CN101302480A - 高产γ-氨基丁酸红色红曲霉Mr-5菌株及其筛选方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术食品领域，尤其涉及一种高产γ－氨基丁酸红色红曲霉Mr－5菌株及其筛选方法和用途。本发明的高产GABA红色红曲霉(Monascusruber Mr－5)菌株，其保藏编号为：CCTCC NO：M208043，保藏地为：中国典型培养物保藏中心。本发明另外还公开了上述的红色红曲霉Mr－5菌株的筛选方法以及用途和用于γ－氨基丁酸的合成的方法。本发明采用生物法合成γ－氨基丁酸的方法所得的发酵液中含6～9g/L的γ－氨基丁酸。并且，所生产的γ－氨基丁酸不存在安全上的隐患能达到食品安全级。
Description
技术领域
本发明属于生物技术食品领域，尤其涉及一种高产γ-氨基丁酸红色红曲霉(Monascus ruber Mr-5)菌株及其筛选方法和用途。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)是一种天然存在的活性氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，具有降血压、治疗癫病、镇静安神、增强记忆、控制哮喘、调节激素分泌、促进生殖、健肝利肾、减轻更年期综合症等多种生理功能。富含GABA的食品具有很好的免疫保健作用，可以作为一种功能性食品。
GABA广泛分布在动物、植物和微生物中。以食用植物(如茶叶、桑叶)、粮食(如稻米、米胚芽)、农副产品(如米糠)等进行GABA富集，可以实现以这些原料加工的食品GABA强化。但是其GABA含量很低，要从这些原料提取GABA作为食品添加剂或制成保健品非常困难。GABA的化学合成由于缺乏安全性，不适宜作为食品添加剂或医用GABA。利用食品安全级的微生物合成法生产GABA是一条较理想的途径。研究表明乳酸菌、酵母菌、曲霉菌等是一类被公认为安全的微生物，基因技术的发展和微生物基因谱揭示乳酸菌、酵母菌、曲霉菌等也具有GAD活性，可以进行GABA生产。
红曲霉(Monascus spp)是一类十分重要的药用真菌，系中药红曲的基原菌。已经在食品生产中长期而广泛使用，可用于烹饪、制作豆腐乳、酿酒和治疗疾病等，有降血脂、降血压等作用。国内已有以红曲霉为主要成分的中成药如“血脂康”和“地奥脂必妥”等上市应用，且疗效确切。作为食品添加剂也是红曲霉应用的主要方向，目前对红曲霉的研究已从红曲色素扩展到有关降血压、血糖、胆固醇和抑瘤抗癌、提高人体的免疫力等多个方面，而且红曲霉发酵产物本身具有较好的营养价值，长期使用对人体有益无害。
申请人在浙江师范大学学报(自然科学)第30卷第4期发表了《红腐乳中高产γ-氨基丁酸红曲霉菌株的筛选》文章，其中公开了从红腐乳中分离筛选到一株相对高产γ-氨基丁酸(GABA)的红曲霉菌株M-6，初步鉴定该菌株为紫红曲霉(Monascus purpureus)。对菌株M-6的发酵培养基和发酵条件用单因素轮换试验和正交试验进行了整体优化，结果表明，菌株M-6转化富集GABA的适宜条件为：以可溶性淀粉为碳源、牛肉膏和硝酸钠为复合氮源，在初始pH5.0、培养温度40℃、摇床速度120r/min条件下发酵培养48h，发酵液中GABA的产量最高可达7.826g/L，表明利用红曲霉菌株进行富含GABA食品的生产是可行的。
发明内容
针对现有技术中天然食品GABA含量较低，现有发酵工艺中采用的红曲霉菌株GABA产量低等问题。本发明的一个目的是提供一种从自然环境不同场所筛选的高产GABA红色红曲霉Mr-5菌株。
本发明的第二个目的是提供上述的高产GABA红色红曲霉Mr-5菌株的筛选方法。
本发明的第三个目的是提供上述的高产GABA红色红曲霉Mr-5菌株的用途以及用于γ-氨基丁酸合成的方法。
为了实现上述的第一个目的，本发明所述的高产GABA红色红曲霉(Monascus ruber Mr-5)菌株，其保藏编号为：CCTCC NO：M208043，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日为：2008年3月24日。
为了实现上述的第二个目的，本发明的红色红曲霉Mr-5菌株筛选自红曲米。其筛选方法如下：将红曲米研磨成粉，进行梯度稀释，选择浓度为10-2的稀释液涂布平板，20℃～30℃培养，挑取早期菌落为白色，后期为红色或紫红色的单菌落，连续划线分离纯化，得性状单一的红色红曲霉Mr-5菌株。
