进行产物浓度的计算。
实施例1热带假丝酵母10468的稳定性验证
本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468，经连续传代实验验证，其形态、生长和生产性能的稳定性良好。经五次传代后菌落形态未出现明显变化：菌落表面光滑湿润呈乳白色有光泽、圆形、边缘整齐(如图1和图2所示)。结果表明，热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468的传代稳定性良好。
本实施例还提供热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468发酵生产十二碳二元酸(DC12)的方法，具体如下：
将第一代和第六代菌株进行摇瓶发酵生产DC12的性能验证。取 1支热带假丝酵母10468的甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接种于种子培养基。种子培养基配方如下：蔗糖20g/L，玉米浆2g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾8g/L，尿素2g/L，正烷烃n-C1233mL/L；在35℃条件下培养48h，测得种子液的OD620达到了0.8(稀释30倍后测定)。
将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基配方如下：蔗糖40g/L，玉米浆5g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾8g/L，硝酸钾 4g/L，氯化钠1.5g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中添加底物正烷烃 n-C12，添加量为233mL/L。在35℃条件下发酵，发酵结束后，测定第一代和第六代菌株的DC12二元酸产量分别为171.40g/L和 171.65g/L。在40℃条件下发酵结束后，测定第一代和第六代菌株的发酵液中的DC12二元酸的含量为167.00g/L和168.50g/L。
实施例2
本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468发酵生产DC19的方法，具体如下：
取1支热带假丝酵母10468的甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基。种子培养基配方如下：蔗糖20g/L，玉米浆2g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾8g/L，尿素2g/L，正烷烃n-C19 33mL/L；在33℃条件下培养48h，测得种子液的OD620达到了0.8(稀释30倍后测定)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中。发酵培养基包括配方如下：蔗糖40g/L，玉米浆5g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾8g/L，硝酸钾4g/L，氯化钠1.5g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中添加底物正烷烃n-C19，添加量为233mL/L。在33℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC19二元酸的含量为78.55g/L。
实施例3
本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468发酵生产DC19的方法，具体如下：
取1支热带假丝酵母10468的甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基。种子培养基配方如下：蔗糖20g/L，玉米浆2g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾8g/L，尿素2g/L，正烷烃n-C19 33mL/L；在35℃条件下培养48h，测得种子液的OD620达到了0.8(稀释30倍后测定)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中。发酵培养基配方如下：蔗糖40g/L，玉米浆5g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾 8g/L，硝酸钾4g/L，氯化钠1.5g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中添加底物正烷烃n-C19，添加量为233mL/L。在35℃条件下发酵，发酵结束后，测定发酵液中的DC19二元酸的含量为110.32g/L。
实施例4
本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468发酵生产DC19的方法，具体如下：
取1支热带假丝酵母10468的甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基。种子培养基配方如下：蔗糖20g/L，玉米浆2g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾8g/L，尿素2g/L，正烷烃n-C19 33mL/L；在35℃培养48h，测得种子液的OD620为0.5(稀释30倍后测定)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基配方如下：蔗糖40g/L，玉米浆5g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾8g/L，硝酸钾 4g/L，氯化钠1.5g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中添加底物正烷烃 n-C19，添加量为233mL/L。在40℃条件下发酵，发酵结束后，测定发酵液中的DC19二元酸的含量为120.50g/L。
实施例5
本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468发酵生产DC19的方法，具体如下：
取1支热带假丝酵母10468的甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基。种子培养基配方如下：蔗糖20g/L，玉米浆2g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾8g/L，尿素2g/L，正烷烃n-C19 33mL/L；在41℃培养48h，测得种子液的OD620为0.5(稀释30倍后测定)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基配方如下：蔗糖40g/L，玉米浆5g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾8g/L，硝酸钾 4g/L，氯化钠1.5g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中添加底物正烷烃 n-C19，添加量为400mL/L。在41℃条件下发酵，发酵结束后，测定发酵液中的DC19二元酸的含量为247.10g/L。
实施例6
本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468发酵生产DC19的方法，具体如下：
取1支热带假丝酵母10468的甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基。种子培养基配方如下：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾10g/L，尿素2g/L，发酵底物十九碳脂肪酸甲酯66mL/L；在40℃培养48h，测得种子液的OD620为 0.55(稀释30倍后测定)。将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基配方如下：蔗糖35g/L，玉米浆3g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾10g/L，硝酸钾5g/L，氯化钠1.5g/L，尿素1.5g/L，发酵培养基中添加发酵底物十九碳脂肪酸甲酯233mL/L。在40℃条件下发酵，发酵结束后，测定发酵液中的DC19二元酸的含量为100.05g/L。
实施例7
本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468发酵生产DC20的方法，具体如下：
