CN104195121A - 一种木薯叶固体培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种木薯叶固体培养基及其制备方法和在单宁酶发酵生产中的应用。该培养基由木薯叶和培养基辅料构成；所述培养基的制备方法包括木薯叶预处理、培养基辅料的配制和混匀三个步骤；将所述培养基用于单宁酶的发酵生产，可获得高活性的单宁酶。本发明提供的培养基来源广泛，廉价易得，为木薯叶的综合有效利用提供新的途径。

Description

一种木薯叶固体培养基及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种木薯叶固体培养基、其制备方法和该培养基在单宁酶发酵生产中的应用。
背景技术
木薯是一种热带作物，我国华南地区广泛栽培，其中以广西、广东和海南栽培最多。目前对木薯叶的利用主要是利用其根部制备木薯淀粉、酒精和葡萄糖等。同时，由于木薯根富含淀粉，世界上约有5亿人把它作为主食。木薯叶含有丰富的营养物质和生物活性物质，如含有丰富的蛋白质、粗纤维、维生素、氨基酸和β-胡萝卜素等，其可以改善热带地区居民的食品营养结构，但是人们对叶的食用远不如对根的食用普遍，其原因在于木薯叶中还含有氢氰酸，一种剧毒成分。此外，木薯叶在其他方面的应用很少，造成了资源的浪费。因此，有必要开发出一些木薯叶综合利用的有效途径。
单宁酶，也称单宁酰基水解酶，能水解单宁中的酯键和缩酚羧键生成没食子酸、葡萄糖及相应醇类等化合物。该酶是一种诱导酶，由某些微生物在单宁酸等诱导物存在的条件下诱导产生。单宁酶广泛应用于制革、酿酒、医药、饮料等领域。目前，单宁酶的发酵生产主要包括液体发酵和固体发酵两种，而后者是在一定的固体基质上进行的，以此方式生产的单宁酶更易提取，且酶的稳定性更好。
迄今为止，单宁酶固体发酵所使用的固体基质包括麸皮、罗望子粉、棕榈粕、阎浮树叶、肉荚云实和茶梗等，但未见有木薯叶用于单宁酶固体发酵的报道。
发明内容
本发明的内容是一种木薯叶固体培养基，及其制备方法和该培养基在单宁酶固体发酵中的应用。本发明提供的技术方案为：
一种木薯叶固体培养基，其特征在于，所述木薯叶固体培养基由木薯叶和培养基辅料组成，木薯叶与培养基辅料的质量比为1:0.5～1:3，按重量百分比培养基辅料包括以下组分：碳源1～5％，氮源0.1～0.7％，无机盐0.11～0.5％，余量为蒸馏水。
作为最佳优选，所述木薯叶与所述培养基辅料的质量比为1:1。
作为最佳优选，所述木薯叶与所述培养基辅料的质量比为1:1.5。
所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖、可溶性淀粉或甘油中的一种或多种；
所述氮源为硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸氢二铵、尿素、牛肉膏、酵母膏和蛋白胨中的一种或多种；
所述无机盐为氯化钾、氯化钠、七水合硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、七水合硫酸亚铁和七水合硫酸锌中的一种或多种。
作为最佳优选，上述培养基辅料中的组分及重量百分含量为：
碳源：葡萄糖3％；
氮源：磷酸氢二铵0.6％；
无机盐：氯化钾0.05％，七水合硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.15％，七水合硫酸亚铁0.02％；
余量为蒸馏水。
本发明还公开了该木薯叶固体培养基的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)木薯叶预处理：将新鲜木薯叶烘干后捣碎、过筛，取粒度为3～5mm的木薯叶；
(2)培养基辅料的配制：称取碳源、氮源和无机盐溶于蒸馏水，调pH为3.0～7.0；
(3)混匀：将步骤(1)所得木薯叶与步骤(2)所得培养基辅料充分混合，即得所述培养基。
本发明还公开了一种用于单宁酶发酵生产的培养基，其特征在于，由木薯叶和培养基辅料构成，木薯叶与培养基辅料的质量比为1:0.5～1:3，按重量百分比培养基辅料包括以下组分：碳源1～5％，氮源0.1～0.7％，无机盐0.11～0.5％，单宁酸(作为诱导物)1％～10％，余量为蒸馏水。
作为优选，所述单宁酸的质量百分含量为2％～5％。
作为优选，所述单宁酸的质量百分含量为4％。
本发明的进步效果：
本发明提供一种以木薯叶为固体基质的培养基，为木薯叶的有效利用提供新途径，所用木薯叶廉价易得，所发明的培养基制备简单，价格低廉，使用该培养基进行发酵生产可获得高活性的单宁酶。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1：木薯叶培养基的制备
新鲜木薯叶置于60℃烘箱中2天烘干后，经组织捣碎机捣碎后过筛，取粒度为3～5mm的木薯叶。培养基辅料组分为蔗糖3％、硝酸铵0.3％、氯化钾0.052％和七水合硫酸镁0.052％，余量为蒸馏水，调节pH为5.5。
将以上处理所得的木薯叶与培养基辅料按1:1的比例充分混合，即得到木薯叶培养基，该培养基的成本如下表1。
表1木薯叶培养基成本核算
组分 含量(％) 投料量(kg/吨) 单价(元/吨) 成本(元/吨)
木薯叶 50 500 0.00 0.00
蔗糖 1.5 15 1200 18.00
硝酸铵 0.15 1.5 1500 2.25
氯化钾 0.026 0.26 2100 54.00
七水合硫酸镁 0.026 0.26 2000 52.00
蒸馏水 补足至100 517.02 1000 517.02
总计 100 1000 —— 643.27
注：木薯叶为木薯采收后废弃物，变废为宝，成本不计。
实施例2：木薯叶培养基用于固体发酵生产单宁酶
单宁酶的固体发酵的步骤为：
(1)培养基配制：新鲜木薯叶置于80℃烘箱中2天烘干后，经组织捣碎机捣碎后过筛，取粒度为3～5mm的木薯叶。称取6g木薯叶于三角瓶中，按1:1.5的比例添加盐溶液，培养基辅料组分为葡萄糖3％、单宁酸4％、磷酸二氢铵0.6％、氯化钾0.05％、磷酸氢二钾0.15％、七水合硫酸镁0.05％和七水合硫酸亚铁0.02％，余量为蒸馏水，pH为5.0；
(2)灭菌：上述的木薯叶培养基于121℃下灭菌20min，冷却；
(3)接种：向培养基中接入AspergillusficuumGim3.6孢子悬液，孢子浓度为1.5×109个孢子/mL，接种量为20％(v/v)；
(4)培养：置于32℃下恒温培养60h；
(5)酶的提取：向含单宁酶的培养基中加入10倍体积的蒸馏水，在25℃下震荡2h，抽滤，滤液于4℃、12000×g下离心15min，收集上清液即得单宁酶粗酶。
经过以上步骤获得的单宁酶酶活力为73.0U/gds(每克干固体基质)，酶比活力为18.91U/mg，而常规培养基获得的单宁酶酶活力为35.0U/gds。
实施例3：木薯叶培养基用于固体发酵生产单宁酶
(1)培养基配制：新鲜木薯叶置于60℃烘箱中3天烘干后，经组织捣碎机捣碎后过筛，取粒度为3～5mm的木薯叶。称取5g木薯叶于三角瓶中，按1:1的比例添加培养基辅料，培养基辅料组分为蔗糖2％、单宁酸5％、硝酸钠0.3％、氯化钾0.05％、磷酸二氢钾0.1％、七水合硫酸镁0.05％，余量为蒸馏水，pH为6.0；
(2)灭菌：上述的木薯叶培养基于121℃下灭菌20min，冷却；
(3)接种：向培养基中接入AspergillusficuumGim3.6孢子悬液，孢子浓度为1.5×109个孢子/mL，接种量为15％(v/v)；
(4)培养：置于30℃下恒温培养72h；
(5)酶的提取：向含单宁酶的培养基中加入10倍体积的蒸馏水，在25℃下震荡2h，抽滤，滤液于4℃、10000×g下离心20min，收集上清液即得单宁酶粗酶。
经过以上步骤获得的单宁酶酶活力为60.83U/gds(每克干固体基质)，酶比活力为16.71U/mg，而常规培养基获得的单宁酶酶活力为35.0U/gds。
以上实施例中所述的产单宁酶产生菌为无花果曲霉(Aspergillusficuum)，编号为Gim3.6，购于广东微生物菌种保藏中心；木薯叶采摘自广西大学农学院田间。
单宁酶酶活力测定方法参照《精细化工》2008年第6期《一种胞外单宁酶的活力检测方法》，酶活力定义为：在30℃、pH5.0条件下，每分钟催化底物产生0.1微摩尔没食子酸所需的酶量为1U。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (9)