为了实现上述的第三个目的，本发明的红色红曲霉Mr-5菌株用于γ-氨基丁酸的合成。上述的红色红曲霉Mr-5菌株用于γ-氨基丁酸合成的方法，包括以下的步骤：
a、取红色红曲霉Mr-5菌株保存菌种，在无菌条件下，挑少许菌种，转接于含PDA的培养皿中，活化培养；
b、以同样方式接入活化好的菌种到一级PDA培养基中，培养一级种子；
c、在PD培养液，接入上述的一级种子菌饼，培养二级发酵种子；
d、在发酵培养基中接入上述的二级发酵种子，进行发酵；
e、发酵完毕，对发酵液水浴，离心取上清液，可得高GABA含量的红曲霉发酵液。
作为优选，上述的发酵培养基为淀粉类发酵培养基。发酵培养基的固体物质按重量百分比计包括：淀粉类物质40～70％，硝酸钠10～40％，谷氨酸钠1～20％，硫酸锌0.5～2％，氯化钙0.5～2％。其中，所述的淀粉类发酵培养基可以选自谷类、根茎类或豆类中的一种或多种。作为再优选，发酵培养基淀粉类发酵培养基为小麦粉或番薯淀粉发酵培养基。
作为优选，上述的步骤d中二级发酵种子按体积百分比计接种量为5％，摇床培养，转数为200r/min，温度为35℃，通气量为100L/h，罐压为0.03MPa，发酵时间为4天。
作为优选，上述的步骤e中对发酵液水浴的温度为100℃，时间为20分钟。
本发明采用生物法合成γ-氨基丁酸是利用红色红曲霉Mr-5菌株体内高活性的谷氨酸脱羧酶，此酶以L-谷氨酸(L-MSG)为底物，将L-谷氨酸(L-MSG)α-脱羧，产生γ-氨基丁酸和CO2，经过上述的方法所得的发酵液中含6～9g/L的γ-氨基丁酸。另外，红曲霉制品的保健功效世人公认，被FDA认为是GRAS(generally recognized as safe)级食品添加剂。因此，本发明所生产的γ-氨基丁酸不存在安全上的隐患能达到食品安全级。
附图说明
图1～图2为红色红曲霉Mr-5菌株MEA上培养7天菌落特征，其中图1图为正面，图2为背面。
图3～图5为红色红曲霉Mr-5菌株的形态特征。图3为菌丝，图4为分生孢子，图5为闭囊壳。
图6为红色红曲霉Mr-5菌株小麦粉发酵液。
图7为红色红曲霉Mr-5菌株在小麦粉和番薯粉发酵培养基中GABA产量的随发酵时间的变化图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明具体实施方式做一个详细的说明。
实施例1从红曲米中筛选的红色红曲霉Mr-5菌株
采用梯度稀释分离法。将红曲米(10mg)研磨成粉，进行梯度稀释(10-1-10-4)，选择合适的浓度(10-2)200μL涂布平板，25℃培养，挑取早期菌落为白色(约3d)，后期为红色或紫红色的单菌落(约5d)，连续划线分离纯化，得性状单一的纯红色红曲霉Mr-5菌株，编号，4℃冰箱保存，备用。用PDA固体斜面培养基进行菌种活化传代，菌种每4周转接一次；菌种使用之前需先活化。
上述的红色红曲霉Mr-5菌株的菌落特征为麦芽汁琼脂(MEA)培养基上25℃培养7天，菌落直径32mm，质地较疏松，边缘不规则，金莺黄色(附图1，2)；25天，直径达70mm，边缘有缺刻，淡可可棕色、气生菌丝为淡可可棕色。
显微镜观察菌丝体有分枝，有隔膜，直径3～8μm，含有空泡及黄色油滴；菌丝和分枝顶端产生分生孢子，单生或成链，梨形或球形，大小5～7.8×8.5～10.5μm；闭囊壳(被子器)红色，圆球形，直径25～60μm，具柄，闭囊壳内散生众多子囊，成熟后子囊壁解体，孢子剩留在薄壁的闭囊壳内；子囊孢子卵形或椭球形，光滑，橙红色，4.3～5.4×6.5μm，或直径4.2～5.0μm(附图3～5)。
菌株的稳定性：分别在麦芽汁琼脂培养基和土豆琼脂培养基上，30℃10天条件下，经15代连续培养，其培养特征、形态特征和GABA产量均无明显变化，该菌的生物性状基本稳定。
实施例2红色红曲霉Mr-5菌株用于γ-氨基丁酸合成的方法
(一)培养基
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，水1000mL，pH5.5。
PD培养液：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，pH5.5。
豆芽汁培养基：豆芽200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，水1000mL，pH5.5。
