CN109750020A

CN109750020A - 一种碱性蛋白酶的生产方法

Info

Publication number: CN109750020A
Application number: CN201910175552.9A
Authority: CN
Inventors: 熊鹏; 谌颉; 张茜茜; 詹志春; 周樱
Original assignee: WUHAN SUNHY BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUHAN SUNHY BIOLOGY CO Ltd
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2019-05-14

Abstract

本发明提供一种碱性蛋白酶的生产方法，通过将地衣芽孢杆菌菌种接入第一培养基进行分离培养、第二培养基进行种子培养、活化培养基进行活化培养、种子扩大培养基进行扩大培养、发酵培养基中进行液体深层发酵得到碱性蛋白酶。通过该生产方法可以大量提高碱性蛋白酶的表达量，且获得的碱性蛋白酶活性高。

Description

一种碱性蛋白酶的生产方法

技术领域

本发明涉及微生物工程技术领域，尤其涉及一种碱性蛋白酶的生产方法。

背景技术

碱性蛋白酶(Alkaline Protease)是能在碱性条件下水解蛋白质肽键的一类酶，属于内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，在工业上的主要是用于制造加酶洗涤剂，其有助于去除血渍、汗渍等蛋白质污垢，还用于轻纺工业，最常用于绢丝脱胶羊毛的防缩等。在食品方面的应用包括蛋白类食品的发酵、肉类的嫩化、酒精的澄清等。

微生物发酵产碱性蛋白酶，由于其培养简单、价格低廉、来源广、产量高等优点而被广泛应用于工业化生产。在产碱性蛋白酶的微生物中，地衣芽孢杆菌是一种安全的蛋白酶生产菌，研究的比较深入。

近年来，我国采用微生物发酵产碱性蛋白酶研究的比较多，但是菌体表达量没有得到明显的提升，碱性蛋白酶活力上不去，较国外碱性蛋白酶制剂相差较远，致使我国工业生产中用到的碱性蛋白酶主要依赖于进口。因此，如何提高微生物产碱性蛋白酶的表达量是需要迫切解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种碱性蛋白酶的生产方法，通过该生产方法可以大量提高碱性蛋白酶的表达量，且获得的碱性蛋白酶活性高。

为实现以上目的，本发明提供一种碱性蛋白酶的生产方法，包括以下步骤：

步骤a.将地衣芽孢杆菌菌种接入第一培养基进行培养分离得到单菌落，将所述单菌落在第二培养基中进行种子培养得到地衣芽孢杆菌菌落；

步骤b.将经种子培养得到的地衣芽孢杆菌菌落接入活化培养基中进行活化培养；

步骤c.将活化培养后的地衣芽孢杆菌菌落接入到种子扩大培养基中进行扩大培养；

步骤d.将扩大培养后的地衣芽孢杆菌菌落接入发酵培养基中进行液体深层发酵，得到含碱性蛋白酶的发酵液，所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖5～90g/L，酵母膏3～50g/L，豆粕粉30～120g/L，硫酸锰0.05～2g/L，氯化钙0.3～15g/L，磷酸铵10～30g/L，碳酸氢钠3～15g/L，硫酸镁0.5～15g/L，玉米浆3～15g/L，PPG0.3～8g/L。

作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤a中，所述第一培养基包括以下组分：蛋白胨5～15g/L，牛肉浸提物3～10g/L，葡萄糖10～25g/L，氯化钠0.1～10g/L，琼脂粉5～10g/L。

作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤a中，所述第二培养基包括以下组分：葡萄糖15～35g/L，酵母膏10～25g/L，磷酸铵2.5～5g/L，碳酸氢钠0.5～1g/L，氯化钙0.3～5g/L，硫酸镁2～5g/L，PPG1～2滴/L。

作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤b中，所述活化培养基包括以下组分：葡萄糖10～35g/L，酵母膏10～25g/L，硫酸锰0.25～0.5g/L，氯化钙0.5～10g/L，磷酸铵2.5～10g/L，碳酸氢钠0.5～1g/L，硫酸镁2～5g/L，琼脂粉5～10g/L。

