CN115197977A - 一种利用功能互补的真菌-细菌混菌体系实现木质纤维素合成乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用功能互补的真菌‑细菌混菌体系实现木质纤维素合成乳酸的方法，包括以下步骤：（1）将活化的棘孢木霉接种到含有微晶纤维素的发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；（2）将活化的副干酪乳杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中，厌氧发酵生产乳酸。当棘孢木霉培养了40 h时接入副干酪乳杆菌，乳酸产量最高，达到57.59 g/L，该方法是目前利用微晶纤维素为唯一碳源时混菌发酵得到的最高乳酸产量，同时，该方法还可以应用到直接以木质纤维素为原料合成乳酸的发酵过程中，在以玉米芯为底物的发酵培养基中进行发酵，可产生9.80 g/L的乳酸，极大降低了工业生产乳酸的底物成本，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用功能互补的真菌-细菌混菌体系实现木质纤维素合成乳酸的方法。
背景技术
乳酸是三大有机酸之一，已广泛应用于酿酒、医药、食品、化妆品、卷烟、制革等领域。此外，乳酸还是一种重要的生物基平台化合物，可作为生产原料制造其他化学品，如聚乳酸、丙烯酸、丙酸、2，3-戊二酮、丙酮酸、丙烯、乳酸酯（绿色环保溶剂）、乳酸盐等，具有广阔的应用前景。
其工业生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法，前者采用的原料主要为乙醛和氰化氢，经反应制得乳腈后进行H2SO4水解生成乳酸，后者主要以葡萄糖、蔗糖等为基质，用微生物发酵的方法制取乳酸。化学合成法生产成本高、环境污染严重且较难合成单一构型的乳酸，微生物发酵法生产乳酸不仅可以克服上述弊端，还具有如下优势：①发酵条件温和、成本较低、过程清洁、效率高；②通过选择适宜的菌种和底物，在一定的发酵条件下可得到特定的旋光异构体。因此，微生物发酵产乳酸的研究越来越受到关注。
在众多产乳酸的微生物中，副干酪乳杆菌是目前最具发展前景的生产菌种之一。但目前微生物发酵法合成乳酸的生产成本偏高，影响了其产业化的进程。采用廉价或废弃的非粮生物质资源替代葡萄糖进行乳酸合成，不仅是对废弃的生物质资源再利用，而且可以有效降低乳酸生产原料成本，对促进乳酸生物发酵法生产具有重要的意义。
木质纤维素类生物质是继煤炭、石油、天然气等化石能源之后最重要的可应用能源之一，被认为世界第四大能源。随着开采型不可再生资源的日趋枯竭，木质纤维素类生物质原料的资源优势愈发显现。棘孢木霉是可以直接利用木质纤维素为碳源进行生长发酵的丝状真菌。棘孢木霉能够在发酵1~2天内迅速的生长，并分泌大量纤维素酶、半纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，可以高效降解未经任何化学或生物处理的玉米芯等木质纤维素类原料，在木质纤维素降解方面有着极高的应用价值。
混菌发酵是指采用两种或多种微生物的协同作用共同完成某发酵过程的一种新型发酵技术，可通过菌株间的“劳动分工”实现复杂代谢任务。目前对于具有合作关系的菌株筛选和组合还是一个随机的过程，缺乏有效的理论指导，而且对于已经应用的混菌培养体系也不能有效地协调菌株间的关系，使其达到最佳生态水平，发挥最大效应，这严重阻碍了混菌发酵的发展和应用。通过“师法自然”策略，从自然界中筛选可以直接利用木质纤维素合成乳酸的天然菌群，并通过对其中核心功能菌株的筛选，构建跨种属的功能互补混菌发酵体系，有助于提升菌群间的有效合作，提高通过一体化生物加工过程利用木质纤维素类原料直接合成乳酸的合成效率。
发明内容
为了解决传统乳酸发酵方法以粮食或其他淀粉质副产品为原料生产成本过高的问题，本发明构建了功能互补的棘孢木霉和副干酪乳杆菌的真菌-细菌混菌体系，实现了直接利用木质纤维素类原料高效合成乳酸的目标。其中棘孢木霉可以分泌纤维素、半纤维水解酶系，高效地降解木质纤维素类原料；而副干酪乳杆菌不能利用纤维素等多糖类物质，但其可以利用积累的纤维二糖、葡萄糖等为碳源，在缓解纤维二糖等对纤维素水解酶的抑制作用的同时，还可以进行高效的乳酸合成。
