CN103074325A - 一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法 - Google Patents

一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法，该方法是先制备培养基，将热带假丝酵母菌接种于培养基上，采用放射源钴60γ-射线进行辐照诱变，并用诱变筛选培养基系统筛选获得高产长链二元酸的热带假丝酵母菌的突变菌株，从而提高长链二元酸的产酸量和正构烷烃的转化率。

Description

一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法
技术领域
本发明涉及一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法，该方法以提高长链二元酸的产酸量和正构烷烃的转化率。
背景技术
长链二元酸是重要的精细化工中间体，可以合成香料、特种尼龙、聚酰胺热熔胶等一系列高附加值的特殊化学品，而长链二元酸不能从自然界中直接获得，化学合成又有许多难以克服的弊端，因此利用微生物技术制取长链二元酸引起了国内外的高度重视。
早在20世纪60年代国外就开始了利用微生物氧化正构烷烃制取长链二元酸的研究，但产酸量很低，难以实现工业化生产。日本矿业公司将选出的产酸能力最强的热带假丝酵母菌（No.1098菌株）经化学诱变和紫外线诱变，得到变异株M2030，该菌株发酵120小时，产酸130g/L。1977年日本矿业公司利用微生物氧化技术，以正构烷烃为原料成功的开发出制造长链二元酸技术，1982年建成年产100吨十三烷二元酸的工业化装置。
我国微生物发酵制取长链二元酸的研究工作开始于20世纪70年代，1999年在山东淄博建成利用微生物技术年产1000吨长链二元酸的生产装置。2005年后山东济宁、青岛、烟台等地陆续建成利用微生物技术年产3000-8000吨的长链二元酸生产装置。
生产长链二元酸的菌种的诱变筛选方法报道较多的有亚硝基胍诱变、紫外线照射诱变和离子束注入诱变，而采用放射源钴60γ-射线进行诱变的未见有报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法，该方法是先制备培养基，将热带假丝酵母菌接种于培养基上，采用放射源钴60γ-射线进行诱变，并用诱变筛选培养基系统筛选获得高产长链二元酸的热带假丝酵母菌突变菌株，从而提高长链二元酸的产酸量和正构烷烃的转化率。
本发明所述的一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法，按下列步骤进行：
制备培养基：
a、麦芽汁培养基:12Brix麦芽汁，2%琼脂；
b、种子培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，蔗糖15.0-25.0g，玉米浆1.0-2.0g，酵母浸膏1.0-2.0g，尿素2.5-3.0g，维生素B10.1-0.3g，正构烷烃nC8-nC1840-50ml，纯水1000ml；
c、筛选培养基：
筛选培养基Ⅰ：各组份为磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾5.0-6.0g，硫酸铵2.0-3.0g，氯化钠1.0-1.5g，酵母浸膏0.5-1.0g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，琼脂15.0-20.0g，正构烷烃nC8-nC1820-50ml，纯水1000ml，pH7.0；
筛选培养基Ⅱ：各组份为磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，酵母浸膏0.5-1.0g，硫酸铵2.0-3.0g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，琼脂15.0-20.0g，蔗糖15.0-20.0g，纯水1000ml，pH7.0；
筛选培养基Ⅲ：各组份为蔗糖15.0-20.0g，磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，酵母浸膏0.5-1.0g，尿素1.5-2.0g，琼脂15.0-20.0g，正构烷烃nC8-nC1820-50ml，纯水1000ml，pH7.5，酚红指示剂1%；
