CN101260392A - 一种用五倍子生料固体发酵生产单宁酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用五倍子生料经固体发酵生产单宁酶的方法，以重量比为5∶95～35∶65的五倍子粉和麸皮的混合物为培养基，加入混合物重量的0.6～2.1倍无机盐溶液混合均匀，生料直接接种黑曲霉孢子悬液，于28～35℃静置培养24～168小时后，用柠檬酸缓冲液提取得到单宁酶粗酶液。该方法以五倍子粉和麸皮为原料，其中五倍子粉为产单宁酶的诱导物，根据中国特产五倍子经高压蒸汽灭菌易焦化的特性，不经高压蒸汽灭菌处理，采用生料直接接种黑曲霉固体发酵生产单宁酶。避免了高温对原料的破坏，简化了设备和生产流程，提高了生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及单宁酶的生产方法，特别是涉及一种用五倍子生料经固体发酵生产单宁酶的方法。
背景技术
单宁酶(Tannase EC1.1.20)，又称单宁酯酰水解酶，能水解没食子单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。单宁酶是一种诱导酶，能由某些微生物在单宁酸等诱导物存在时诱导合成，黑曲霉和米曲酶是典型代表。单宁酶分布广、用途多。美国食品与药物管理局(FDA)已确定单宁酶为安全产品，在日本单宁酶也通过批准应用于食品工业。但目前单宁酶生产效率低，市场价格昂贵，在各个行业中的应用受到限制。中国特产五倍子是生产单宁酶的诱导物，可开发资源丰富，单宁酶在中国的应用前景十分广阔，因此对单宁酶发酵生产的研究变得十分迫切。
目前国内主要采用纯单宁酸或五倍子浸提液液体发酵生产单宁酶。但据研究，液体发酵产生的单宁酶主要是胞内酶，细胞破壁不容易，得率低，且液体发酵生产单宁酶酶活普遍不高。国外近期的研究主要集中在用含单宁酸的原料灭菌后固体发酵生产单宁酶。研究发现固体发酵主要产胞外单宁酶，容易提取，而且稳定性好，杂酶少，且设备比较简单，同时固体发酵有利于提高酶活和底物的生物转化率。固体发酵法具有液体发酵法不可比拟的优越性，但目前固体发酵生产单宁酶的效率仍不高，其一般酶活只有14U/克干重，且市场价格昂贵，阻碍了单宁酶的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是提供一种容易提取，稳定性好，杂酶少，酶活性高，且设备比较简单的生产单宁酶的方法。该方法利用中国特产五倍子具有的抗菌特性和选育的菌株的可利用生料的特性，避免了高温灭菌对诱导物五倍子的破坏，简化了设备和生产流程，且大幅度的提高了生产单宁酶的酶活，从而提高了单宁酶的生产效率，具有很大的研究意义和实用性。这种用五倍子生料经固体发酵生产单宁酶的方法是由创造性的实验而发明的。实验发现五倍子粉和麸皮的混合原料中固态的五倍子粉经高压蒸汽灭菌很容易焦化，变成褐色，粘稠。高温破坏了五倍子的性质，对黑曲霉菌株的生长产生危害，严重影响单宁酶的生产效率。尤其当培养基中五倍子含量较大时，高压蒸汽灭菌对培养基的破坏更明显，黑曲霉菌株完全不能生长。而原料未经高压蒸汽灭菌时培养基没被破环，黑曲霉生长旺盛，且无杂菌的生长痕迹。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
固体发酵的基础培养条件：发酵用培养基为五倍子粉和麸皮的混合物，其中五倍子粉和麸皮重量比为5∶95～35∶65，混合物用0.6～2.1倍的无机盐溶液混合均匀，生料直接接种黑曲霉孢子(Asp.niger Spore)悬液，于28～35℃静置培养24～168小时后，用pH＝5.0的柠檬酸缓冲液提取得到单宁酶粗酶液。
原料五倍子的量在混合物中的重量分数为5～35份，五倍子粉和麸皮不经过高压蒸气灭菌，培养基配好后直接接种黑曲霉孢子悬液发酵培养，即生料发酵。
用中国特产五倍子粉作为产单宁酶的诱导物，诱导物五倍子粉由五倍子经粉碎机粉碎后过40目筛。
原料无机盐溶液按照以下比例配制：以重量比为1份NH4NO3+0.1份MgSO4·7H2O+0.1份NaCl+30～100份蒸馏水，与50份的五倍子和麸皮混合物均匀混合。