本发明所述一种利用功能互补的真菌-细菌混菌体系实现木质纤维素合成乳酸的方法，包括以下步骤：
（1）将活化的棘孢木霉接种到含有微晶纤维素的发酵培养基中进行发酵，发酵24-120 h，得到发酵液；
（2）将活化的副干酪乳杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中，混菌发酵生产乳酸。
步骤（1）所述棘孢木霉发酵24-120 h时将步骤（2）活化的副干酪乳杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中，厌氧发酵生产乳酸。
优选地，步骤（1）所述发酵时间为24-96 h，更进一步地优选为发酵40小时，将活化的副干酪乳杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中，发酵液中有一定量葡萄糖，且纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的活性较高，能够持续降解微晶纤维素为葡萄糖，而副干酪乳杆菌可以利用降解得到的葡萄糖生产乳酸。接种时间过早（24 h），纤维素酶的酶活较低，不利用后续微晶纤维素的降解；接种时间过晚（棘孢木霉发酵72-120 h），则会导致棘孢木霉培养时间过长，纤维素酶和β-葡萄糖苷酶分泌量减少，酶系的酶活下降，且部分降解得到的葡萄糖也被棘孢木霉利用，从而减少了乳酸的碳流量，最终导致乳酸产量降低。因此，副干酪乳杆菌的接种时间是混菌发酵生产乳酸极为关键的步骤。
步骤（1）所述活化的棘孢木霉的接种量为发酵培养基体积的1-5%；所述含有微晶纤维素的发酵培养基配方为：0.1-0.5 g/L尿素，1.0-2.0 g/L (NH4)2SO4，1.0-3.0 g/LKH2PO4，0.1-0.6 g/L CaCl2，0.1-0.6 g/L MgSO4·7H2O，0.002-0.008 g/L FeSO4·7H2O，0.001-0.003 g/L MnSO4·H2O，0.001-0.003 g/L ZnSO4·7H2O，0.001-0.003 g/L CoCl2，40-120 g/L微晶纤维素，CaCO3 5 ~35g/L，溶剂为水，调节pH至5.0-6.0，121 ℃灭菌20 min；所述发酵条件为：发酵温度28-35 ℃，发酵时间为24-120 h，发酵pH为5.0-6.0，转速0-120rpm。
优选地，所述含有微晶纤维素的发酵培养基中微晶纤维素浓度为80 g/L。
优选地，步骤（1）所述发酵条件为：发酵温度30 ℃，发酵时间40 h，发酵pH为5.5，转速120 rpm。
所述棘孢木霉的活化培养基配方为0.1-0.5 g/L尿素，1.0-2.0 g/L (NH4)2SO4，1.0-3.0 g/L KH2PO4，0.1-0.6 g/L CaCl2，0.1-0.6 g/L MgSO4·7H2O，0.002-0.008 g/LFeSO4·7H2O，0.001-0.003 g/L MnSO4·H2O，0.001-0.003 g/L ZnSO4·7H2O，0.001-0.003g/L CoCl2，10-20 g/L葡萄糖，溶剂为水，调节pH至5.0-6.0；活化条件为：取0.5-1.0 mL棘孢木霉菌液涂覆于PDA培养基中于28-35 ℃培养72-120 h，用0.5-1.0 mL无菌水冲洗PDA固体培养基中的菌落，并接种于活化培养基，于28-35 ℃活化48-96 h；
步骤（2）所述活化的副干酪乳杆菌的接种方式如下：将活化的副干酪乳杆菌以1-10%的接种量接种到步骤（1）所述的发酵培养基中；所述发酵条件为：发酵温度35-39 ℃，发酵时间为24-384 h，发酵pH为5.0-6.0，转速为120-180 rpm。
优选地，步骤（2）所述发酵条件为：发酵温度37 ℃，发酵时间为336 h，发酵pH为5.0，转速为180 rpm。