d、发酵培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，蔗糖15.0-25.0g，玉米浆1.0-2.0g，酵母浸膏1.0-2.0g，无水醋酸钠3.0-4.0g，尿素2.0-3.0g，维生素B10.1-0.3g，硫酸铵2.0-3.0g，丙烯酸0.001-0.002g，正构烷烃nC8-nC18300-400ml，纯水1000ml；
热带假丝酵母菌的诱变：
e、将热带假丝酵母菌菌株接入麦芽汁培养基斜面，在温度28-34℃的培养箱中培养24-48小时，向斜面内加入15ml无菌水，用无菌接种环将菌体刮入无菌的含有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡30分钟充分打散菌体，分别吸取10ml菌悬液于50ml无菌三角瓶中，用钴60γ-射线进行辐照，辐照剂量为0.5-0.7KGy，将辐照后的菌悬液进行梯度稀释，并涂麦芽汁平板，在温度28-34℃的培养箱中与对照平板一起培养36-72小时，选择经辐照后平板中成活率在10-40%的热带假丝酵母菌的单菌落；
f、将步骤e筛选出的平板中成活率在10-40%的单菌落分别一一对应接种到含筛选培养基Ⅰ的平板和含筛选培养基Ⅱ的平板上，在温度28-34℃的培养箱中培养36-72小时，选择在筛选培养基Ⅰ上不生长而在筛选培养基Ⅱ上生长旺盛的热带假丝酵母菌的单菌落；
g、再将步骤f筛选出的单菌落接种于含筛选培养基Ⅲ的平板上，在温度28-34℃的培养箱中培养36-72小时，选择R值大的热带假丝酵母菌的诱变菌株，其中R为菌落产酸面积/菌落面积；
热带假丝酵母菌诱变菌株的验证
h、将步骤g得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到步骤b种子培养基进行种子培养，再将培养好的种子接种到步骤d发酵培养基中进行产酸培养。
本发明所用的初始菌种为热带假丝酵母菌，拉丁名称为：Candidatropicalis，是委托中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的美国典型微生物菌种保藏中心编号为20962的热带假丝酵母菌。
热带假丝酵母菌的生理特性如下：
一、发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，海藻糖+，乳糖-，蜜二糖-，棉籽糖-，松三糖+，菊糖-。
二、同化碳源：葡萄糖+，半乳糖+，L-山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，蜜二糖-，棉籽糖-，松三糖+，菊糖-，可溶性淀粉+，D-木糖+，L-阿拉伯糖+，D-阿拉伯糖-，D-核糖-，L-鼠李糖-，乙醇+，甘油+，赤藓醇-，核糖醇+，甜醇-，D-甘露醇+，D-山梨醇+，肌醇-，琥珀酸+。
三、同化硝酸盐：阴性。
四、在无维生素的培养基中生长：弱。
形态特征：奶油白色，有褶皱，呈梅花状。液体培养时，大部分是单个卵圆形细胞。
本发明所述的一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法，该方法中所述的酵母浸膏（yeast extract）为市售产品（来源于上海西王淀粉糖有限公司），黄棕色或黄褐色可溶性膏状制品，其干物质含量≥65.0%，总氮含量（以干基计）≥9.0%，氨基氮含量（以干基计）≥3.0%。
本发明所述的一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法，通过该方法获得的热带假丝酵母菌的诱变菌株，接入装有种子培养基的三角瓶中，装液量为5%-10%，在温度28-34℃，140-230转/分钟的旋转摇床上培养20-48小时，种子培养完毕后接种至发酵培养基，接种量为5%-10%，培养温度为28-34℃，培养时间120-144小时，发酵结束经后处理得长链二元酸产品，产酸量为178-190g/L。
具体实施方式
实施例1：
制备培养基：
a、麦芽汁培养基:12Brix麦芽汁，2%琼脂；