1.一种木薯叶固体培养基，其特征在于，所述木薯叶固体培养基由木薯叶和培养基辅料组成，木薯叶与培养基辅料的质量比为1:0.5～1:3，按重量百分比培养基辅料包括以下组分：碳源1～5％，氮源0.1～0.7％，无机盐0.11～0.5％，余量为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的一种木薯叶固体培养基，其特征在于：所述木薯叶与所述培养基辅料的质量比为1:1。
3.根据权利要求1所述的一种木薯叶固体培养基，其特征在于：所述木薯叶与所述培养基辅料的质量比为1:1.5。
4.根据权利要求1所述的一种木薯叶固体培养基，其特征在于：所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖、可溶性淀粉或甘油中的一种或多种；所述氮源为硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸氢二铵、尿素、牛肉膏、酵母膏和蛋白胨中的一种或多种；所述无机盐为氯化钾、氯化钠、七水合硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、七水合硫酸亚铁和七水合硫酸锌中的一种或多种。
5.根据权利要求1-3任一所述的一种木薯叶固体培养基，其特征在于，所述培养基辅料中的组分及重量百分含量为：
碳源：葡萄糖3％；
氮源：磷酸氢二铵0.6％；
无机盐：氯化钾0.05％，七水合硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.15％，七水合硫酸亚铁0.02％；
余量为蒸馏水。
6.如权利要求1所述的木薯叶固体培养基的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)木薯叶预处理：将新鲜木薯叶烘干后捣碎、过筛，取粒度为3～5mm的木薯叶；
(2)培养基辅料的配制：称取碳源、氮源和无机盐溶于蒸馏水，调pH为3.0～7.0；
(3)混匀：将步骤(1)所得木薯叶与步骤(2)所得培养基辅料充分混合，即得所述培养基。
7.一种用于单宁酶发酵生产的培养基，其特征在于，由木薯叶和培养基辅料构成，木薯叶与培养基辅料的质量比为1:0.5～1:3，按重量百分比培养基辅料包括以下组分：碳源1～5％，氮源0.1～0.7％，无机盐0.11～0.5％，单宁酸1％～10％，余量为蒸馏水。
8.根据权利要求8所述培养基，其特征在于，所述单宁酸的质量百分含量为2％～5％。
9.根据权利要求8所述培养基，其特征在于，所述单宁酸的质量百分含量为4％。
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