所述步骤2）发酵时，培养基中添加5-35 g/L CaCO3，进一步优选为5~15 g/LCaCO3，棘孢木霉最适pH为5.5，副干酪乳杆菌最适pH为5.0，通过优化CaCO3浓度可以对混菌体系pH进行最优的调控。钙离子作为微量金属离子，一定程度上能够提高副干酪乳杆菌乳酸的生产，而棘孢木霉也能使用其降解微晶纤维素得到的葡萄糖，所以可通过提高钙离子浓度抑制棘孢木霉生长，使碳代谢流更多地流向乳酸的合成。
所述副干酪乳杆菌的活化培养基配方为：3.0-5.0 g/L酵母粉，5-10 g/L NaHCO3，5-10 g/L NaH2PO4·2H2O，10-20 g/L K2HPO4·3H2O，2.0-3.0 g/L玉米浆，5-40 g/L CaCO3，溶剂为水；活化条件如下：取0.5-1.0 mL副干酪乳杆菌菌液涂覆于MRS培养基中于35-39 ℃培养12-24 h；用0.5-1.0 mL无菌水冲洗MRS固体培养基中的菌落，并接种于活化培养基于35-39 ℃，120-180 rpm培养12-18 h。
其中，棘孢木霉（Trichoderma asperellum），菌株号为LYS1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211179，保藏日期为2021年9月15日。该菌株能够在发酵1~2天内迅速的生长，并分泌大量纤维素酶、半纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，其中β-葡萄糖苷酶酶活优于里氏木霉，能有效弥补目前商业菌株β-葡萄糖苷酶分泌不足的问题，高效降解微晶纤维素；而且基于较高的半纤维素酶分泌能力，该菌株还能高效降解未处理的玉米芯等木质纤维素类原料，在木质纤维素降解方面有着极高的应用价值。
其中，副干酪乳杆菌分类命名为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），菌株号为LYS2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20211178，保藏日期为2021年9月15日。该菌株具有转化率高、光学纯度高、产率高、副产物少等优点，在碳水化合物水解酶家族中发现该菌有β-葡萄糖苷酶水解酶基因，并经过验证发现其能够利用纤维二糖为碳源合成乳酸。
所述菌株副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）LYS2的筛选方法为：称取适量泡菜汤汁，用生理盐水稀释，吸取100 mL于MRS培养平板上， 28~37 ℃下培养3~4天。生长出的菌落划线纯化5代，从而筛选出能够生产乳酸的菌株副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）LYS2。菌株LYS2的菌落直径2~3 mm，菌落呈乳白色微凸圆形，表面光滑、边缘整齐。本发明的副干酪乳杆菌LYS2具有较强的乳酸合成能力，其利用葡萄糖合成乳酸的收率可高达1 g/g，在混合培养中具有显著的优势。
有益效果：与现有技术相比，本发明的技术优势如下：
（1）目前以木质纤维素为底物生产乳酸的报道都是利用酸解、碱解和酶解将木质纤维素进行水解，利用其水解液进行发酵，其成本高。本发明基于一体化生物加工过程的策略，通过混菌发酵的方式，利用菌株间的功能互补，从而实现直接利用微晶纤维素、玉米芯等木质纤维素类原料合成乳酸。首先接入降解木质纤维素的菌株棘孢木霉，待其分泌出足够的水解酶后，再接入副干酪乳杆菌，使其利用可发酵糖合成乳酸。
（2）当棘孢木霉培养了40 h时加入接种量为10% v/v的副干酪乳杆菌，乳酸产量最高，达到57.59 g/L，这也是目前利用微晶纤维素为唯一碳源时混菌发酵得到的最高乳酸产量。棘孢木霉培养40 h时，此时发酵液中纤维素酶的酶活较高，纤维素酶有效地降解了微晶纤维素；此后，在混菌体系中，纤维素酶和β-葡萄糖苷酶仍具有较高的酶活和较好的稳定性，能够源源不断降解微晶纤维素为葡萄糖，而副干酪乳杆菌可以利用降解得到的葡萄糖生产乳酸。