b、种子培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0g，氯化钠1.0g，七水合硫酸镁0.5g，蔗糖15.0g，玉米浆1.0g，酵母浸膏1.0g，尿素2.5g，维生素B10.1g，正构十一碳烷烃nC1140ml，纯水1000ml；
c、筛选培养基：
筛选培养基Ⅰ：各组份为磷酸二氢钠2.0g，磷酸氢二钾5.0g，硫酸铵2.0g，氯化钠1.0g，酵母浸膏0.5g，七水合硫酸镁0.5g，琼脂20.0g，正构十一碳烷烃nC1130ml，纯水1000ml，pH7.0；
筛选培养基Ⅱ：各组份为磷酸二氢钠2.0g，磷酸氢二钾5.0g，氯化钠1.0g，酵母浸膏0.5g，硫酸铵2.0g，七水合硫酸镁0.5g，琼脂20.0g，蔗糖15.0g，纯水1000ml，pH7.0；
筛选培养基Ⅲ：各组份为蔗糖15.0g，磷酸二氢钠2.0g，磷酸氢二钾5.0g，氯化钠1.0g，七水合硫酸镁0.5g，酵母浸膏0.5g，尿素1.5g，琼脂20.0g，正构十一碳烷烃nC1130ml，纯水1000ml，pH7.5，酚红指示剂1%；
d、发酵培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0g，氯化钠1.0g，七水合硫酸镁0.5g，蔗糖15.0g，玉米浆1.0g，酵母浸膏1.0g，无水醋酸钠3.0g，尿素2.0g，维生素B10.1g，硫酸铵2.0g，丙烯酸0.001g，正构十一碳烷烃nC11300ml，纯水1000ml；
热带假丝酵母菌的诱变：
e、将热带假丝酵母菌菌株接入步骤a麦芽汁斜面，在温度29℃的培养箱中培养48小时，向斜面内加入15ml无菌水，用无菌接种环将菌体刮入无菌的含有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡30分钟充分打散菌体，分别吸取10ml菌悬液于50ml无菌三角瓶中，用钴60γ-射线进行辐照，辐照剂量为0.5KGy，将辐照后的菌悬液进行梯度103、104、105、106倍稀释，分别取0.2ml涂麦芽汁平板，每个稀释度涂3个平板，在温度29℃的培养箱中培养60小时，选择经辐照后平板中成活率在25%的热带假丝酵母菌的单菌落；
f、将步骤e筛选出的平板中成活率在25%的单菌落用无菌竹签分别一一对应接种到含筛选培养基Ⅰ的平板和含筛选培养基Ⅱ的平板上，在温度29℃的培养箱中培养72小时，选择在筛选培养基Ⅰ平板上不生长而在筛选培养基Ⅱ平板上生长旺盛的热带假丝酵母菌的单菌落；
g、再将步骤f筛选出的单菌落接种于含筛选培养基Ⅲ的平板上，在温度29℃的培养箱中培养60小时，选择R值大的热带假丝酵母菌的诱变菌株，其中R为菌落产酸面积/菌落面积；
热带假丝酵母菌诱变菌株的验证：
h、将步骤g得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到步骤b种子培养基进行种子培养，再将培养好的种子接种到步骤d发酵培养基中进行产酸培养，最后在20m3的反应器内以正构十一碳烷烃为底物，在温度29℃，通气量0.6-1.6VVM（m3空气/m3发酵液﹒min）下培养144小时，进行发酵试验，发酵结束经后处理得十一烷二元酸产品，产酸量为178g/L。
实施例2：
制备培养基：
a、麦芽汁培养基:12Brix麦芽汁，2%琼脂；
b、种子培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0g，氯化钠1.0g，七水合硫酸镁0.5g，蔗糖15.0g，玉米浆1.0g，酵母浸膏1.0g，尿素2.5g，维生素B10.1g，正构十二碳烷烃nC1240ml，纯水1000ml；
c、筛选培养基：
筛选培养基Ⅰ：各组份为磷酸二氢钠2.0g，磷酸氢二钾5.0g，硫酸铵2.0g，氯化钠1.0g，酵母浸膏0.5g，七水合硫酸镁0.5g，琼脂20.0g，正构十二碳烷烃nC1230ml，纯水1000ml，pH7.0；
筛选培养基Ⅱ：各组份为磷酸二氢钠2.0g，磷酸氢二钾5.0g，氯化钠1.0g，酵母浸膏0.5g，硫酸铵2.0g，七水合硫酸镁0.5g，琼脂20.0g，蔗糖15.0g，纯水1000ml，pH7.0；
筛选培养基Ⅲ：各组份为蔗糖15.0g，磷酸二氢钠2.0g，磷酸氢二钾5.0g，氯化钠1.0g，七水合硫酸镁0.5g，酵母浸膏0.5g，尿素1.5g，琼脂20.0g，正构十二碳烷烃nC1230ml，纯水1000ml，pH7.5，酚红指示剂1%；