小麦粉发酵培养基：小麦粉50g，硝酸钠25g，谷氨酸钠5g，硫酸锌1g，氯化钙1g，初始pH5.5。
番薯淀粉发酵培养基：番薯淀粉50g，硝酸钠25g，谷氨酸钠5g，硫酸锌1g，氯化钙1g，初始pH5.5。
(二)合成的方法
取红色红曲霉Mr-5菌株保存菌种，在无菌条件下(无菌室或超净工作台)，用接种针挑少许菌种，转接于含PDA的培养皿中，30℃活化培养108小时。以同样方式接入活化好的菌种到一级PDA培养基中，在30℃培养120小时，即为一级种子。250mL三角瓶装入50mL PD培养液，接入一块直径为1cm Mr-5菌株一级种子菌饼，30℃摇床(180r/min)培养4天，即为二级发酵种子。根据发酵规模大小，如3.7L发酵罐装2500mL发酵培养基，接种量5％(V/V)，转数200r/min，温度35℃，通气量100L/h，罐压0.03MPa。发酵时间为4天。发酵完毕，对发酵液(含红曲霉菌丝体)100℃水浴20分钟，离心取上清液，可得高GABA含量的红曲霉发酵液，颜色为红色(附图6)。
本发明中的红色红曲霉Mr-5菌株选育于红曲米中，采用深层液体发酵方法，发酵产物与普通红曲发酵产物相比，普通红曲液体发酵产物GABA含量很低，经高效液相色谱(HPLC)检测为0～2.5g/L，按上述改进方法用Mr-5红曲霉菌株发酵发酵液中GABA含量可达9.5g/L(附图7，HPLC检测报告编号20074898)。
综上所述，经过红色红曲霉Mr-5菌株发酵，可以产生含量较高GABA，筛选治疗高血脂，维持血压正常(降低高血压或升高低血压)药用成分的又一天然微生物资源。
Claims (11)
1.红色红曲霉Mr-5菌株，其特征在于：红色红曲霉Mr-5菌株(Monascusruber Mr-5)的保藏编号为CCTCC NO：M208043。
2.根据权利要求1所述的红色红曲霉Mr-5菌株的筛选方法，其特征在于：所述的红色红曲霉Mr-5菌株筛选自红曲米。
3.根据权利要求2所述的红色红曲霉Mr-5菌株的筛选方法，其特征在于：
将红曲米研磨成粉，进行梯度稀释，选择浓度为10-2的稀释液涂布平板，20～30℃培养，挑取早期菌落为白色，后期为红色或紫红色的单菌落，连续划线分离纯化，得性状单一的红色红曲霉Mr-5菌株。
4.根据权利要求1所述的红色红曲霉Mr-5菌株用于γ-氨基丁酸的合成。
5.根据权利要求1所述的红色红曲霉Mr-5菌株用于γ-氨基丁酸合成的方法，其特征在于包括以下的步骤：
a、取红色红曲霉Mr-5菌株保存菌种，在无菌条件下，挑少许菌种，转接于含PDA的培养皿中，活化培养；
b、以同样方式接入活化好的菌种到一级PDA培养基中，培养一级种子；
c、在PD培养液，接入上述的一级种子菌饼，培养二级发酵种子；
d、在发酵培养基中接入上述的二级发酵种子，进行发酵；
e、发酵完毕，对发酵液水浴，离心取上清液，可得高GABA含量的红曲霉发酵液。
6.根据权利要求5所述的红色红曲霉Mr-5菌株用于γ-氨基丁酸合成的方法，其特征在于：发酵培养基为淀粉类发酵培养基。
7.根据权利要求6所述的红色红曲霉Mr-5菌株用于γ-氨基丁酸合成的方法，其特征在于：淀粉类发酵培养基选自谷类、根茎类或豆类中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的红色红曲霉Mr-5菌株用于γ-氨基丁酸合成的方法，其特征在于：淀粉类发酵培养基为小麦粉或番薯淀粉发酵培养基。
9.根据权利要求7或8所述的红色红曲霉Mr-5菌株用于γ-氨基丁酸合成的方法，其特征在于淀粉类发酵培养基的固体物质按重量百分比计包括：淀粉类物质40～70％，硝酸钠10～40％，谷氨酸钠1～20％，硫酸锌0.5～2％，氯化钙0.5～2％。
10.根据权利要求5～8任意一项权利要求所述的红色红曲霉Mr-5菌株用于γ-氨基丁酸合成的方法，其特征在于：步骤d中二级发酵种子按体积百分比计接种量为5％，摇床培养，转数为200r/min，温度为35℃，通气量为100L/h，罐压为0.03MPa，发酵时间为4天。
11.根据权利要求5～8任意一项权利要求所述的红色红曲霉Mr-5菌株用于γ-氨基丁酸合成的方法，其特征在于：步骤e中对发酵液水浴的温度为100℃，时间为20分钟。
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