（3）该方法是一种利用真菌和细菌跨属构建的混菌体系。在人工混菌策略中，多种微生物是在同一发酵体系中进行的，因此微生物之间的生长条件必须极为相似，而之前的技术策略通常通过构建厌氧微生物菌群用于木质纤维素的生物转化，很少有将木质纤维素降解能力更强的好氧丝状真菌与厌氧发酵微生物整合于同一反应器中用于木质纤维素到高值化学品的生物转化。基于丝状真菌具有较强的木质纤维素降解能力，如里氏木霉等，故而创新地采用真菌-细菌的组合。然而由于里氏木霉中大多存在β-葡萄糖苷酶缺陷，导致纤维二糖的积累，从而产生对纤维素水解酶的反馈抑制，因此如何有效缓解纤维二糖的积累，解除对纤维素水解酶的反馈抑制成为混菌构建过程中的一大限制性因素。本发明中，首次选用棘孢木霉作为降解菌株，其具有优于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶酶活，可将微晶纤维素降解为纤维二糖和葡萄糖等；同时选用副干酪乳杆菌作为乳酸合成菌，虽然其不能直接利用微晶纤维素等多糖，但其可直接利用纤维二糖的能力，可进一步地有效缓解纤维二糖积累对纤维素水解酶的抑制，同时本发明的副干酪乳杆菌LYS2具有较强的乳酸合成能力，其利用葡萄糖合成乳酸的收率可高达1 g/g。本发明采用的混菌体系用于利用微晶纤维素合成乳酸的能力优于文献中已报道水平，如Shahab等报道的乳酸产量为34.7 g/L。因此，采用该组合有助于提高微晶纤维素合成乳酸的生产效率，可大大降低工业生产乳酸的成本，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为优化共培养体系中添加不同CaCO3浓度对乳酸产量的影响；
图2为优化共培养体系中不同副干酪乳杆菌接种时间对乳酸产量的影响；
图3为优化共培养体系中不同微晶纤维素浓度对乳酸产量的影响；
图4为不同微晶纤维素浓度和CaCO3浓度下对乳酸产量影响的三维图和等高线图；
图5为不同微晶纤维素浓度和副干酪乳杆菌接种时间下对乳酸产量影响的三维图和等高线图；
图6为不同副干酪乳杆菌接种时间和CaCO3浓度下对乳酸产量影响的三维图和等高线图；
图7为最优共培养发酵条件下乳酸的产量；
图8为优化共培养发酵条件下不同玉米芯浓度时乳酸的产量。
具体实施方式
棘孢木霉分类命名为棘孢木霉（Trichoderma asperellum），菌株号为LYS1。
副干酪乳杆菌分类命名为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），菌株号为LYS2，来自于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211178。
实施例1 混菌体系培养基中不同的CaCO3浓度对最终乳酸产量的影响
（1）取1 mL棘孢木霉菌液涂覆于PDA固体培养基（46 g/L马铃薯葡萄糖琼脂培养基，20 g/L琼脂）中于30 ℃培养120 h，用1 mL无菌水冲洗PDA固体培养基中的菌落，并接种于活化培养基，于30 ℃活化48 h，活化培养基配方为：0.3 g/L尿素，1.4 g/L (NH4)2SO4，2.0 g/L KH2PO4，0.3 g/L CaCl2，0.3 g/L MgSO4·7H2O，0.005 g/L FeSO4·7H2O，0.00156g/L MnSO4·H2O，0.0014 g/L ZnSO4·7H2O，0.002 g/L CoCl2，10 g/L葡萄糖，溶剂为水，调节pH至5.5；
（2）取1 mL副干酪乳杆菌菌液涂覆于MRS培养基（10 g/L蛋白胨，5 g/L牛肉膏粉，4g/L酵母粉，20 g/L葡萄糖，1 g/L吐温-80，2 g/L K2HPO4，5 g/L乙酸钠，2 g/L柠檬酸三铵，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.05 g/L MgSO4·4H2O，20 g/L琼脂）中于37 ℃培养24 h，用1 mL无菌水冲洗MRS固体培养基中的菌落，并接种于活化培养基于37 ℃，180 rpm培养18 h；