作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤c中，所述种子扩大培养基包括以下组分：葡萄糖20～40g/L，酵母膏20～35g/L，硫酸锰0.25～0.5g/L，氯化钙0.5～10g/L，磷酸铵2.5～10g/L，碳酸氢钠0.5～1g/L，硫酸镁2～5g/L，PPG1～2滴/L。

作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤d中，所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖25～50g/L，酵母膏10～25g/L，豆粕粉60～80g/L，硫酸锰0.25～0.5g/L，氯化钙0.5～10g/L，磷酸铵15～25g/L，碳酸氢钠5～10g/L，硫酸镁1～10g/L，玉米浆5～10g/L，PPG0.5～4g/L。

作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤a中，所述单菌落在第二培养基中进行种子培养后进行保藏，所述保藏的方式为：在第二培养基中加入重量百分比为10～30％的甘油得到混合溶液，在每根甘油管中接入所述混合溶液1.5ml，置于-50～-80℃冷藏。

作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤b中，进行活化培养时的培养温度为35～40℃，pH为6.5-7.5，震荡培养，转速为150～200r/min。

作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤c中，进行扩大培养时的培养温度为35～40℃，pH为6.5-7.5，震荡培养，转速为150～200r/min。

作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤d中，进行液体深层发酵时的发酵温度为35～40℃，发酵时进行搅拌，搅拌转速为300～600r/min，氧气通气量为1.0～2.5m³/h。

本发明的有益效果：

1.本发明提供一种碱性蛋白酶的生产方法，通过将地衣芽孢杆菌菌种依次进行第一培养基进行分离培养、第二培养基进行种子培养、活化培养基进行活化培养、种子扩大培养基进行扩大培养、发酵培养基中进行液体深层发酵得到碱性蛋白酶，通过该生产方法可以大量提高碱性蛋白酶的表达量，且获得的碱性蛋白酶活性高。

2.通过对各培养基成分、发酵条件优化，使得从发酵培养基中获得高活力的碱性蛋白酶。发酵培养基中加入一定量的不同的氮源物质供地衣芽孢杆菌菌落不同时期生长所需，在发酵前期菌落利用易于吸收的氮源物质酵母膏进行快速增殖，当生物量积累到一定量后酵母膏利用完，迫使菌落分泌碱性蛋白酶降解豆粕粉释放氮源物质以供生长，从而达到获得大量碱性蛋白酶的目的。

3.本发明在发酵培养基中采用一定量的葡萄糖作为碳源物质，既不会让发酵液太过粘稠而降低溶氧条件，又使菌体能够维持一个较长的产酶稳定期。

具体实施方式

如本文所用之术语：

“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。

“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)；

发明人发现：产酶与地衣芽孢杆菌生长部分相关，当菌体生长到一定的生物量时才开始边生长边产酶；生长增殖期用酵母膏作为氮源物质利于菌体快速增殖，产酶期用豆粕粉作为氮源物质能促使其产碱性蛋白酶，而产酶期限制碳源物质的供给，能使菌体的代谢途径偏离快速增殖一方，偏向产酶一方，延长产酶期。

在本申请中，通过对地衣芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的各个代谢途径的研究，根据不同的代谢途径提供定量的不同的碳、氮源物质，以达到得到更高酶活的碱性蛋白酶的目的。

一种碱性蛋白酶的生产方法，包括以下步骤：

在所述步骤a中，所述第一培养基的包括以下组分：蛋白胨5～15g/L，牛肉浸提物3～10g/L，葡萄糖10～25g/L，氯化钠0.1～10g/L，琼脂粉5～10g/L。

上述，通过将地衣芽孢杆菌菌种接入到第一培养基中进行培养并分离可得到用于生产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌的单菌落。

具体的，所述蛋白胨可为5g/L、7g/L、8g/L、10g/L、12g/L、13g/L、15g/L等。

所述牛肉浸提物可为3g/L、5g/L、6g/L、8g/L、10g/L等；

所述葡萄糖可为10g/L、12g/L、14g/L、16g/L、18g/L、20g/L、22g/L、25g/L等。

所述氯化钠可为0.1g/L、0.5g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等。

所述琼脂粉可为5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等。

该第一培养基配制完成后在115℃灭菌30min，pH自然。

所述第二培养基的包括以下组分：葡萄糖15～35g/L，酵母膏10～25g/L，磷酸铵2.5～5g/L，碳酸氢钠0.5～1g/L，氯化钙0.3～5g/L，硫酸镁2～5g/L，PPG1～2滴/L。