d、发酵培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0g，氯化钠1.0g，七水合硫酸镁0.5g，蔗糖15.0g，玉米浆1.0g，酵母浸膏1.0g，无水醋酸钠3.0g，尿素2.0g，维生素B10.1g，硫酸铵2.0g，丙烯酸0.001g，正构十二碳烷烃nC12300ml，纯水1000ml；
热带假丝酵母菌的诱变：
e、将热带假丝酵母菌菌株接入步骤a麦芽汁斜面，在温度29℃的培养箱中培养48小时，向斜面内加入15ml无菌水，用无菌接种环将菌体刮入无菌的含有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡30分钟充分打散菌体，分别吸取10ml菌悬液于50ml无菌三角瓶中，用钴60γ-射线进行辐照，辐照剂量为0.6KGy，将辐照后的菌悬液进行梯度103、104、105、106倍稀释，分别取0.2ml涂麦芽汁平板，每个稀释度涂3个平板，在温度29℃的培养箱中培养60小时，选择经辐照后平板中成活率在25%的热带假丝酵母菌的单菌落；
f、将步骤e筛选出的平板中成活率在25%的单菌落用无菌竹签分别一一对应接种到含筛选培养基Ⅰ的平板和含筛选培养基Ⅱ的平板上，在温度29℃的培养箱中培养72小时，选择在筛选培养基Ⅰ平板上不生长而在筛选培养基Ⅱ平板上生长旺盛的热带假丝酵母菌的单菌落；
g、再将步骤f筛选出的单菌落接种于含筛选培养基Ⅲ的平板上，在温度29℃的培养箱中培养60小时，选择R值大的热带假丝酵母菌的诱变菌株，其中R为菌落产酸面积/菌落面积；
热带假丝酵母菌诱变菌株的验证：
h、将步骤g得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到步骤b种子培养基进行种子培养，再将培养好的种子接种到步骤d发酵培养基中进行产酸培养，将新获得的诱变菌株在20m3的反应器内以正构十二碳烷烃为底物，在温度29℃，通气量0.6-1.6VVM（m3空气/m3发酵液·min）下培养144小时，进行发酵试验，发酵结束经后处理得十二烷二元酸产品，产酸量为190g/L。
实施例3：
制备培养基：
a、麦芽汁培养基:12Brix麦芽汁，2%琼脂；
b、种子培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0g，氯化钠1.0g，七水合硫酸镁0.5g，蔗糖15.0g，玉米浆1.0g，酵母浸膏1.0g，尿素2.5g，维生素B10.1g，正构十三碳烷烃nC1340ml，纯水1000ml；
c、筛选培养基：
筛选培养基Ⅰ：各组份为磷酸二氢钠2.0g，磷酸氢二钾5.0g，硫酸铵2.0g，氯化钠1.0g，酵母浸膏0.5g，七水合硫酸镁0.5g，琼脂20.0g，正构十三碳烷烃nC1330ml，纯水1000ml，pH7.0；
筛选培养基Ⅱ：各组份为磷酸二氢钠2.0g，磷酸氢二钾5.0g，氯化钠1.0g，酵母浸膏0.5g，硫酸铵2.0g，七水合硫酸镁0.5g，琼脂20.0g，蔗糖15.0g，纯水1000ml，pH7.0；
筛选培养基Ⅲ：各组份为蔗糖15.0g，磷酸二氢钠2.0g，磷酸氢二钾5.0g，氯化钠1.0g，七水合硫酸镁0.5g，酵母浸膏0.5g，尿素1.5g，琼脂20.0g，正构十三碳烷烃nC1330ml，纯水1000ml，pH7.5，酚红指示剂1%；
d、发酵培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0g，氯化钠1.0g，七水合硫酸镁0.5g，蔗糖15.0g，玉米浆1.0g，酵母浸膏1.0g，无水醋酸钠3.0g，尿素2.0g，维生素B10.1g，硫酸铵2.0g，丙烯酸0.001g，正构十三碳烷烃nC13300ml，纯水1000ml；
热带假丝酵母菌的诱变：
e、将热带假丝酵母菌菌株接入步骤a麦芽汁斜面，在温度29℃的培养箱中培养48小时，向斜面内加入15ml无菌水，用无菌接种环将菌体刮入无菌的含有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡30分钟充分打散菌体，分别吸取10ml菌悬液于50ml无菌三角瓶中，用钴60γ-射线进行辐照，辐照剂量为0.7KGy，将辐照后的菌悬液进行梯度103、104、105、106倍稀释，分别取0.2ml涂麦芽汁平板，每个稀释度涂3个平板，在温度29℃的培养箱中培养60小时，选择经辐照后平板中成活率在25%的热带假丝酵母菌的单菌落；
