CN109652469A - 一种利用副干酪乳杆菌发酵制备l-乳酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用副干酪乳杆菌发酵制备L‑乳酸的方法，包括如下步骤：菌种的活化、种子液的制备及发酵及发酵过程控制。本发明中使用的发酵培养基中以低成本工业副产物及廉价氮源玉米浆与酵母膏作为氮源，成本低廉，营养物质充足，操作简便，适合工业化生产，有较高的应用价值。

Description

一种利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法
技术领域
本发明涉及一种利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
乳酸是一种简单且重要的羟基酸，是世界公认的三大有机酸之一，广泛应用于化工，环保，医药，纺织及农业诸多领域。L-乳酸因其可被人体、微生物吸收和利用，而逐步取代了D-乳酸和DL-乳酸。传统的乳酸生产方法主要有化学合成法，酶法，微生物发酵法；化学合成法主要得到的是外消旋乳酸及DL-乳酸，而且，其主要原料包括乙醛及剧毒物氰酸，所以，化学合成法限制了乳酸的生产，且生产成本极高；酶法生产乳酸虽然能得到旋光性专一的乳酸，但是工艺复杂，难以应用于工业生产。相比于以上两种方法，微生物发酵生产乳酸有着绿色环保，且成本低廉，工艺容易控制的优点，据报道，副干酪乳杆菌发酵生产L-乳酸产量90g/L，糖转化率可达90％，传统的微生物发酵生产乳酸发酵条件和发酵培养基组成都限制了高品质L-乳酸的生产，只有经过对其菌种，工艺进行优化才能够进一步应用于工业化生产。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于，提供一种利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，以为了解决现阶段L-乳酸工业化生产工艺复杂，成本高、产量低的技术问题。
为了达成上述的目的，本发明采用了如下技术方案：
一种利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，包括以下步骤：
1)取副干酪乳杆菌，划线接种于MRS固体培养基平板，于35℃-45℃恒温培养箱中静置培养24-48h；
2)在MRS固体培养基上使用接种环挑取副干酪乳杆菌单菌落，划线于MRS固体斜面，于35℃-45℃恒温培养箱中静置培养12-24h；
3)取步骤2)中接种获得的斜面培养物，使用生理盐水冲洗菌苔后，接种于种子培养基中培养3-8h；
4)当一级种子液pH值达到4.0-5.0时，转接至装有35L发酵培养基的50L发酵罐内进行发酵直至结束。
进一步地，其中步骤1)中，所述副干酪乳杆菌为-70℃保存的副干酪乳杆菌甘油管菌液。
进一步地，其中步骤3)中，取步骤2)中接种获得的斜面培养物，使用1-5ml生理盐水冲洗菌苔，按0.1％-0.3％(v/v)的接种量接种于种子培养基中，置于35℃-45℃温度下，转速160-200rpm/min培养3-8h。
进一步地，其中步骤3)中，所述种子培养基按质量份数计的各成分为：葡萄糖20-40g/L，大豆蛋白胨15-25g/L，酵母浸粉3.0-7.0g/L，磷酸氢二钾1.0-3.0g/L，氯化镁0.5-1.0g/L，硫酸锰0.1-0.5g/L，氯化钠1.0-3.0g/L，碳酸钙0.5-1.5g/L，吐温-80 0.5-1.5g/L，初始pH 6.8-7.0。
进一步地，其中步骤4)中，当一级种子液pH值达到4.0-5.0时，转接至装有35L发酵培养基的50L发酵罐内，当残糖第一次达到20-60g/L时补加葡萄糖至总糖浓度140-170g/L，当残糖第二次降至60-100g/L时补加葡萄糖至终浓度180-250g/L，残糖低于1-6g/L时终止发酵。
进一步地，其中步骤4)中，当一级种子液pH值达到4.0-5.0时，停止培养，按接种量3％-7％(v/v)转接至装有35L发酵培养基的50L发酵罐内，初始pH值6.8-7.0，温度35℃-45℃，转速80-100rpm/min，当残糖第一次达到20-60g/L时补加葡萄糖至总糖浓度140-170g/L，调整转速至120-140rpm/min，当残糖第二次降至60-100g/L时补加葡萄糖至终浓度180-250g/L，同时使用20wt％氢氧化钠溶液控制pH稳定在5.5-6.5，残糖低于1-6g/L时终止发酵。