活化培养基配方为：5.0 g/L酵母粉，10 g/L NaHCO3，9.6 g/L NaH2PO4·2H2O，15.5 g/L K2HPO4·3H2O，2.5 g/L玉米浆，30 g/L CaCO3，溶剂为水。
（3）将活化的棘孢木霉以4% v/v接种量接种到发酵培养基中，30 ℃、120 rpm发酵48 h，得到发酵液；
发酵培养基配方为：0.3 g/L尿素，1.4 g/L (NH4)2SO4，2.0 g/L KH2PO4，0.3 g/LCaCl2，0.3 g/L MgSO4·7H2O，0.005 g/L FeSO4·7H2O，0.00156 g/L MnSO4·H2O，0.0014g/L ZnSO4·7H2O，0.002 g/L CoCl2，微晶纤维素浓度为80 g/L，溶剂为水，pH调至5.5，121℃灭菌20 min。
（4）以混菌时间48 h为例，将活化好的副干酪乳杆菌以10% v/v接种到步骤（3）得到的发酵液中，设置五组发酵培养基，其中CaCO3浓度分别为0 g/L，5 g/L，15 g/L，25 g/L，35 g/L，37 ℃，180 rpm发酵336 h。
培养过程中，每隔24 h取样并测定其乳酸产量。当CaCO3浓度达到15 g/L时，乳酸产量最高，达到34.69 g/L（图1）。当CaCO3浓度提高时，其钙离子浓度以及培养基pH对其混菌体系具有很大影响。棘孢木霉最适pH为5.5，副干酪乳杆菌最适pH为5.0，通过优化CaCO3浓度可以对混菌体系pH进行最优的调控。钙离子作为微量金属离子，一定程度上能够提高副干酪乳杆菌乳酸的生产，而棘孢木霉也能使用其降解微晶纤维素得到的葡萄糖，所以可通过提高钙离子浓度抑制棘孢木霉生长，使碳代谢流更多地流向乳酸的合成。而棘孢木霉分泌出来的纤维素酶在发酵液中稳定性强，可持续降解微晶纤维素到葡萄糖，供给乳酸菌的生长与乳酸合成。
实施例2 副干酪乳杆菌不同的接种时间对最终乳酸产量的影响
方法同实施例1，其中CaCO3浓度为15 g/L，接种方法是以接种量10% v/v接种到步骤（3）得到的发酵液中；不同的是步骤（3）中设置5组实验，发酵时间分别为24 h，48 h，72h，96 h，120 h。
培养过程中，每隔24 h取样并测定其乳酸产量。当棘孢木霉培养了48 h时加入副干酪乳杆菌，乳酸产量最高，达到38.51 g/L（图2）。在此体系中，棘孢木霉分泌的纤维素酶有效地降解了微晶纤维素，此后，在混菌体系中，纤维素酶和β-葡萄糖苷酶仍具有较高的酶活，能够源源不断降解微晶纤维素为葡萄糖，而副干酪乳杆菌可以利用降解木质纤维素得到的葡萄糖生产乳酸。接种时间过早（24 h），纤维素酶活较低，不利用后续微晶纤维素的降解，而接种过晚（72-120 h），则会导致棘孢木霉培养时间过长，纤维素酶和β-葡萄糖苷酶酶活下降，且部分降解得到的葡萄糖也被棘孢木霉利用，从而减少了乳酸合成的碳流量，最终导致乳酸产量降低。
实施例3 不同微晶纤维素浓度对最终乳酸产量的影响
方法同实施例2，其中副干酪乳杆菌的接种时间为48 h，接种方法是以接种量10%v/v接种到步骤（3）得到的发酵液中，CaCO3浓度为15 g/L；不同的是步骤（3）中设置4组实验，微晶纤维素浓度分别为60 g/L，80 g/L，100 g/L，120 g/L。当微晶纤维素浓度为60 g/L时，乳酸产量为40.03 g/L（图3）；当微晶纤维素浓度为80 g/L时，混菌发酵得到的乳酸浓度最高，混菌发酵得到的乳酸浓度为46.86 g/L；当微晶纤维素浓度为100 g/L时，乳酸浓度为27.23 g/L，当微晶纤维素浓度为120 g/L时，乳酸浓度为18.64 g/L。实验证明副干酪乳杆菌单菌无法利用微晶纤维素进行发酵，而使用功能互补的混菌体系时，80 g/L微晶纤维素可生产46.86 g/L乳酸。
实施例4 混菌体系利用微晶纤维素合成乳酸响应面优化
通过实验分析得出影响乳酸产量的3个影响因素：微晶纤维素浓度、CaCO3浓度、顺序接种时间。为获得乳酸最高产量，采用Design Expert软件并选取这3个条件进行响应面优化。选取微晶纤维素浓度（A），CaCO3浓度（B），顺序接种时间（C）3个因素作为变量，以乳酸产量（Y）为响应值，每个因素三个水平，用-1、0、1来表示。根据实验结果进行多元回归分析，得出乳酸产量Y值与各因素之间的经验关系。
