CN102559552B

CN102559552B - 一种高产γ-氨基丁酸的生产方法及应用

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Publication number: CN102559552B
Application number: CN201210003931.8A
Authority: CN
Inventors: 高强; 高年发; 朱燕; 陈慧敏; 段强; 王梦晓
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2012-01-09
Filing date: 2012-01-09
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2032-01-09
Also published as: CN102559552A

Abstract

本发明公开了一种高产γ-氨基丁酸的生产方法及应用,其中的高产γ-氨基丁酸（GABA）生长棉子糖肠球菌M1，保藏号为CGMCC No.5584。其生产方法包括菌种分离筛选获得一株高产γ-氨基丁酸的Entercoccus raffinosus TCCC 11660(CGMCC No.5584)菌株；发酵培养基和发酵条件的优化以及10L发酵罐实验。此法具有原料低廉、生产能耗低、生产成本低，产品安全性好、易实现工业化生产等优点。其菌株应用于谷氨酸发酵生产γ-氨基丁酸，有良好的社会和经济效益潜力。

Description

一种高产γ-氨基丁酸的生产方法及应用

技术领域

本发明属于医药生物与食品工程技术领域，是现代生物和化学工程与传统发酵工程技术的有机结合，对目前采用生物技术生产γ-氨基丁酸（GABA）方法的改进。更具体的说是采用从我国东北酸菜中分离选育的棉子糖肠球菌（Entercoccus raffinosus）CGMCC No.5584菌株，通过生长细胞的生物转化，高效率地生产γ-氨基丁酸。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，广泛存在于动植物体内。作为中枢神经系统重要的抑制性神经递质，GABA在人脑能量代谢过程中也起到重要作用。它参与多种代谢活动，具有降血压、调节心律失常、改善睡眠、抗焦虑、改善脂质代谢、防止动脉硬化等功效，因此受到越来越多的科学工作者的关注。在日本，这类富含GABA的功能性食品的研究取得了较大的进展。大久长范，津志田藤二郎等人分别利用富集技术以糙米、米胚芽、茶叶、大豆等为食品原料成功研制出了GABA大米、GABA茶等产品。

GABA的生产方法主要有化学合成、植物富集和生物合成三种。其中化学合成法副产物多，难以纯化，生产成本高，安全性差。植物合成GABA虽然工艺简单，但植物富集的GABA含量太少，不易提取，不适合工业化生产。生物合成一般以大肠杆菌为菌株，但其存在安全卫生方面的隐患。谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD, EC4.1.1.15)在生物合成中，是催化谷氨酸脱羧生成GABA的唯一酶。谷氨酸已经通过发酵法获得大规模生产，价格相对较为便宜。利用微生物谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸脱羧生产GABA，是一条有效策略。

目前已报道的采用乳酸菌生产GABA的方法有两种：一是：培养短乳杆菌的同时不断流加底物谷氨酸钠进行发酵，生成积累GABA。目前国内报道采用此法发酵最高水平为12g/L。二是：培养并获得大量富含谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌细胞，收集此细胞并制成休止细胞，放入含有谷氨酸钠的缓冲液中，在最佳的谷氨酸脱羧酶酶促反应条件下，将谷氨酸转化为GABA，目前国内外报道生成的GABA可达345.83mM。

发明内容

/L左右，使得菌体产生的谷氨酸脱羧酶充分发挥作用，达到高效率的生产国际上公认最安全的原料药和保健食品—γ-氨基丁酸的目的。

因此，本发明的一个目的是公开了高产γ-氨基丁酸（GABA）的棉子糖肠球菌M1，其保藏号为CGMCC No.5584。

本发明的另一个目的是公开了CGMCC No.5584菌株的制备方法。

本发明的再一个目的是公开了采用CGMCC No.5584制备GABA的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种高产γ-氨基丁酸的生长棉子糖肠球菌（Entercoccus raffinosus）M1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.5584。

本发明公开的棉子糖肠球菌Entercoccus raffinosus于2011年12月13号保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌株保藏号为CGMCC No.5584。

棉子糖肠球菌Entercoccus raffinosus CGMCC No.5584所具有的生理、生化特征如下：

(1)奥林巴斯双目显微镜观察菌株形态，菌株在梯度平板培养时因产酸而形成透明圈，菌落形态扁平湿润，边缘光滑呈白色不透明状态，镜检观察为链球状，不运动，无孢子，根据革兰氏染色法鉴定为革兰氏阳性细菌，兼性厌氧型。从众多高产菌株中得到一支产GABA较高的菌株，命名为菌株M1，在纸层析实验中，M1菌株对应的色斑颜色最深，产生的GABA的量最多。然后利用液相色谱仪进行定量分析。

