CN106867982A - 一种碱性蛋白酶的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种碱性蛋白酶的生产方法，以地衣芽孢杆菌为生产菌株，在发酵培养中使用基础培养基和补充培养基，所述基础培养基成分包括蛋白胨、酵母浸粉、糊精、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、氯化钙、氯化钴、豆粕和水；所述补充培养基成分包括糊精和蛋白胨。在发酵36小时后用补充培养基补充糖和氮源，有效提高了碱性蛋白酶的产量，发酵60小时后发酵液中碱性蛋白酶酶活达5万u/毫升以上，显著提高了生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域，具体涉及以一种碱性蛋白酶的生产方法。
背景技术
碱性蛋白酶，指在碱性条件下能够水解蛋白质肽键的酶，碱性蛋白酶在各领域都应用很广泛，在工业、食品等领域都有十分广阔的应用市场。在工业上的主要是用于制造加酶洗涤剂，其有助于去除血渍、汗渍等蛋白质污垢，还用于轻纺工业，最常用于绢丝脱胶羊毛的防缩等。在食品方面的应用包括蛋白类食品的发酵、肉类的嫩化、酒精的澄清等。蛋白酶的研究和应用已经有很长的历史，但是，随着社会的进步，科技的不断发展，对蛋白酶的研究会有更广阔的范围。我国人口众多，每年对碱性蛋白酶的需求量很大，因此，如何用低成本生产出高活性的碱性蛋白酶，是需要迫切解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提高碱性蛋白酶的产酶水平，提供一种碱性蛋白酶的生产方法。
本发明提供的碱性蛋白酶的生产方法，以地衣芽孢杆菌为生产菌株，是将地衣芽孢杆菌在发酵培养中使用基础培养基和补充培养基，所述基础培养基成分包括蛋白胨、酵母浸粉、糊精、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、氯化钙、氯化钴、豆粕和水；所述补充培养基成分包括糊精和蛋白胨。
相较于其它的地衣芽孢杆菌培养基，本发明提供的地衣芽孢杆菌培养基中富含地衣芽孢杆菌生长和表达碱性蛋白酶所需的营养成分。采用发明中的培养基配方和补料工艺能显著的延长地衣芽孢杆菌的生长周期，降低其芽孢产生率，并达到地衣芽孢杆菌高产碱性蛋白酶的效果。
优选地，基础培养基中各成分用量为：蛋白胨15～20g/L，酵母浸粉5～15g/L，糊精25～35g/L，磷酸氢二钠2～5g/L，磷酸二氢钾2～5g/L，硫酸镁0.5～0.8g/L，硫酸锰0.4～0.6g/L，氯化钙0.1～0.3g/L，氯化钴0.03～0.07g/L，豆粕3～7g/L。
优选地，补充培养基中糊精含量为发酵液总质量的3～4％，蛋白胨含量为发酵液总质量的1％。
优选地，在发酵培养之前，还包括菌种的活化、摇瓶培养和种子罐培养的步骤；其中，摇瓶培养使用摇瓶培养基，成分包括蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠和葡萄糖。
优选地，摇瓶培养基中蛋白质含量为10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖20g/L。
优选地，菌种的活化是取保存的地衣芽孢杆菌菌种在LB平板培养基上，37℃培养48小时。
优选地，发酵培养温度为37℃，通气量0.5V/V·min，搅拌200转/分钟。
优选地，发酵培养先使用基础培养基，培养36小时后，加入补充培养基，调整发酵液溶氧量在9～11％，用氨水调节pH值在6.3～6.8，直到发酵结束。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过在发酵过程中使用专门适用于地衣芽孢杆菌的基础培养基和补充培养基，在发酵培养后期补充糖和氮源，经过60小时发酵得到的发酵液中碱性蛋白酶酶活5万u/毫升以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶发酵
(1)菌种活化：将斜面保存的菌种挑取单菌落接种在LB平板(常规方法配制)培养基上，37℃培养48小时；
(2)摇瓶培养：将活化后的菌种接种在成分包括蛋白胨10克/升，酵母浸粉5克/升，氯化钠10克/升，葡萄糖20克/升的摇瓶培养基中，在37℃，200转/分钟的条件下摇瓶培养24小时；
(3)种子罐培养：以5％的接种量将摇瓶种子液接种到成分为蛋白胨20克/升，酵母浸粉10克/升，糊精30克/升，磷酸氢二钠3克/升，磷酸二氢钾3克/升，硫酸镁0.7克/升，硫酸锰0.5克/升，氯化钙0.2克/升，氯化钴0.05克/升，豆粕5克/升的种子罐培养基中，在37℃，通气量1(V/V·min)，搅拌200转/分钟条件下培养12小时；
(4)发酵罐培养：以10％的接种量将二级种子罐种子液转入成分为蛋白胨20克/升，酵母浸粉10克/升，糊精30克/升，磷酸氢二钠3克/升，磷酸二氢钾3克/升，硫酸镁0.7克/升，硫酸锰0.5克/升，氯化钙0.2克/升，氯化钴0.05克/升，豆粕5克/升的发酵培养基础培养基，在温度37℃，通气量0.5(V/V·min)，搅拌200转/分钟，罐压0.05Mpa条件下进行发酵；其中用氨水控制发酵液pH值在6.3～6.8范围内。发酵开始36小时后，用成分为糊精含量为发酵液总量3～4％，蛋白胨含量为发酵液总量1％的混合培养基作为发酵培养基补充培养基补糖和氮源，补糖后培养液溶氧控制在10％左右，直至发酵结束。
经过上述条件的培养，60小时发酵液中碱性蛋白酶酶活53645u/毫升，远高于一般发酵能达到的1400u/毫升左右的水平。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (8)
1.一种碱性蛋白酶的生产方法，以地衣芽孢杆菌为生产菌株，其特征在于，地衣芽孢杆菌在发酵培养中使用基础培养基和补充培养基，所述基础培养基成分包括蛋白胨、酵母浸粉、糊精、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、氯化钙、氯化钴、豆粕和水；所述补充培养基成分包括糊精和蛋白胨。
2.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，基础培养基中各成分用量为：蛋白胨15～20g/L，酵母浸粉5～15g/L，糊精25～35g/L，磷酸氢二钠2～5g/L，磷酸二氢钾2～5g/L，硫酸镁0.5～0.8g/L，硫酸锰0.4～0.6g/L，氯化钙0.1～0.3g/L，氯化钴0.03～0.07g/L，豆粕3～7g/L。
3.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，补充培养基中糊精含量为发酵液总质量的3～4％，蛋白胨含量为发酵液总质量的1％。
4.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，在发酵培养之前，还包括菌种的活化、摇瓶培养和种子罐培养的步骤；其中，摇瓶培养使用摇瓶培养基，成分包括蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠和葡萄糖。
5.根据权利要求4所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，摇瓶培养基中蛋白质含量为10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖20g/L。
6.根据权利要求4所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，菌种的活化是取保存的地衣芽孢杆菌菌种在LB平板培养基上，37℃培养48小时。
7.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，发酵培养温度为37℃，通气量0.5V/V·min，搅拌200转/分钟。
8.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，发酵培养先使用基础培养基，培养36小时后，加入补充培养基，调整发酵液溶氧量在9～11％，用氨水调节pH值在6.3～6.8，直到发酵结束。
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