图4，图5，图6为响应面三维曲面图和等高线图，曲面图代表两个单因素之间的相互影响。在曲面图中，中间的红点为乳酸浓度最高点，由中间到四周乳酸浓度逐渐降低。当微晶纤维素浓度为80 g/L，CaCO3浓度为15 g/L时，乳酸产量最高。当MCC浓度为80 g/L，乳酸菌接种时间为48 h，乳酸产量达到最高值。当CaCO3浓度为15 g/L，乳酸菌接种时间为48h时，获得的乳酸产量最高。
通过Design Expert软件分析，预测出在微晶纤维素浓度82.69 g/L，CaCO3浓度19.33 g/L，副干酪乳杆菌接种时间为40 h的条件下，所获得的乳酸产量最高，为53.92 g/L。以该预测发酵条件进行验证，最终乳酸产量可达57.59 g/L（图7），得出实验结果与模型预测值基本一致。
实施例5 不同玉米芯浓度对最终乳酸产量的影响
方法同实施例3，其中副干酪乳杆菌的接种时间为48 h，接种方法是以接种量10%v/v接种到步骤（3）得到的发酵液中，CaCO3浓度为15 g/L；不同的是步骤（3）中设置4组实验，以玉米芯替代发酵培养基中的微晶纤维素，玉米芯浓度分别为60 g/L，80 g/L，100 g/L，120 g/L。
培养过程中，每隔24 h取样测定其乳酸产量。当玉米芯浓度为60 g/L时，乳酸产量为3.68 g/L（图8）；当玉米芯浓度为80 g/L时，混菌发酵得到的乳酸浓度最高，混菌发酵得到的乳酸浓度为9.80 g/L；当玉米芯浓度为100 g/L时，乳酸浓度为4.13 g/L，当玉米芯浓度为120 g/L时，乳酸浓度为4.49 g/L。
实验证明使用混菌体系时，80 g/L玉米芯可生产9.80 g/L乳酸，证明棘孢木霉和副干酪乳杆菌混菌体系可直接从木质纤维素原料到乳酸合成的可行性，有望实现发酵原料成本的降低。
Claims (10)
1.一种利用功能互补的真菌-细菌混菌体系实现木质纤维素合成乳酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将活化的棘孢木霉接种到含有微晶纤维素的发酵培养基中进行发酵，发酵24-120h，得到发酵液；
（2）将活化的副干酪乳杆菌接种到步骤（1）的发酵液中，厌氧发酵生产乳酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述棘孢木霉为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）LYS1，步骤（2）所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）LYS2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述棘孢木霉发酵24-96 h后将步骤（2）活化的副干酪乳杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中，厌氧发酵生产乳酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述活化的棘孢木霉的接种量为发酵培养基体积的1-5%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述发酵条件为：发酵温度28-35℃，发酵pH为5.0-6.0，转速0-120 rpm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述含有微晶纤维素的发酵培养基配方为：0.1-0.5 g/L尿素，1.0-2.0 g/L (NH4)2SO4，1.0-3.0 g/L KH2PO4，0.1-0.6 g/LCaCl2，0.1-0.6 g/L MgSO4·7H2O，0.002-0.008 g/L FeSO4·7H2O，0.001-0.003 g/LMnSO4·H2O，0.001-0.003 g/L ZnSO4·7H2O，0.001-0.003 g/L CoCl2，40-120 g/L微晶纤维素，CaCO3 5 ~35g/L，溶剂为水，调节pH至5.0-6.0。