（2）诱变结果及稳定性试验：

本发明的另一个目的是公开了棉子糖肠球菌M1 CGMCC No.5584的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）菌株的初步筛选：从我国东北三省12个区域自然腌制的酸菜汤中，采用双层平板法，即含有1％的碳酸钙和谷氨酸钠，30℃培养48h，挑选在高浓度谷氨酸钠平板上生长且具有透明圈的菌落进行静置发酵，发酵温度30℃，发酵时间3d，采用高效液相色谱检测GABA含量，筛选出一株产量为16.95g/L的棉子糖肠球菌，编号为M3，转接在斜面上于4℃冰箱保藏；

（2）菌株的再次筛选：复筛同样采用双层平板法，将M3从斜面挑两环至种子培养基中，其中的种子培养基(g/L)：蔗糖10，蛋白胨10，酵母浸出粉5，柠檬酸铵2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.25，乙酸钠2，磷酸二氢钾2；30℃培养24h，然后涂于含有1％的碳酸钙和γ-氨基丁酸复筛平板上，30℃培养48h，挑选在高浓度γ-氨基丁酸平板上生长且具有透明圈的菌落进行静置发酵，发酵温度30℃，发酵时间3d，采用高效液相色谱检测GABA含量，筛选出一株产量为24.68g/L的棉子糖肠球菌，编号为M2，转接在斜面上于4℃冰箱保藏；

（3）将种子培养基中的菌株培养液以10%(v/v)接种量转接于驯化培养基（Ⅰ）中，在30℃下，160r/min摇床培养12h，再转接于驯化培养基（Ⅱ）中，最后经过分离纯化培养，获得单菌落，然后进行静置发酵，发酵温度30℃，发酵时间3d选取高产菌株；

其中的驯化培养基（Ⅰ）(g/L)：玉米糖化液10，蛋白胨10，酵母浸出粉15，微量元素液15mL，谷氨酸（Glu）60；其中微量元素液指的是含有氯化钠1mg/mL，硫酸亚铁1mg/mL，硫酸锰1mg/mL的溶液；

驯化培养基（Ⅱ）(g/L)：葡萄糖15，酵母粉20，蛋白胨10，谷氨酸70；

（4）高产γ-氨基丁酸菌株的获得：利用复筛平板纯化后的菌株中筛选得到一株γ-氨基丁酸菌株（GABA），记为M1菌株，转接在斜面上于4℃冰箱保藏。

其中步骤（4）中的分纯指的是：将高产菌株在种子培养基中进行液体静置培养，培养温度30℃，培养时间12h，并取1mL培养液将其稀释成10^-7～10^-9后涂布于平板上，30℃培养1～2d，观察菌落形态和革兰氏染色形态,结果，记录并拍照。

本发明再一个目的是公开了采用CGMCC No.5584制备γ-氨基丁酸GABA的方法，它是在发酵过程中分为细胞生长和细胞转化两个阶段，采取不同的pH和通氧控制步骤如下：

(1)获得种子液：以10%的接种量，30℃静置培养12h为一轮活化，然后将活化6轮棉子糖肠球菌以10%的接种量接入装有种子培养基的容器内，30～40℃下在有氧环境下静置培养10～20h，得到种子液；其中的种子培养基(g/L)：蔗糖10，蛋白胨10，酵母浸出粉5，柠檬酸铵2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.25，乙酸钠2，磷酸二氢钾2；

（2）发酵培养：在发酵罐中倒入培养基，高压蒸汽灭菌后冷却至30℃，将种子液以重量百分比5～15%接种量接种到发酵罐中，静置、间歇搅拌发酵60h；

发酵培养基的成分为：蔗糖10～30g/L，酵母浸出粉10～30g/L，乙酸钠1～5g/L，磷酸氢二钾2～5g/L，Al₂（SO₄）₃·16H₂O 0.1～0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g/L，（NH₄）₂SO₄·12H₂O 0.1～0.5g/L，吐温80 0.1～0.4mL/L，初始pH5.5～6.5，底物8～15g/L，单独灭菌；所述添加底物方式为流加底物。

（3）调pH：发酵过程中，初始pH为5.5-6.5不控制，添加底物后当pH高于5.5时开始补酸，通过补加盐酸保持pH在4～6；其中所述的底物为9%谷氨酸钠或9%谷氨酸钠和谷氨酸的混合物。其中所述的9%谷氨酸钠和谷氨酸的重量份数比为L-MSG/L-Glu=4：1～6:1。

本发明生产高产γ-氨基丁酸的特点：

（1）采用代谢控制发酵理论并结合乳酸细菌的特性，设计筛选选育高产GABA的分离平板，高效率地选育出高效的GABA产生菌—棉子糖肠球菌(Entercoccus raffinosus)。

经天津市疾病预防控制中心检测（受理编号2011WT-QT-0093）:

检验项目：小鼠急性经口毒性试验

检测结果：动物染毒后，未见明显中毒表现，观察期内无死亡，尸检中各主要脏器未见明显异常。

检测结论：本品的小鼠急性经口毒性LD50＞20.0／g／kg.BW。按《食品安全性毒理学评价疗程和方法》（GB15193.3-2003），本品属于无毒。

稳定性试验：将此实验方案设重复5次，平均产量均稳定在25g/L以上。

M1菌株经细菌生理生化试验和16S rDNA测序鉴定为Entercoccus raffinosus CGMCC No.5584。

（2）采用现代发酵技术，充分利用和发挥Entercoccus raffinosus CGMCC No.5584的活力，用生长细胞发酵的方法进行GABA生产。

本发明采用棉子糖肠球菌M1（其保藏号为CGMCC No.5584）生产高产γ-氨基丁酸的优点和有益效果在于：

1、本发明是现代生物医药、保健食品和传统发酵工程技术的有机结合，大量、低成本地制备γ-氨基丁酸。GABA是哺乳动物、甲壳类动物、昆虫和某些寄生蠕虫神经系统中重要的抑制性神经递质。它具有改善脑机能、延长记忆力、改善视觉功能、镇静神经、降血压、改善肝功能、活化肾功能等重要的生理功能。被开发为降血压、治疗癫痫、抗焦虑与抗惊厥、抗心律失常、调节激素的分泌及其生殖生理等药物中间体，GABA也可以制成保健营养品以及食品及饲料添加剂。

2、本发明选育出高产GABA的棉子糖肠球菌Entercoccus raffinosus CGMCC No.5584采用微生物厌氧发酵GABA。具有采用原料低廉、生产中能耗低，生产成本低、易实现工业化生产等优点，具有良好的社会和经济效益。

附图说明：

图1为 10株乳酸菌菌株发酵液中GABA产生的层析结果；

图2为菌株M1菌落和菌体细胞形态(×1000)，菌株M1在MRS平板上生长24h，菌落直径1~2mm，菌落白色，表面光滑隆起、呈圆形、菌落边缘整齐；革兰氏染色观察，细胞呈卵圆形，大多数呈对排列或短链排列，极少见呈长链，革兰氏阳性，无芽孢，菌体直径约为1μm；极少见呈长链，革兰氏阳性，无芽孢，菌体直径约为1μm。

具体实施方式：

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中微量元素液指的是含有氯化钠1mg/mL，硫酸亚铁1mg/mL，硫酸锰1mg/mL的溶液；另外实施例中所用到的试剂除特别说明外，其它均有市售。

实施例1

棉子糖肠球菌菌株M1（CGMCC No.5584）的获得

（4）高产γ-氨基丁酸菌株的获得：利用复筛平板纯化后的菌株中筛选得到一株γ-氨基丁酸菌株（GABA），记为M1菌株，转接在斜面上于4℃冰箱保藏。分纯指的是：将高产菌株在种子培养基中进行液体静置培养，培养温度30℃，培养时间12h，并取1mL培养液将其稀释成10^-7～10^-9后涂布于平板上，30℃培养1d，观察菌落形态和革兰氏染色形态,结果，记录并拍照。

实施例2

采用棉子糖肠球菌菌株M1（CGMCC No.5584）生产GABA

将活化后的Entercoccus raffinosus CGMCC No.5584菌株接种于种子培养基中培养，活化步骤如下：将M1从斜面挑两环至种子培养基中，其中的种子培养基(g/L)：蔗糖10，蛋白胨10，酵母浸出粉5，柠檬酸铵2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.25，乙酸钠2，磷酸二氢钾2；，30℃静置培养24h，待菌体量达到发酵条件时转接入发酵培养基。

种子培养基(g/L)及培养方法：蔗糖10，蛋白胨10，酵母浸出粉5，柠檬酸铵2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.25，乙酸钠2，磷酸二氢钾2。种子培养条件：30℃培养箱，静置培养12h。按照10～15%的接种量接入到10L发酵罐中。

发酵培养基(g/L)及培养方法：蔗糖20，酵母浸出粉15，乙酸钠2，磷酸氢二钾2，硫酸铝0.3，硫酸镁0.4，硫酸铵0.2，吐温80 0.2mL。控制发酵罐培养温度为30℃，初始pH为6.0。通风12h，通风量为0.5L/min，6h左右的pH降为5.0，此时控制pH，不要继续下降，补加浓度为9%的底物谷氨酸钠8g/L。发酵58h后底物全部转化为GABA，产量为47.83g/L。