上述，所述第二培养基配制时将葡萄糖、酵母膏、磷酸铵、碳酸氢钠、氯化钙、硫酸镁加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至6.5-7.5，然后再加入PPG 1～2滴/瓶；115℃灭菌30min。

可选的，所述步骤a中，所述单菌落在第二培养基中进行种子培养后进行保藏，所述保藏的方式为：在第二培养基中加入重量百分比为10～30％的甘油得到混合溶液，在每根甘油管中接入所述混合溶液1.5ml，置于-50～-80℃冷藏。

冷藏温度可为-50℃、-55℃、-60℃、-65℃、-70℃、-80℃等。可随时取用保藏的地衣芽孢杆菌菌落接入活化培养基中进行活化培养。

具体的，所述葡萄糖可为15g/L、17g/L、20g/L、23g/L、25g/L、28g/L、30g/L、35g/L等。

所述酵母膏可为10g/L、12g/L、14g/L、16g/L、18g/L、20g/L、22g/L、25g/L等。

所述磷酸铵可为2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L等。

所述碳酸氢钠可为0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L等。

所述氯化钠可为0.3g/L、0.7g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L等。

所述硫酸镁可为2g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L等。

上述，所述步骤b中，将经种子培养得到的或者保藏后的地衣芽孢杆菌菌落划线接种于活化培养基中，37℃培养24小时左右，至活化培养基表面长出清晰的菌落。

所述活化培养基包括以下组分:葡萄糖10～35g/L，酵母膏10～25g/L，硫酸锰0.25～0.5g/L，氯化钙0.5～10g/L，磷酸铵2.5～10g/L，碳酸氢钠0.5～1g/L，硫酸镁2～5g/L，琼脂粉5～10g/L。

进行活化培养时的培养温度为35～40℃，pH为6.5-7.5，震荡培养，转速为150～200r/min。

具体的，所述葡萄糖为10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L等。

所述酵母膏为10g/L、15g/L、20g/L、25g/L等。

所述硫酸锰为0.25g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.45g/L、0.5g/L等。

所述氯化钙为0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等。

所述磷酸铵为2.5g/L、3g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L等。

所述碳酸氢钠为0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L等。

所述硫酸镁为2g/L、2.5g/L、3g/L、4g/L、5g/L等。

所述琼脂粉为5g/L、7g/L、8g/L、10g/L等。

所述活化培养基配制方法是将葡萄糖、酵母膏、硫酸锰、氯化钙、磷酸铵、碳酸氢钠、硫酸镁、琼脂粉加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至6.5-7.5，115℃灭菌30min，冷却形成斜面。

所述步骤c中，无菌条件下挑取活化培养后的地衣芽孢杆菌菌落接到灭过菌的种子扩大培养基摇瓶中，培养温度为35～40℃，例如可为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，pH为6.5-7.5，震荡培养，转速为150～200r/min，例如可为150r/min、160r/min、170r/min、180r/min、190r/min、200r/min等，培养7小时左右，至摇瓶内培养液出现一定量的浑浊时完成培养。

所述种子扩大培养基包括以下组分：葡萄糖20～40g/L，酵母膏20～35g/L，硫酸锰0.25～0.5g/L，氯化钙0.5～10g/L，磷酸铵2.5～10g/L，碳酸氢钠0.5～1g/L，硫酸镁2～5g/L，PPG1～2滴/L。

具体的，所述葡萄糖可为20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L等。

所述酵母膏可为20g/L、25g/L、30g/L、35g/L等。

所述硫酸锰可为0.25g/L、0.27g/L、0.3g/L、0.35g/L、0.37g/L、0.4g/L、0.45g/L、0.5g/L等。

所述氯化钙可为0.5g/L、0.7g/L、0.8g/L、1.0g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L等。

