CN102041279B

CN102041279B - 生物膜-电渗析耦合连续生产l-乳酸工艺

Info

Publication number: CN102041279B
Application number: CN 200910204291
Authority: CN
Inventors: 唐开宇; 高大成
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Priority date: 2009-10-21
Filing date: 2009-10-21
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2029-10-21
Also published as: CN102041279A

Abstract

本发明提供了一种生物膜-电渗析耦合连续生产L-乳酸的工艺方法。本发明采用清液生物膜柱式反应器进行连续厌氧发酵，产乳酸菌株被组合式多孔环填料吸附，采用超滤膜对发酵液进行过滤，菌体被超滤膜截留，截留的菌体和液体返回到生物膜柱式反应器，采用电渗析L-乳酸进行分离。本发明方法使用生物膜柱式反应器，使产乳酸菌株吸附于膜上，通过超滤膜截留乳酸菌有效提高了菌体浓度和糖利用率，使乳酸浓度，产酸速率，糖酸转化率大幅度提高。

Description

生物膜-电渗析耦合连续生产L-乳酸工艺

技术领域

本发明涉及一种L-乳酸的生产工艺，具体的说，是将生物膜法发酵与电渗析耦合起来连续生产L-乳酸的生产方法。

背景技术

目前国内外生产乳酸的方法主要为发酵法。菌种有细菌，米根霉等，发酵方法多为批次发酵，加入CaCO₃调节发酵过程的pH值，CaCO₃为中和剂对后提取带来很大麻烦，乳酸收率为45％左右。其它中和剂有Ca(OH)₂，NH₄OH，NaOH等。此外用米根霉发酵是好氧发酵，能耗高，产量低。

由于乳酸杆菌可以厌氧发酵，适合连续化生产。连续化发酵简化了许多单元操作，提高了设备的利用率，具有生产效率高，产品质量稳定等优点。乳酸连续化发酵工艺从20世纪30年代起国外就有不少研究。

J.M.Bruno等(Continuous production of L(+)-lactic acid by Lactobacilluscasei in two-stage systems[J]，Appl Microbiol Biotechnol，1999，51(5)：316-324)用李糖乳酸杆菌，两级恒化器和两级固定床连续发酵生产乳酸，最佳条件：D12/D2＝0.5，第一级恒化器pH5.5，37℃，第二级恒化器pH6.0，45℃；第一级固定床pH6.0，42℃第二级固定床pH6.0，45℃，用多孔泡沫固定细胞。中和剂是1.5mol/L的氨水，最大乳酸浓度和体积产率分别为48g/L，2.42g/(L·h)和57.5g/L，9.72g/(L·h)。恒化器设备最简单，但存在细胞冲出问题，即稀释率不能超过最大比生长速率(u_max)，固定化细胞技术复杂，经济成本高且存在扩散障碍，底物进入和产物排出受到阻碍。

Sunhoon Kwon(High-rate continuous production of lactic acid byLactobacillus rhamnosus in a two-stage menbrane cell-recycle bioreactor[J]，Biotechnolgy and Bioengineering，2001，73(1)：25-34)用三种膜-细胞循环生物反应器系统进行乳酸连续发酵研究，中和剂是8mol/L的氨水，菌种是鼠李糖乳酸杆菌。在单级膜-细胞循环生物反应器系统中，膜组件是中空纤维膜，稀释率为0.66h^-1，最大乳酸浓度和最大体积产率为83g/L和22g/L.h。在两级膜-细胞循环反应器系统中，膜组件是平板膜，总稀释率为0.62h^-1，最大乳酸浓度和最大体积产率为92g/L和57g/(L·h)。在膜细胞循环反应器-搅拌发酵罐系统中，最大乳酸浓度和最大体积产率为87g/L和7g/(L·h)。膜-细胞循环发酵法存在膜污染导致通量下降问题，需经常对膜组件清洗维护。

J.C.Cotton(Continuous lactic acid fermentation using a plastic compositesupport biofilm reactor[J]，Applied Microbiology and Biotechnology，2001，31(4)：161-169)用塑料复合支持物形成生物膜反应器，搅动控制生物膜厚度，在稀释率0.4h^-1，125rpm的条件下，乳酸浓度22.36g/L，产酸速率8.95g/(L·h)。

林建平(高校化学工程学报，1995年12月，“转盘反应器固定米根霉的L乳酸发酵”)用转盘反应器吸附米根霉进行连续化发酵，pH值用灭菌的CaCO₃控制为5，适宜的操作条件是：D＝0.06h^-1，U_空气＝0.25vvm，转速25～50rpm及6升的持液量，乳酸浓度82.5g/L，糖利用率94.5％，产酸速率4.95g/(L·h)，得率80.5g/g。吸附法方法比较简单，可以有多种形式(转盘，转管，颗粒状等)，但细胞容易脱落，浓度较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种原料利用充分、乳酸浓度高且生产效率高的生物膜-电渗析耦合连续生产乳酸方法。