f、将步骤e筛选出的平板中成活率在25%的单菌落用无菌竹签分别一一对应接种到含筛选培养基Ⅰ的平板和含筛选培养基Ⅱ的平板上，在温度29℃的培养箱中培养72小时，选择在筛选培养基Ⅰ平板上不生长而在筛选培养基Ⅱ平板上生长旺盛的热带假丝酵母菌的单菌落；
g、再将步骤f筛选出的单菌落接种于含筛选培养基Ⅲ的平板上，在温度29℃的培养箱中培养60小时，选择R值大的热带假丝酵母菌的诱变菌株，其中R为菌落产酸面积/菌落面积；
热带假丝酵母菌诱变菌株的验证：
h、将步骤g得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到步骤b种子培养基进行种子培养，再将培养好的种子接种到步骤d发酵培养基中进行产酸培养，将新获得的诱变菌株在20m3的反应器内以正构十三碳烷烃为底物，在温度29℃，通气量0.6-1.6VVM（m3空气/m3发酵液﹒min）下培养144小时，进行发酵试验，发酵结束经后处理得十三烷二元酸产品，产酸量为185g/L。
实施例4：
制备培养基：
a、麦芽汁培养基:12Brix麦芽汁，2%琼脂；
b、种子培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0g，氯化钠1.0g，七水合硫酸镁0.5g，蔗糖15.0g，玉米浆1.0g，酵母浸膏1.0g，尿素2.5g，维生素B10.1g，正构烷烃nC11-nC1440ml，纯水1000ml；
c、筛选培养基：
筛选培养基Ⅰ：各组份为磷酸二氢钠2.0g，磷酸氢二钾5.0g，硫酸铵2.0g，氯化钠1.0g，酵母浸膏0.5g，七水合硫酸镁0.5g，琼脂20.0g，正构烷烃nC11-nC1430ml，纯水1000ml，pH7.0；
筛选培养基Ⅱ：各组份为磷酸二氢钠2.0g，磷酸氢二钾5.0g，氯化钠1.0g，酵母浸膏0.5g，硫酸铵2.0g，七水合硫酸镁0.5g，琼脂20.0g，蔗糖15.0g，纯水1000ml，pH7.0；
筛选培养基Ⅲ：各组份为蔗糖15.0g，磷酸二氢钠2.0g，磷酸氢二钾5.0g，氯化钠1.0g，七水合硫酸镁0.5g，酵母浸膏0.5g，尿素1.5g，琼脂20.0g，正构烷烃nC11-nC1430ml，纯水1000ml，pH7.5，酚红指示剂1%；
d、发酵培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0g，氯化钠1.0g，七水合硫酸镁0.5g，蔗糖15.0g，玉米浆1.0g，酵母浸膏1.0g，无水醋酸钠3.0g，尿素2.0g，维生素B10.1g，硫酸铵2.0g，丙烯酸0.001g，正构烷烃nC11nC14300ml，纯水1000ml；
热带假丝酵母菌的诱变：
e、将热带假丝酵母菌菌株接入步骤a麦芽汁斜面，在温度29℃的培养箱中培养48小时，向斜面内加入15ml无菌水，用无菌接种环将菌体刮入无菌的含有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡30分钟充分打散菌体，分别吸取10ml菌悬液于50ml无菌三角瓶中，用钴60γ-射线进行辐照，辐照剂量为0.6KGy，将辐照后的菌悬液进行梯度103、104、105、106倍稀释，分别取0.2ml涂麦芽汁平板，每个稀释度涂3个平板，在温度29℃的培养箱中培养60小时，选择经辐照后平板中成活率在20%的热带假丝酵母菌的单菌落；
f、将步骤e筛选出的平板中成活率在20%的单菌落用无菌竹签分别一一对应接种到含筛选培养基Ⅰ的平板和含筛选培养基Ⅱ的平板上，在温度29℃的培养箱中培养72小时，选择在筛选培养基Ⅰ平板上不生长而在筛选培养基Ⅱ平板上生长旺盛的热带假丝酵母菌的单菌落；
g、再将步骤f筛选出的菌株接种于含筛选培养基Ⅲ的平板上，在温度29℃的培养箱中培养60小时，选择R值大的热带假丝酵母菌的诱变菌株，其中R为菌落产酸面积/菌落面积；
热带假丝酵母菌诱变菌株的验证：