所述磷酸铵可为2.5g/L、3g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L等。

所述碳酸氢钠可为0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L等。

所述硫酸镁可为2g/L、2.5g/L、3g/L、4g/L、5g/L等。

所述种子扩大培养基的配制方法是将葡萄糖、酵母膏、硫酸锰、氯化钙、磷酸铵、碳酸氢钠、硫酸镁加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至6.5-7.5，然后再加入PPG 1-2滴/瓶；115℃灭菌30min。

具体的，所述葡萄糖可为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、28g/L、30g/L、35g/L、40g/L、50g/L、70g/L、90g/L等。

所述酵母膏可为3g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、40g/L、50g/L等。

所述豆粕粉可为30g/L、50g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、100g/L、120g/L等。

所述硫酸锰可为0.05g/L、0.1g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L等。

所述氯化钙可为0.3g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、5g/L、6g/L、8g/L、10g/L、15g/L等。

所述磷酸铵可为10g/L、15g/L、17g/L、18g/L、20g/L、22g/L、23g/L、25g/L、30g/L等。

所述碳酸氢钠可为3g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、15g/L等。

所述硫酸镁可为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、15g/L等。

所述玉米浆可为3g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、15g/L等。

所述PPG可为0.3g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、4g/L、5g/L、8g/L等。

优选的，所述步骤d中，所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖25～50g/L，酵母膏10～25g/L，豆粕粉60～80g/L，硫酸锰0.25～0.5g/L，氯化钙0.5～10g/L，磷酸铵15～25g/L，碳酸氢钠5～10g/L，硫酸镁1～10g/L，玉米浆5～10g/L，PPG0.5～4g/L。配制时pH自然。

上述，进行液体深层发酵时的发酵温度为35～40℃，例如可为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，发酵时进行搅拌，搅拌转速为300～600r/min，例如可为300r/min、350r/min、400r/min、450r/min、500r/min、550r/min、600r/min等，通气量为1.0～2.5m³/h，例如可为1.0m³/h、1.5m³/h、2m³/h、2.5m³/h等。

作为一种具体实施方式，在发酵罐中装入发酵培养基，121℃灭菌30min结束后，降温至37℃，接入扩大培养后的地衣芽孢杆菌菌落，采取pH自然、37℃恒温发酵；发酵初始氧气通气量1.0m³/h，搅拌转速200rpm/min；溶氧低于70％开始升风升转，直至发酵条件最大氧气通气量2.5m³/h，搅拌转速600rpm/min；

液体深层发酵终止条件：镜检有70％左右芽孢，放罐前两次测定活力上升缓慢。

上述，通过将地衣芽孢杆菌菌种接入第一培养基进行分离培养—第二培养基进行种子培养—活化培养基进行活化培养—种子扩大培养基进行扩大培养—发酵培养基中进行液体深层发酵得到碱性蛋白酶，通过该生产方法可以大量提高碱性蛋白酶的表达量，且获得的碱性蛋白酶活性高。

通过对各培养基成分、发酵条件优化，使得从发酵培养基中可以获得高活力的碱性蛋白酶。

在发酵培养基中加入一定量的不同的氮源物质供菌体不同时期生长所需，在发酵前期菌体利用易于吸收的氮源物质酵母膏进行快速增殖，当生物量积累到一定量后酵母膏利用完，迫使菌体分泌碱性蛋白酶降解豆粕粉释放氮源物质以供生长，从而达到获得大量碱性蛋白酶的目的。

在发酵培养基中还采用一定量的葡萄糖作为碳源物质，既不会让发酵液太过粘稠而降低溶氧条件，又使菌体能够维持一个较长的产酶稳定期。

实施例1

一种碱性蛋白酶的生产方法，包括以下步骤：

步骤a.将地衣芽孢杆菌菌种接入第一培养基进行培养分离，得到单菌落后在第二培养基中进行种子培养后进行保藏，保藏方式为在第二培养基中加入重量百分比为20％的甘油得到混合溶液，在每根甘油管中接入所述混合溶液1.5ml，置于-50～-80℃冷藏。

所述第一培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，牛肉浸提物10g/L，葡萄糖20g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉5g/L。配制的pH自然。