取1支热带假丝酵母10468的甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基。种子培养基配方如下：蔗糖15g/L，玉米浆3g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾4g/L，尿素4g/L，正烷烃n-C20 33mL/L；在40℃条件下培养48h，测得种子液的OD620为0.9(稀释30 倍后测定)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基配方如下：蔗糖30g/L，玉米浆3g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾4g/L，硝酸钾10g/L，氯化钠2g/L，尿素3g/L。发酵培养基中添加底物正烷烃为n-C20，添加量为233mL/L。在40℃条件下发酵，发酵结束后，测定发酵液中的DC20二元酸的含量为99.12g/L。
实施例8
本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468发酵生产DC20的方法，具体如下：
取1支热带假丝酵母10468的甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基。种子培养基配方如下：蔗糖15g/L，玉米浆3g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾4g/L，尿素4g/L，正烷烃n-C20 33mL/L；在29℃条件下培养48h，测得种子液的OD620达到0.9(稀释 30倍后测定)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基配方如下：蔗糖30g/L，玉米浆3g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾4g/L，硝酸钾10g/L，氯化钠2g/L，尿素3g/L。发酵培养基中添加底物正烷烃为n-C20，添加量为233mL/L。在29℃条件下发酵结束后，测定发酵液中的DC20二元酸的含量为10.43g/L。
实施例9
本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468发酵生产DC21的方法，具体如下：
取1支热带假丝酵母10468的甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基。种子培养基配方如下：蔗糖10g/L，玉米浆2g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾4g/L，尿素0.5g/L，正烷烃n-C21 66mL/L；在35℃培养48h，测得种子液的OD620为0.75(稀释30倍后测定)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基配方如下：蔗糖10g/L，玉米浆1g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾4g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中添加底物正烷烃n-C21，添加量为233mL/L。在35℃条件下发酵，发酵结束后，测定发酵液中的DC21 二元酸的含量为90.62g/L。
实施例10
本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468发酵生产DC21的方法，具体如下：
取1支热带假丝酵母10468的甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基。种子培养基配方如下：蔗糖10g/L，玉米浆2g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾4g/L，尿素0.5g/L，正烷烃n-C21 66mL/L；在37℃条件下培养48h，测得种子液的OD620达到0.5(稀释 30倍后测定)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基配方如下：蔗糖10g/L，玉米浆1g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾4g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中添加底物正烷烃n-C21，添加量为233mL/L。在40℃条件下发酵，发酵结束后，测定发酵液中的 DC21二元酸的含量为95.68g/L。
实施例11
本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468发酵生产DC19，DC20和DC21的方法，具体如下：
取1支热带假丝酵母10468的甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基。种子培养基配方如下：蔗糖10g/L，玉米浆2g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾4g/L，尿素0.5g/L，正烷烃n-C19、 n-C20和n-C21共添加量为66mL/L，其中n-C19、n-C20和n-C21质量比为1:1:1；在39℃条件下培养48h，测得种子液的OD620达到0.5(稀释 30倍后测定)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基配方如下：蔗糖10g/L，玉米浆1g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾4g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中添加底物正烷烃n-C19、n-C20 和n-C21共添加量为234mL/L，其中n-C19、n-C20和n-C21质量比为 1:1:1。在39℃条件下发酵，发酵结束后，测定发酵液中的DC19、DC20 和DC21混合长链二元酸的含量为40.19g/L。
实施例12
本实施例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468发酵生产DC19和DC20的方法，具体如下：
取1支热带假丝酵母10468的甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基。种子培养基配方如下：蔗糖10g/L，玉米浆2g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾4g/L，尿素0.5g/L，正烷烃n-C19 和n-C20共添加量为66mL/L，其中n-C19和n-C20质量比为1:1；在36℃条件下培养48h，测得种子液的OD620达到0.5(稀释30倍后测定)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基配方如下：蔗糖 10g/L，玉米浆1g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾4g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中添加底物正烷烃n-C19和n-C20共添加量为 234mL/L，其中n-C19和n-C20质量比为1:1。在36℃条件下发酵，发酵结束后，测定发酵液中的混合长链二元酸的含量为51.23g/L。
对比例1
本对比例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145发酵生产DC12的方法，具体如下：
取1支热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基。种子培养基配方如下：蔗糖20g/L，玉米浆2g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾8g/L，尿素2g/L，正烷烃n-C12 33mL/L；在35℃培养48h，测得种子液的OD620为0.15(稀释30倍后测定)。将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基配方如下：蔗糖40g/L，玉米浆5g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾8g/L，硝酸钾4g/L，氯化钠1.5g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中添加底物正烷烃n-C12，添加量为233mL/L。在35℃条件下发酵，发酵结束后，测定发酵液中的DC12二元酸的含量为40.66g/L。由此可见，由于出发菌株CAT N145的耐高温性能较差，CAT N145在35℃培养时，生长受到严重抑制，DC12二元酸的发酵生产受到明显抑制。
对比例2
本对比例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145发酵生产DC19的方法，具体如下：