本发明的L-乳酸生产方法包括：制备用于培养产乳酸菌株的发酵培养液，将发酵培养液加入到生物膜柱式反应器内，所述的反应器内装填有填料，将产乳酸菌株种子接入反应器内的填料上，并流加氨水使pH值保持在5.0～7.0，温度40～44℃，培养一段时间，待产乳酸菌株覆盖填料表面后，开始由反应器底部流加发酵培养液进行厌氧发酵以合成L-乳酸；采用超滤膜对发酵液进行过滤，截留液中的菌体循环回生物膜柱式反应器，而渗出液则进行电渗析分离得到L-乳酸。

所述的发酵培养液是指所有可用于培养产乳酸菌株的培养液。本发明方法中，所述的发酵培养液包括糖化液和营养物质(氮源和玉米浆)。

所述的产乳酸菌株是指耐氨的厌氧或兼性厌氧细菌或真菌。产乳酸菌株通常选自干酪乳酸杆菌、德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌或乳酸乳杆菌等。产乳酸菌株的种子接入量为10％～20％。

所述的生物膜柱式反应器中装填的填料可以是组合填料、弹性组合填料、组合式多孔环填料，所述填料的形状为圆环形，材质为聚丙烯。所述填料在柱式反应器中的装填量一般小于60％。

根据本发明提供的方法，发酵培养液通过反应器的稀释率为0.1～2.8h^-1，优选为0.1～2.0h^-1；所述流加氨水的浓度为2～10mol/L。本发明的柱式反应器的长径比一般为2～4∶1。

所述超滤膜的截留分子量为3000～10000，膜操作压力2～6bar。渗出液的电渗析操作电压3～12伏。

与现有技术相比较，本发明方法具有如下优点：

(1)原料利用充分，污染少。

本发明用低温双酶法糖化含糖物质，得糖率高，滤渣可做为纤维蛋白饲料，因此可以提高原料利用率，避免酸及盐类废水的产生。

(2)提高了菌体浓度和糖利用率，乳酸浓度和产酸速率高。

本工艺采用清液生物膜柱式反应器连续厌氧发酵，乳酸菌被组合式多孔环填料吸附，同时菌体被超滤膜截留，截留的菌体和液体返回到生物膜柱式反应器。通过使用生物膜柱式反应器，使乳酸菌吸附于膜上，并通过超滤膜截留乳酸菌有效提高了菌体浓度和糖利用率，使乳酸浓度，产酸速率，糖酸转化率大幅度提高。

(3)提取效率高，能耗低，污染少。

本发明后提取工艺采用超滤-电渗析技术，提取效率高，产品质量好，能耗低，而且大量减少了酸、碱和树脂等，降低了生产成本，减少了污染。

附图说明

图1为本发明工艺方法的流程示意图。

其中，1-蠕动泵，2-蠕动泵，3-蠕动泵，4-尼可尼涡流泵；

F：原料液B：发酵流出液Fs：发酵流出液至超滤膜组件fr：截留液f：透过液。

具体实施方式

本发明L-乳酸生产工艺的具体步骤包括：

(1)糖化液的制备：将含糖物质采用低温双酶法糖化，用板框过滤机过滤得到糖化液，滤渣可做为纤维蛋白饲料。所得糖化液的浓度一般为130～200g/L。

所述的含糖物质是指含有糖的农作物，优选玉米、小麦、红薯、土豆或糖蜜；其中玉米、小麦、红薯和土豆需要先进行粉碎，再添加淀粉酶进行水解。

(2)营养物质的制备：所述的营养物质优选豆粕水解液、麸皮和玉米浆；其中豆粕水解液的制法为：将豆粕用硫酸水解，得到豆粕水解液做为氮源。

(3)将产乳酸菌株活化，扩大培养：保存在固体培养基中的菌种用接种环挑取2～3环接入种子培养基，转接3次，40～44℃培养每次培养24h，液体中会出现丝状的光泽，表示菌种已经在培养基中生长了。将活化后的种子按1∶10接入试管及三角瓶进行扩大培养，40～44℃培养，镜检无异常形态细胞，菌体生长旺盛，气泡产生剧烈。

(4)将步骤(1)过滤得到的糖液、其它营养源(豆粕水解液和玉米浆)和氨水加入生物膜柱式反应器，反应器内保持pH值在6.5～7.0，温度40～44℃，加入步骤(3)的产乳酸菌株种子，待产乳酸菌株覆盖填料表面后，开始由反应器底部连续流加原料及营养物质进行发酵。