所述第二培养基包括以下组分：葡萄糖20g/L，酵母膏20g/L，磷酸铵3.5g/L，碳酸氢钠1g/L，氯化钙3g/L，硫酸镁4g/L，PPG2滴/L。

步骤b.将保藏的地衣芽孢杆菌菌落划线接入活化培养基中进行活化培养，37℃培养24小时左右，至斜面长出清晰的地衣芽孢杆菌菌落；

所述活化培养基包括以下组分:葡萄糖20g/L，酵母膏20g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钙5g/L，磷酸铵5g/L，碳酸氢钠0.8g/L，硫酸镁3.5g/L，琼脂粉8g/L。

步骤c.将活化培养后的地衣芽孢杆菌菌落接入到种子扩大培养基中摇瓶中进行扩大培养，培养温度为37℃，pH为7，震荡培养，转速为200r/min，培养7小时左右，至摇瓶内培养液出现一定量的浑浊；

所述种子扩大培养基包括以下组分：葡萄糖30g/L，酵母膏30g/L，硫酸锰0.3g/L，氯化钙5g/L，磷酸铵5g/L，碳酸氢钠1g/L，硫酸镁3.5g/L，PPG2滴/L。

步骤d.将扩大培养后的地衣芽孢杆菌菌落接入发酵培养基中进行液体深层发酵，得到含碱性蛋白酶的发酵液。具体为在30L发酵罐中装入18L发酵培养基，121℃灭菌30min结束后，降温至37℃，接入扩大培养后的地衣芽孢杆菌菌落，采取pH自然、37℃恒温发酵；发酵初始氧气通气量1.0m³/h，搅拌转速200rpm/min；溶氧低于70％开始升风升转，直至发酵条件最大氧气通气量2.5m³/h，搅拌转速600rpm/min；

所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖35g/L，酵母膏20g/L，豆粕粉70g/L，硫酸锰0.3g/L，氯化钙7g/L，磷酸铵20g/L，碳酸氢钠8g/L，硫酸镁5g/L，玉米浆8g/L，PPG2g/L。

发酵终止条件：镜检有70％左右芽孢，放罐前两次测定活力上升缓慢。采用该工艺连续发酵三批。

发酵过程中每8h取发酵液样，发酵至72h放罐，离心取上清进行酶活检测并取平均值，酶活检测采用《中华人民共和国轻工业标准》QB/T1805.3-93工业酶制剂通用实验方法，即福林(Folin)法。检测结果如表1。

实施例2

将实施例1中的步骤d的发酵培养基成分变化如下：葡萄糖25g/L，酵母膏10g/L，豆粕粉60g/L，硫酸锰0.25g/L，氯化钙0.5g/L，磷酸铵15g/L，碳酸氢钠5g/L，硫酸镁1g/L，玉米浆5g/L，PPG0.5g/L。其他步骤与实施例1相同。

实施例3

将实施例1中的步骤d的发酵培养基成分变化如下：葡萄糖50g/L，酵母膏25g/L，豆粕粉80g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钙10g/L，磷酸铵25g/L，碳酸氢钠10g/L，硫酸镁10g/L，玉米浆10g/L，PPG4g/L。其他步骤与实施例1相同。

实施例4

将实施例1中的步骤d的发酵培养基成分变化如下：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，豆粕粉50g/L，硫酸锰0.2g/L，氯化钙0.3g/L，磷酸铵10g/L，碳酸氢钠3g/L，硫酸镁0.5g/L，玉米浆3g/L，PPG 0.3g/L。其他步骤与实施例1相同。

实施例5

将实施例1中的步骤d的发酵培养基成分变化如下：葡萄糖90g/L，酵母膏50g/L，豆粕粉120g/L，硫酸锰2g/L，氯化钙15g/L，磷酸铵30g/L，碳酸氢钠15g/L，硫酸镁15g/L，玉米浆15g/L，PPG8g/L。其他步骤与实施例1相同。

对比例1

将实施例1中的步骤d的发酵培养基成分变化如下：葡萄糖35g/L，酵母膏20g/L，硫酸锰0.3g/L，氯化钙0.7g/L，磷酸铵20g/L，碳酸氢钠8g/L，硫酸镁5g/L，玉米浆8g/L，PPG2g/L。其他步骤与实施例1相同。