黑曲霉孢子悬液，其黑曲霉由贵州省发酵工程与生物制药重点实验室用黑曲霉原始菌株经紫外诱变而来，发酵试验菌株为B-0201，将试验菌株在马铃薯培养基液体培养，按照常规方法制备黑曲霉孢子悬液，其浓度为1.0×109～10×109个/毫升，其添加量为5～10份。
培养温度为30℃～33℃。
培养时间72～120小时。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1.本发明通过利用五倍子生料固体发酵生产单宁酶，避免了高温灭菌对五倍子的破坏，适合五倍子的特性，且大幅度的提高了生产单宁酶的酶活，为单宁酶的发酵生产提供了一种实用性很强的方法，提供了单宁酶生产的一个新方法。
2.本发明在国内外现有基础上大幅度的提高了单宁酶的生产效率，而且培养基不需要经高压蒸汽灭菌，少了灭菌工艺，简化了设备和生产流程，降低了单宁酶的生产成本，提高了经济效益。
3.本发明为我国特产五倍子开发利用提供了一种实用的方法。扩大了五倍子的利用范围，促进了五倍子种植业的发展。
具体实施方式
实施例1：诱导物五倍子粉由五倍子经粉碎机粉碎后过40目筛。称取5g五倍子粉和麸皮的混合物置于250ml三角瓶中，混合物中五倍子粉含量为5份，然后加入无机盐溶液(1份NH4NO3+0.1份MgSO4·7H2O+0.1份NaCl)5ml，使发酵底物混合均匀，不经高压蒸汽灭菌直接接种按重量份计的10份黑曲霉孢子悬液，黑曲霉孢子悬液浓度为1.0×109～10×109个/毫升，30℃静置培养96小时。取出培养96小时的三角瓶，在三角瓶中加入50mlpH＝5.0的柠檬酸缓冲液，180r/min振荡浸提1h，用定性滤纸过滤即得单宁酶粗酶液，其单宁酶的活力可高达为38.3U/克干重，是一般固体发酵酶活2.74倍(将30℃条件下每分钟产生1微摩尔没食子酸所需的酶量定义为一个酶活单位)。
实施例2：诱导物五倍子粉由五倍子经粉碎机粉碎后过40目筛。称取5g五倍子粉和麸皮的混合物置于250ml三角瓶中，混合物中五倍子粉含量为20份，然后加入无机盐溶液(1份NH4NO3+0.1份MgSO4·7H2O+0.1份NaCl)5ml，使发酵底物混合均匀，用加酸液或加碱液调节培养基的pH值6，不经高压蒸汽灭菌直接接种按重量份计的5份黑曲霉孢子悬液，黑曲霉孢子悬液浓度为1.0×109～10×109个/毫升，30℃静置培养120小时。取出培养120小时的三角瓶，在三角瓶中加入50mlpH为5.0的柠檬酸缓冲液，180r/min振荡浸提1h，用定性滤纸过滤即得单宁酶粗酶液，其单宁酶的活力可高达为38.3U/克干重，是一般固体发酵酶活2.74倍。
Claims (9)
1. 一种用五倍子生料经固体发酵生产单宁酶的方法，其特征在于：以重量比为5∶95～35∶65的五倍子粉和麸皮的混合物为培养基，加入混合物重量的0.6～2.1倍无机盐溶液混合均匀，生料直接接种黑曲霉孢子悬液，于28～35℃静置培养24～168小时后，用柠檬酸缓冲液提取得到单宁酶粗酶液。
2. 根据权利要求1所述的用五倍子生料经固体发酵生产单宁酶的方法，其特征在于：五倍子经粉碎后过40目筛得五倍子粉。
3. 根据权利要求1所述的用五倍子生料经固体发酵生产单宁酶的方法，其特征在于：无机盐溶液的配制组成及重量比例为：1份NH4NO3+0.1份MgSO4·7H2O+0.1份NaCl+30～100份蒸馏水。
4. 根据权利要求1或3所述的用五倍子生料经固体发酵生产单宁酶的方法，其特征在于：31.2～101.2份无机盐溶液与50份的五倍子粉和麸皮混合物均匀混合。
5. 根据权利要求1所述的用五倍子生料经固体发酵生产单宁酶的方法，其特征在于：黑曲霉孢子悬液所用的发酵试验菌株为B-0201，用马铃薯培养基液体按照常规方法培养制备的。
6. 根据权利要求1所述的用五倍子生料经固体发酵生产单宁酶的方法，其特征在于：所述的黑曲霉孢子悬液浓度为1.0×109～10×109个/毫升，其添加量为5～10份。
7. 根据权利要求1所述的用五倍子生料经固体发酵生产单宁酶的方法，其特征在于：所述培养温度为30℃～33℃。
8. 根据权利要求1所述的用五倍子生料经固体发酵生产单宁酶的方法，其特征在于：所述培养时间72～120小时。
9. 根据权利要求1所述的用五倍子生料经固体发酵生产单宁酶的方法，其特征在于：所用柠檬酸缓冲液的pH＝5.0。
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