(5)用超滤组件截留发酵液中的菌体。

(6)将超滤截留的菌体和液体返回到生物膜柱式反应器。

(7)将以上渗出液进行电渗析分离得到L-乳酸。

以下通过具体实施例对本发明的方法做详细说明。

本发明实施例中的相关设备型号如下：

生物膜柱式反应器：内部放置组合式多孔环填料，反应器内径150mm，高度为350mm。填料为组合式多孔环填料，圆环形，规格φ150×100，厂家：江西萍乡市环盛催化剂有限公司。

电渗析器：两室多层式，阳、阴极为钛网涂钌和铱，膜槽尺寸100×250mm，与直流稳压电源相连，浓、淡水隔板为直流式聚乙烯板厚度2.5mm，阴、阳离子交换膜为聚乙烯异相膜，有效膜面积为65×200mm，共6对。

离子交换膜：国家海洋研究所水处理中心制造。

平板超滤膜组件：膜：再生纤维素膜，截留分子量：5000，膜面积：0.5m²，膜通量：40～60L/(m²·h)，厂家：厦门三达。

实施例1.发酵培养液制备

(1)糖化液制备，采用双酶水解方法：称取1600g玉米粉加水至8000mL，调pH值为6.0～6.4，加入a-淀粉酶(600U/g)，CaCl₂(0.01mol/L)，维持90℃下约40分钟至碘液检测无淀粉。将液化缪pH调为4.0～4.5，温度58～62℃，加入糖化酶(200U/g)维持温度1小时。后用过滤器去除残渣，滤液用测定葡萄糖浓度后备用，所制备糖化液的葡萄糖浓度为180g/L。

(2)豆粕水解液制备：称取一定量的豆粕，加入5倍量的水，调和均匀。按水量的2％加入浓硫酸，迅速混合均匀，勿使物料局部碳化。通入蒸汽，使料温升高至95℃以上，保温16～24小时，其间，每隔1小时搅拌3～5分钟。水解结束后，物料呈酱红色，具果香味。可直接用于种子罐和发酵罐培养基的配制，也可降温后短期保存。

(3)发酵培养液的配制：取步骤(1)制备的糖化液、步骤(2)制备的豆粕水解液和玉米浆(玉米浆购自上海西王淀粉糖有限公司)，按比例配制成发酵培养液。发酵培养液组成为：葡萄糖质量浓度为150g/L，豆粕水解液体积分数为16％，玉米浆体积分数为0.7％。

实施例2乳酸杆菌活化，扩大培养

实施例中所使用的干酪乳酸杆菌购自北京食品发酵研究所。保存在固体培养基中的菌种用接种环挑取2～3环接入种子培养基，42℃培养24h，按1∶10接入试管及三角瓶进行扩培，42℃培养24h，可以看见菌体大量生成，气泡产生剧烈。

所述种子培养基组成：葡萄糖4％，大豆蛋白胨1％，KH₂PO₄0.1％，YeastExtract 0.5％，(NH₄)₂SO₄0.4％，轻质CaCO₃1％，pH值6.0～6.5。

实施例3稀释率为0.4h^-1的发酵实验

将实施例1制备的发酵培养液加入到生物膜柱式反应器中，温度42℃。将培养24h的种子按1∶10接入，流加5mol/L的氨水，使pH保持在6.5～7.0，培养20～30h后，在组合式多孔环填料上出现白色斑点，说明干酪乳酸杆菌已经吸附在在填料上，随后斑点不断扩大直至覆盖填料表面。等干酪乳酸杆菌覆盖填料表面后，开始流加原料储罐中的发酵培养液。发酵液从生物膜柱式反应器流出，进入到发酵液储罐，同时发酵液经尼可尼涡流泵进入超滤膜组件，膜操作压力为5bar，膜通量30L/(m²·h)，截留的菌体和截留液返回生物膜柱式反应器进行发酵。调节1，2，3泵，使稀释率D＝0.4h^-1。在阴、阳极室内注入稀H₂SO₄，淡水室内注入超滤透过液，浓水室内注入蒸馏水。通直流电后，操作电压6伏，进行电渗析分离乳酸，发酵持续进行12天。乳酸浓度118.5g/L，残糖浓度2.7g/L，产酸速率38.5g/(L·h)。