进一步地，其中步骤4)中，所述发酵培养基按质量份数计的各成分为：所述发酵培养基按质量份数计的各成分为：葡萄糖100-140g/L，玉米浆干粉40-60g/L，酵母膏5.0-10g/L，氯化钠1.0-3.0g/L，硫酸锰0.2-0.5g/L，氯化镁0.5-1.0g/L，碳酸钙20-50g/L，初始pH6.8-7.0。
进一步地，其中步骤4)中，当残糖第一次降低至40-60g/L时，补加葡萄糖至总糖浓度达到140-160g/L，转速调整至120-130rpm/min。
进一步地，其中步骤4)中，当残糖第二次降低至60-80g/L时，补加葡萄糖总糖浓度最终达到180-240g/L，残糖低于1-5g/L时，发酵结束。
进一步地，其中所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CICC 6235，其购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，以为了达到更好的效果。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：
本发明中使用的发酵培养基中以低成本工业副产物及廉价氮源玉米浆与酵母膏作为氮源，成本低廉，营养物质充足，操作简便，适合工业化生产，有较高的应用价值。通过降低发酵培养基碳源浓度，降低底物抑制现象的出现，发酵过程中通过二次补料为L-乳酸的发酵提供足够的碳源，在培养基中添加CaCO3，发酵过程中流加NaOH溶液，维持发酵体系pH的方式，降低了产物抑制现象，提高了糖转化率，最终发酵结果为乳酸产量225g/L及以上，糖转化率94.0％以上，极大地提高了生产效率。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例进行说明。
以下各种材料或试剂，若非特别说明，均为市售。
一种利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，包括以下步骤：
一、菌种的活化
取-70℃保存的副干酪乳杆菌甘油管菌液，划线接种于MRS固体培养基平板，于35℃-45℃恒温培养箱中静置培养24-48h；
在MRS固体培养基上使用接种环挑取副干酪乳杆菌单菌落，划线于MRS固体斜面，于35℃-45℃恒温培养箱中静置培养12-24h；
二、种子液的制备
取斜面培养物，使用1-5ml生理盐水冲洗菌苔，按体积分数0.1％-0.3％接种量接种于种子培养基中，置于35℃-45℃温度下，转速160-200rpm/min培养。
种子培养基的各成分为：葡萄糖20-40g/L，大豆蛋白胨15-25g/L，酵母浸粉3.0-7.0g/L，磷酸氢二钾1.0-3.0g/L，氯化镁0.5-1.0g/L，硫酸锰0.1-0.5g/L，氯化钠1.0-3.0g/L，碳酸钙0.5-1.5g/L，吐温-80 0.5-1.5g/L，初始pH值6.8-7.0；
三、发酵及发酵过程控制
一级种子液培养3-8h，pH达到4.0-5.0时，停止培养，按接种量3％-7％转接至35L发酵培养基中，初始pH6.8-7.0，温度35℃-45℃，转速80-100rpm/min，当残糖第一次达到40-60g/L时补加葡萄糖至总糖浓度100-160g/L，同时提高转速至100-120rpm/min，残糖第二次降60-80g/L时，补加葡萄糖至总糖浓度180-240g/L，同时使用20wt％氢氧化钠溶液控制pH稳定在5.5-6.5，残糖低于1-5g/L时终止发酵。
发酵培养基的各成分为：所述发酵培养基按质量份数计的各成分为：葡萄糖100-140g/L，玉米浆干粉40-60g/L，酵母膏5.0-10g/L，氯化钠1.0-3.0g/L，硫酸锰0.2-0.5g/L，氯化镁0.5-1.0g/L，碳酸钙20-50g/L，初始pH 6.8-7.0。
实施例1
本实施例分别选用酵母膏、玉米浆、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏5种有机氮源作为单一有机氮源，发酵培养基其他成分保持一致，发酵过程控制不变，总糖终浓度200g/L，发酵结束后分别测定L-乳酸产量，不同有机氮源发酵产生的L-乳酸含量如下表1所示。
表1
有机氮源 L-乳酸产量g/L 葡萄糖转化率％
酵母膏 181g/L 90.5％
玉米浆 182g/L 91％
蛋白胨 150g/L 75％
酵母浸粉 182g/L 91％
牛肉膏 176g/L 88％