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）棘孢木霉活化条件为：取0.5-1.0mL棘孢木霉菌液涂覆于PDA培养基中于28-35 ℃培养72-120 h；用0.5-1.0 mL无菌水冲洗PDA固体培养基中的菌落，并接种于活化培养基，于28-35 ℃活化24-96 h；棘孢木霉种子活化培养基配方为：0.1-0.5 g/L尿素，1.0-2.0 g/L (NH4)2SO4，1.0-3.0 g/L KH2PO4，0.1-0.6g/L CaCl2，0.1-0.6 g/L MgSO4·7H2O，0.002-0.008 g/L FeSO4·7H2O，0.001-0.003 g/LMnSO4·H2O，0.001-0.003 g/L ZnSO4·7H2O，0.001-0.003 g/L CoCl2，10-20 g/L葡萄糖，溶剂为水，调节pH至5.0-6.0。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述活化的副干酪乳杆菌的接种方式如下：将活化的副干酪乳杆菌以接种量1-10% v/v接种到步骤（1）得到的发酵液中。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述发酵条件为：发酵温度35-39℃，发酵时间为24-384 h，发酵pH为5.0-6.0，转速为120-180 rpm。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述副干酪乳杆菌的活化条件如下：取0.5-1.0 mL副干酪乳杆菌菌液涂覆于MRS培养基中于35-39 ℃培养12-24 h；用0.5-1.0 mL无菌水冲洗MRS培养基中的菌落，并接种于活化培养基于35-39 ℃，120-180 rpm培养12-18 h； MRS培养基为：5-10 g/L蛋白胨，3-6 g/L牛肉膏粉，3-5 g/L酵母粉，10-20 g/L葡萄糖，1.0-2.0 g/L吐温-80，1.0-3.0 g/L K2HPO4，3.0-6.0 g/L乙酸钠，1.0-3.0 g/L柠檬酸三铵，0.1-0.3 g/L MgSO4·7H2O，0.01-0.1 g/L MgSO4·4H2O，10-20 g/L琼脂；副干酪乳杆菌活化培养基为：3.0-5.0 g/L酵母粉，5-10 g/L NaHCO3，5-10 g/L NaH2PO4·2H2O，10-20 g/L K2HPO4·3H2O，2.0-3.0 g/L玉米浆，0-35 g/L CaCO3，溶剂为水。
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| CN202210758427.2A Pending CN115197977A (zh) | 2022-06-30 | 2022-06-30 | 一种利用功能互补的真菌-细菌混菌体系实现木质纤维素合成乳酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115197977A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116179454A (zh) * | 2022-10-27 | 2023-05-30 | 天津科技大学 | 一种甘蔗渣为原料发酵生产乳酸单体的重组菌及其应用 |
-
2022
- 2022-06-30 CN CN202210758427.2A patent/CN115197977A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116179454A (zh) * | 2022-10-27 | 2023-05-30 | 天津科技大学 | 一种甘蔗渣为原料发酵生产乳酸单体的重组菌及其应用 |
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