h、将步骤g得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到步骤b种子培养基进行种子培养，再将培养好的种子接种到步骤d发酵培养基中进行产酸培养，将新获得的诱变菌株在20m3的反应器内以正构十一碳烷烃或正构十二碳烷烃或正构十三碳烷烃或正构十四碳烷烃为底物，在温度29℃，通气量0.6-1.6VVM（m3空气/m3发酵液﹒min）下培养144小时，进行发酵试验，发酵结束经后处理得十四烷二元酸产品，产酸量为182g/L。

Claims (1)

1.一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法，其特征在于按下列步骤进行：
制备培养基：
a、麦芽汁培养基:12Brix麦芽汁，2%琼脂；
b、种子培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，蔗糖15.0-25.0g，玉米浆1.0-2.0g，酵母浸膏1.0-2.0g，尿素2.5-3.0g，维生素B10.1-0.3g，正构烷烃C8-C1840-50ml，纯水1000ml；
c、筛选培养基：
筛选培养基Ⅰ：各组份为磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾5.0-6.0g，硫酸铵2.0-3.0g，氯化钠1.0-1.5g，酵母浸膏0.5-1.0g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，琼脂15.0-20.0g，正构烷烃nC8-nC1820-50ml，纯水1000ml，pH7.0；
筛选培养基Ⅱ：各组份为磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，酵母浸膏0.5-1.0g，硫酸铵2.0-3.0g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，琼脂15.0-20.0g，蔗糖15.0-20.0g，纯水1000ml，pH7.0；
筛选培养基Ⅲ：各组份为蔗糖15.0-20.0g，磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，酵母浸膏0.5-1.0g，尿素1.5-2.0g，琼脂15.0-20.0g，正构烷烃nC8-nC1820-50ml，纯水1000ml，pH7.5，酚红指示剂1%；
d、发酵培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，蔗糖15.0-25.0g，玉米浆1.0-2.0g，酵母浸膏1.0-2.0g，无水醋酸钠3.0-4.0g，尿素2.0-3.0g，维生素B10.1-0.3g，硫酸铵2.0-3.0g，丙烯酸0.001-0.002g，正构烷烃nC8-nC18300-400ml，纯水1000ml；
热带假丝酵母菌的诱变：
e、将热带假丝酵母菌菌株接入麦芽汁培养基斜面，在温度28-34℃的培养箱中培养24-48小时，向斜面内加入15ml无菌水，用无菌接种环将菌体刮入无菌的含有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡30分钟充分打散菌体，分别吸取10ml菌悬液于50ml无菌三角瓶中，用钴60γ-射线进行辐照，辐照剂量为0.5-0.7KGy，将辐照后的菌悬液进行梯度稀释，并涂麦芽汁平板，在温度28-34℃的培养箱中与对照平板一起培养36-72小时，选择经辐照后平板中成活率在10-40%的热带假丝酵母菌的单菌落；
f、将步骤e筛选出的平板中成活率在10-40%的单菌落分别一一对应接种到含筛选培养基Ⅰ的平板和含筛选培养基Ⅱ的平板上，在温度28-34℃的培养箱中培养36-72小时，选择在筛选培养基Ⅰ平板上不生长而在筛选培养基Ⅱ平板上生长旺盛的热带假丝酵母菌的单菌落；
g、再将步骤f筛选出的单菌落接种于含筛选培养基Ⅲ的平板上，在温度28-34℃的培养箱中培养36-72小时，选择R值大的热带假丝酵母菌的诱变菌株，其中R为菌落产酸面积/菌落面积；
热带假丝酵母菌诱变菌株的验证
h、将步骤g得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到步骤b种子培养基进行种子培养，再将培养好的种子接种到步骤d发酵培养基中进行产酸培养。
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