由表1可知，使用玉米浆、酵母膏作为单一氮源使用时，相比其他高成本氮源，L-乳酸产量可达181g/L及以上，葡萄糖转化率高于90.5％，这是由于玉米浆、酵母膏成分复杂，富含多种营养物质，如生物素、B族维生素、嘧啶、嘌呤等，这些物质对菌体前期的生长及中后期产酸都有重要的影响；而其他有机氮源可能由于营养因子含量较少，需配合其他氮源一同使用，或者虽然产酸量较高，但成本较高。
实施例2
本实施例提供了一种利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，包括以下步骤：
一、菌种的活化
取-70℃保存的副干酪乳杆菌甘油管菌液，划线接种于MRS固体培养基平板，于35℃恒温培养箱中静置培养24h。
在MRS固体培养基上使用接种环挑取副干酪乳杆菌单菌落，划线于MRS固体斜面，于40℃恒温培养箱中静置培养18h。
二、种子液的制备
取斜面培养物，使用5ml生理盐水冲洗菌苔，按体积分数0.2％接种量接种于种子培养基中，置于40℃温度下，转速180rpm/min培养。
种子培养基成分(按质量份数计)为：葡萄糖20g/L，大豆蛋白胨25g/L，酵母浸粉3.0g/L，磷酸氢二钾3.0g/L，氯化镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钠1.0g/L，碳酸钙1.5g/L，吐温-80 0.5g/L，初始pH 6.8。
三、发酵及发酵过程控制
种子液培养8h，pH值达到4.5左右时，停止培养，按接种量5％转接至35L发酵培养基中，初始pH6.8，温度37℃，转速80rpm/min，当残糖第一次达到60g/L时补加葡萄糖至总糖浓度100g/L，提高转速至120rpm/min，同时使用20wt％的氢氧化钠溶液控制pH值稳定在5.5，残糖低于3g/L时终止发酵。
一级种子液培养3h，pH达到5.0时，停止培养，按接种量7％转接至35L发酵培养基中，初始pH7.0，温度35℃，转速100rpm/min，当残糖第一次达到40g/L时补加葡萄糖至总糖浓度120g/L，同时提高转速至120rpm/min，残糖第二次降60g/L时，补加葡萄糖至总糖浓度180g/L，同时使用20％氢氧化钠控制pH稳定在5.5-6.5，残糖低于1-5g/L时终止发酵。
发酵培养基的各成分(按质量份数计)为：葡萄糖100g/L，玉米浆干粉60g/L，酵母膏10g/L，氯化钠1.0g/L，硫酸锰0.2g/L，氯化镁0.25g/L，碳酸钙30g/L，吐温1.0g/L，初始pH6.8。
发酵结束后测定L-乳酸浓度：189g/L，糖转化率94.5％。
实施例3
本实施例提供了一种利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，包括以下步骤：
一、菌种的活化
取-70℃保存的副干酪乳杆菌甘油管菌液，划线接种于MRS固体培养基平板，于40℃恒温培养箱中静置培养30h。
在MRS固体培养基上使用接种环挑取副干酪乳杆菌单菌落，划线于MRS固体斜面，于37℃恒温培养箱中静置培养12h；
二、种子液的制备
取斜面培养物，使用2ml生理盐水冲洗菌苔，按体积分数0.3％接种量接种于种子培养基中，置于37℃温度下，转速180rpm/min培养。
种子培养基成分(按质量份数计)为：葡萄糖40g/L，大豆蛋白胨15g/L，酵母浸粉7.0g/L％，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化镁1.0g/L，硫酸锰0.1g/L，氯化钠3.0g/L，碳酸钙0.5g/L，吐温-80 1.5g/L，初始pH 6.8。
三、发酵及发酵过程控制
种子液培养培养6h，pH达到4.5左右时，停止培养，按接种量5％转接至35L发酵培养基中，初始pH6.80，温度40℃，转速80rpm/min，pH值下降到5.5时，通过流加20wt％氢氧化钠溶液维持pH值稳定在5.5，残糖低于60g/L时，补加葡萄糖至总糖浓度达到100g/L，提高转速至120rpm/min，继续发酵至残糖浓度达到70g/L时，流加葡萄糖至总糖终浓度240g/L，残糖低于3.0g/L时结束发酵，测定L-乳酸与糖转化率。
发酵培养基的各成分(按质量份数计)为：葡萄糖140g/L，玉米浆干粉40g/L，酵母膏10g/L，氯化钠2.0g/L，硫酸锰0.2g/L，氯化镁0.5g/L，碳酸钙50g/L，吐温1.0g/L，初始pH6.8。
发酵结束后测定L-乳酸浓度：231g/L，糖转化率96.3％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取副干酪乳杆菌，划线接种于MRS固体培养基平板，于35℃-45℃恒温培养箱中静置培养24-48h；