对比例2

将实施例1中的步骤d的发酵培养基成分变化如下：葡萄糖35g/L，豆粕粉70g/L，硫酸锰0.3g/L，氯化钙0.7g/L，磷酸铵20g/L，碳酸氢钠8g/L，硫酸镁5g/L，玉米浆8g/L，PPG2g/L。其他步骤与实施例1相同。

对比例3

将实施例1中的步骤d的发酵培养基成分变化如下：酵母膏20g/L，豆粕粉70g/L，硫酸锰0.3g/L，氯化钙0.7g/L，磷酸铵20g/L，碳酸氢钠8g/L，硫酸镁5g/L，玉米浆8g/L，PPG2g/L。其他步骤与实施例1相同。

对比例4

将实施例1中的步骤b的活化培养基成分变化如下：葡萄糖5g/L，酵母膏40g/L，硫酸锰0.7g/L，氯化钙15g/L，磷酸铵15g/L，碳酸氢钠3g/L，硫酸镁7g/L，琼脂粉15g/L。其他步骤与实施例1相同。

表1.酶活检测结果

由表1结果可知，本发明的碱性蛋白酶生产方法相对于对比例1～4生产的碱性蛋白酶酶活力高，本发明通过对各培养基成分、发酵条件优化，在该工艺调控下，24h后碱性蛋白酶大量合成，到达56h后产酶速率变慢，从发酵培养基中可以获得高活力的碱性蛋白酶。由于本发明中所涉及的各工艺参数的数值范围在上述实施例中不可能全部体现，但本领域的技术人员完全可以想象到只要落入上述该数值范围内的任何数值均可实施本发明，当然也包括若干项数值范围内具体值的任意组合。此处，出于篇幅的考虑，省略了给出某一项或多项数值范围内具体值的实施例，此不应当视为本发明的技术方案的公开不充分。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式选择等，落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，所述步骤a中，所述第一培养基包括以下组分：蛋白胨5～15g/L，牛肉浸提物3～10g/L，葡萄糖10～25g/L，氯化钠0.1～10g/L，琼脂粉5～10g/L。

3.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，所述步骤a中，所述第二培养基包括以下组分：葡萄糖15～35g/L，酵母膏10～25g/L，磷酸铵2.5～5g/L，碳酸氢钠0.5～1g/L，氯化钙0.3～5g/L，硫酸镁2～5g/L，PPG1～2滴/L。

4.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，所述步骤b中，所述活化培养基包括以下组分:葡萄糖10～35g/L，酵母膏10～25g/L，硫酸锰0.25～0.5g/L，氯化钙0.5～10g/L，磷酸铵2.5～10g/L，碳酸氢钠0.5～1g/L，硫酸镁2～5g/L，琼脂粉5～10g/L。

5.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，所述步骤c中，所述种子扩大培养基包括以下组分：葡萄糖20～40g/L，酵母膏20～35g/L，硫酸锰0.25～0.5g/L，氯化钙0.5～10g/L，磷酸铵2.5～10g/L，碳酸氢钠0.5～1g/L，硫酸镁2～5g/L，PPG1～2滴/L。

6.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，所述步骤d中，所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖25～50g/L，酵母膏10～25g/L，豆粕粉60～80g/L，硫酸锰0.25～0.5g/L，氯化钙0.5～10g/L，磷酸铵15～25g/L，碳酸氢钠5～10g/L，硫酸镁1～10g/L，玉米浆5～10g/L，PPG0.5～4g/L。

7.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，所述步骤a中，所述单菌落在第二培养基中进行种子培养后进行保藏，所述保藏的方式为：在第二培养基中加入重量百分比为10～30％的甘油得到混合溶液，在每根甘油管中接入所述混合溶液1.5ml，置于-50～-80℃冷藏。

8.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，所述步骤b中，进行活化培养时的培养温度为35～40℃，pH为6.5-7.5，震荡培养，转速为150～200r/min。

9.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，所述步骤c中，进行扩大培养时的培养温度为35～40℃，pH为6.5-7.5，震荡培养，转速为150～200r/min。

10.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶的生产方法，其特征在于，所述步骤d中，进行液体深层发酵时的发酵温度为35～40℃，发酵时进行搅拌，搅拌转速为300～600r/min，氧气通气量为1.0～2.5m³/h。