取1支热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基。种子培养基配方如下：蔗糖20g/L，玉米浆2g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾8g/L，尿素2g/L，正烷烃n-C19 33mL/L；在33℃培养48h，测得种子液的OD620为0.1(稀释30倍后测定)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基配方如下：蔗糖40g/L，玉米浆5g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾8g/L，硝酸钾4g/L，氯化钠1.5g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中添加底物正烷烃n-C19，添加量为233mL/L。在33℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC19二元酸的含量为5.28g/L。由此可见，由于出发菌株CAT N145的耐高温性能较差，CAT N145在33℃培养时，生长受到严重抑制，DC19二元酸的发酵生产受到明显抑制。
对比例3
本对比例提供一种热带假丝酵母(Candida tropicalis)ES4-6-5发酵生产DC20的方法，具体如下：
取1支热带假丝酵母(Candida tropicalis)ES4-6-5(中国专利 CN1502700A，公布日为2004年6月9日)甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基。种子培养基配方如下：种子培养基：蔗糖15g/L，玉米浆3g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾4g/L，尿素4g/L；正烷烃n-C20 33mL/L；在40℃条件下培养48h，测得种子液的OD620为0.15(稀释30倍后测定)。将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基配方如下：蔗糖30g/L，玉米浆3g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾4g/L，硝酸钾10g/L，氯化钠2g/L，尿素3g/L。发酵培养基中添加底物正烷烃为n-C20，添加量为233mL/L。在40℃条件下发酵，发酵结束后，测定发酵液中的DC20二元酸的含量为6.08 g/L。由此可见，ES4-6-5菌株在40℃培养，生长受到严重抑制，DC20 二元酸的发酵生产受到明显抑制。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (37)
1.热带假丝酵母（Candida tropicalis）10468在生产长链二元酸中的应用，其特征在于，所述长链二元酸为C19~C21长链二元酸中的一种或多种；所述应用为利用所述热带假丝酵母（Candida tropicalis）10468发酵生产长链二元酸；所述发酵的温度为33~41℃。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述长链二元酸为C19、C20或C21直链饱和长链二元酸中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为33.5~41℃。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为34~41℃。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为34.5~41℃。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为35~41℃。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为35.5~41℃。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为36~41℃。
9.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为36.5~41℃。
10.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为37~41℃。
11.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为37.5~41℃。
12.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为38~41℃。
13.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为38.5~41℃。
14.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为39~41℃。
15.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为39.5~41℃。
16.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为40~41℃。
17.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为40.5~41℃。
18.一种长链二元酸的生产方法，其特征在于，包括发酵热带假丝酵母（Candida tropicalis）10468得到长链二元酸的步骤；所述长链二元酸为C19~C21长链二元酸中的一种或多种；所述发酵的温度为33~41℃。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述长链二元酸为C19、C20或C21直链饱和长链二元酸中的一种或多种。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为33.5~41℃。
21.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为34~41℃。
22.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为34.5~41℃。
23.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为35~41℃。
24.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为35.5~41℃。
25.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为36~41℃。
26.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为36.5~41℃。
27.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为37~41℃。
28.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为37.5~41℃。
29.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为38~41℃。
30.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为38.5~41℃。
31.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为39~41℃。
32.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为39.5~41℃。
33.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为40~41℃。
34.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为40.5~41℃。
35.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的底物为C19~C21的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种。
36.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养基包括如下组分：蔗糖10~40g/L，玉米浆1~5g/L，酵母膏1~5g/L，磷酸二氢钾4~12g/L，硝酸钾4~10g/L，氯化钠0~3g/L，尿素0.5~3g/L。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述发酵的培养基还包括发酵底物，所述发酵底物为C19~C21正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种，添加量为100~400 mL/L。
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