实施例3

采用棉子糖肠球菌菌株M1（CGMCC No.5584）生产GABA

将活化后的Entercoccus raffinosus CGMCC No.5584菌株接种于种子培养基中培养，待菌体量达到发酵条件时转接入发酵培养基。

发酵培养基(g/L)及培养方法：蔗糖20，酵母浸出粉15，乙酸钠2，磷酸钾2，硫酸铝0.3，硫酸镁0.4，硫酸铵0.2，吐温80 0.2mL。控制发酵罐培养温度为30℃，初始pH为6.0。通风12h，通风量为0.5L/min，6h左右的pH降为5.0，此时控制pH，不要继续下降，9%的底物按照L-MSG/L-Glu=5：1（重量份数比）加入。发酵58h后底物全部转化为GABA，产量为54.98g/L。

实施例4

采用棉子糖肠球菌菌株M1（CGMCC No.5584）生产GABA

将活化后的Entercoccus raffinosus CGMCC No.5584菌株接种于种子培养基于30℃下生长培养10～12h。

种子培养基为(g/L)：蔗糖20，酵母浸出粉15，乙酸钠4，磷酸钾5，硫酸铝0.3，硫酸镁0.4，硫酸铵0.2，吐温80 2mL。控制发酵罐培养温度为30℃，初始pH为6.0。以10～15%的接种量转接入发酵培养基（g/L）：蔗糖糖20，酵母浸出粉15，乙酸钠2，磷酸钾2，硫酸铝0.3，硫酸镁0.4，硫酸铵0.2，吐温80 0.3mL，pH6.0。培养12h，菌体生长进入到对数期生长后，按照L-MSG/L-Glu=5：1（重量份数比）加入9%的底物，调节pH为4.6，并一直控制在4.6，实时监测谷氨酸钠消耗程度，然后流加底物；发酵53～58h时，检测L-谷氨酸含量为5.34g/L，GABA达到130.23g/L，即停止发酵。

实施例5

采用棉子糖肠球菌菌株M1（CGMCC No.5584）生产GABA

(1)获得种子液：以10%的接种量，30℃静置培养12h为一轮活化，然后将活化6轮棉子糖肠球菌以10%的接种量接入装有种子培养基的容器内，30℃下在有氧环境下静置培养15h，得到种子液；其中的种子培养基(g/L)：蔗糖10，蛋白胨10，酵母浸出粉5，柠檬酸铵2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.25，乙酸钠2，磷酸二氢钾2；

（2）发酵培养：在发酵罐中倒入培养基，高压蒸汽灭菌后冷却至30℃，将种子液以重量百分比515%接种量接种到发酵罐中，静置、间歇搅拌发酵60h；

发酵培养基的成分为：蔗糖20g/L，酵母浸出粉102g/L，乙酸钠3g/L，磷酸氢二钾35g/L，Al₂（SO₄）₃·16H₂O 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，（NH₄）₂SO₄·12H₂O 0.5g/L，吐温80 0.1mL/L，初始pH6.5，加入9%的底物（按照重量份数比L-MSG/L-Glu=4：1），单独灭菌；

（3）调pH：发酵过程中，初始pH为6.5不控制，添加底物后当pH高于6.5时开始补酸，通过补加盐酸保持pH在4～6；其中所述的底物为谷氨酸和谷氨酸钠的混合物。

虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，再不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进均属本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种高产γ-氨基丁酸的棉子糖肠球菌（Entercoccus raffinosus）M1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.5584。

2.一种采用权利要求1所述CGMCC No.5584制备γ-氨基丁酸GABA的方法，其特征在于：在发酵过程中分为细胞生长和细胞转化两个阶段采取不同的pH和通氧控制步骤如下：

(1)获得种子液：以10%的接种量，30℃静置培养12h为一轮活化，然后将活化6轮棉子糖肠球菌以10%的接种量接入装有种子培养基的容器内，30～40℃下在有氧环境下静置培养10～20h，得到种子液；其中的种子培养基：蔗糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，柠檬酸铵2 g/L，硫酸镁0.58 g/L，硫酸锰0.25 g/L，乙酸钠2 g/L，磷酸二氢钾2 g/L；

发酵培养基的成分为：蔗糖10～30g/L，酵母浸出粉10～30g/L，乙酸钠1～5g/L，磷酸氢二钾2～5g/L，Al₂（SO₄）₃·16H₂O 0.1～0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g/L，（NH₄）₂SO₄·12H₂O 0.1～0.5g/L，吐温80 0.1～0.4mL/L，初始pH5.5～6.5，底物8～15g/L，单独灭菌；

（3）调pH：发酵过程中，初始pH为5.5-6.5不控制，添加底物后当pH高于5.5时开始补酸，通过补加盐酸保持pH在4～6；其中所述的底物为9%谷氨酸钠。

3.根据权利要求2所述的方法，其中添加底物方式为流加底物。

4.权利要求1所述棉子糖肠球菌M1在制备生产γ-氨基丁酸方面的应用。