2)在MRS固体培养基上使用接种环挑取副干酪乳杆菌单菌落，划线于MRS固体斜面，于35℃-45℃恒温培养箱中静置培养12-24h；
3)取步骤2)中接种获得的斜面培养物，使用生理盐水冲洗菌苔后，接种于种子培养基中培养3-8h；
4)当一级种子液pH值达到4.0-5.0时，转接至装有35L发酵培养基的50L发酵罐内进行发酵直至结束。
2.如权利要求1所述的利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，其特征在于，步骤1)中，所述副干酪乳杆菌为-70℃保存的副干酪乳杆菌甘油管菌液。
3.如权利要求1所述的利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，其特征在于，步骤3)中，取步骤2)中接种获得的斜面培养物，使用1-5ml生理盐水冲洗菌苔，按0.1％-0.3％(v/v)的接种量接种于种子培养基中，置于35℃-45℃温度下，转速160-200rpm/min培养3-8h。
4.如权利要求3所述的利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，其特征在于，步骤3)中，所述种子培养基按质量份数计的各成分为：葡萄糖20-40g/L，大豆蛋白胨15-25g/L，酵母浸粉3.0-7.0g/L，磷酸氢二钾1.0-3.0g/L，氯化镁0.5-1.0g/L，硫酸锰0.1-0.5g/L，氯化钠1.0-3.0g/L，碳酸钙0.5-1.5g/L，吐温-80 0.5-1.5g/L，初始pH6.8-7.0。
5.如权利要求1所述的利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，其特征在于，步骤4)中，当一级种子液pH值达到4.0-5.0时，转接至装有35L发酵培养基的50L发酵罐内，使用20wt％氢氧化钠控制pH在5.5-6.5当残糖第一次达到20-60g/L时补加葡萄糖至总糖浓度140-170g/L，当残糖第二次降至60-100g/L时补加葡萄糖至终浓度180-250g/L，残糖低于1-6g/L时终止发酵。
6.如权利要求5所述的利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，其特征在于，步骤4)中，当一级种子液pH值达到4.0-5.0时，停止培养，按接种量3％-7％(v/v)转接至装有35L发酵培养基的50L发酵罐内，初始pH值6.8-7.0，温度35℃-45℃，转速80-100rpm/min，当残糖第一次达到20-60g/L时补加葡萄糖至总糖浓度140-170g/L，调整转速至120-140rpm/min，当残糖第二次降至60-100g/L时补加葡萄糖至终浓度180-250g/L，同时使用20wt％氢氧化钠溶液控制pH稳定在5.5-6.5，残糖低于1-6g/L时终止发酵。
7.如权利要求6所述的利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，其特征在于，步骤4)中，所述发酵培养基按质量份数计的各成分为：葡萄糖100-140g/L，玉米浆干粉40-60g/L，酵母膏5.0-10g/L，氯化钠1.0-3.0g/L，硫酸锰0.2-0.5g/L，氯化镁0.5-1.0g/L，碳酸钙20-50g/L，初始pH6.8-7.0。
8.如权利要求7所述的利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，其特征在于，步骤4)中，当残糖第一次降低至40-60g/L时补加葡萄糖至总糖浓度达到140-160g/L，转速调整至120-140rpm/min。
9.如权利要求8所述的利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，其特征在于，步骤4)中，当残糖第二次降低至60-80g/L时补加葡萄糖总糖浓度最终达到180-240g/L，残糖低于1-5g/L时，发酵结束。
10.如权利要求1-9任一项所述的利用副干酪乳杆菌发酵制备L-乳酸的方法，其特征在于，所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CICC 6235，其购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
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