实施例4稀释率为0.8h^-1的发酵实验

将实施例1制备的发酵培养液加入到生物膜柱式反应器中，温度42℃。将培养24h的种子按1∶10接入，流加5mol/L的氨水，使pH保持在6.5～7.0，培养20～30h后，在组合式多孔环填料上出现白色斑点，说明干酪乳酸杆菌已经吸附在在填料上，随后斑点不断扩大直至覆盖填料表面。等干酪乳酸杆菌覆盖填料表面后，按稀释率0.8h^-1开始流加原料储罐中的发酵培养液。发酵液从生物膜柱式反应器流出，进入发酵液储罐，同时发酵液经尼可尼涡流泵进入通过超滤膜组件，膜操作压力5bar，透出液的膜通量30L/(m²·h)，截留的菌体和截留液返回生物膜柱式反应器进行发酵。调节1，2，3泵，使稀释率D＝0.8h^-1。在阴、阳极室内注入稀H₂SO₄，淡水室内注入超滤透过液，浓水室内注入蒸馏水。通直流电后，操作电压7伏，进行电渗析分离乳酸，发酵持续进行12天。乳酸浓度115.2g/L，残糖浓度5.7g/L，产酸速率72.6g/(L·h)。

实施例5稀释率为1.2h^-1的发酵实验

将实施例1制备的发酵培养液加入到生物膜柱式反应器中，温度42℃。将培养24h的种子按1∶10接入，流加5mol/L的氨水，使pH保持在6.5～7.0，培养20～30h后，在组合式多孔环填料上出现白色斑点，说明干酪乳酸杆菌已经吸附在在填料上，随后斑点不断扩大直至覆盖填料表面。等干酪乳酸杆菌覆盖填料表面后，按稀释率0.6h^-1开始流加储罐中的发酵培养液。发酵液从生物膜柱式反应器流出，进入到储罐，同时发酵液经尼可尼涡流泵进入超滤膜组件，膜操作压力5bar，膜通量30L/(m²·h)，截留的菌体和截留液返回生物膜柱式反应器进行发酵。调节1，2，3泵，使稀释率D＝1.2h^-1。在阴、阳极室内注入稀H₂SO₄，淡水室内注入超滤透过液，浓水室内注入蒸馏水。通直流电后，操作电压8伏，进行电渗析分离乳酸，发酵持续进行14天。乳酸浓度103.6g/L，残糖浓度9.5g/L，产酸速率93.6g/(L·h)。

实施例6稀释率为1.6h^-1的发酵实验

将实施例1制备的发酵培养液加入到生物膜柱式反应器中，温度42℃。将培养24h的种子按1∶10接入，流加5mol/L的氨水，使pH保持在6.5～7.0，培养20-30h后，在组合式多孔环填料上出现白色斑点，说明干酪乳酸杆菌己经吸附在在填料上，随后斑点不断扩大直至覆盖填料表面。等干酪乳酸杆菌覆盖填料表面后，按稀释率1.6h^-1开始流加储罐中的发酵培养液。发酵液从生物膜柱式反应器流出，进入到储罐，同时发酵液经尼可尼涡流泵进入超滤膜组件，膜操作压力5bar，膜通量30L/(m²·h)，截留的菌体和截留液返回生物膜柱式反应器进行发酵。调节1，2，3泵，使稀释率D＝1.6h^-1。在阴、阳极室内注入稀H₂SO₄，淡水室内注入超滤透过液，浓水室内注入蒸馏水。通直流电后，操作电压9伏，进行电渗析分离乳酸，发酵持续进行10天。乳酸浓度93.5g/L，残糖浓度16.8g/L，产酸速率110.4g/(L·h)。

实施例7用德氏乳杆菌发酵，稀释率为0.6h^-1的实验

本实验使用的德氏乳杆菌购自中科院微生物所。将实施例1制备的发酵培养液加入到生物膜柱式反应器中，温度45℃。将培养24h的种子按1∶10接入，流加5mol/L的氨水，使pH保持在4.5～5.5，培养20～30h后，在组合式多孔环填料上出现白色斑点，说明德氏乳杆菌已经吸附在在填料上，随后斑点不断扩大直至覆盖填料表面。等德氏乳酸杆菌覆盖填料表面后，按稀释率0.6h^-1开始流加储罐中的发酵培养液。发酵液从生物膜柱式反应器流出，进入到储罐，同时发酵液经尼可尼涡流泵进入超滤膜组件，膜操作压力5bar，膜通量30L/(m²·h)，截留的菌体和截留液返回生物膜柱式反应器进行发酵。调节1，2，3泵，使稀释率D＝0.6h^-1。在阴、阳极室内注入稀H₂SO₄，淡水室内注入超滤透过液，浓水室内注入蒸馏水。通直流电后，操作电压8伏，进行电渗析分离乳酸，发酵持续进行10天。乳酸浓度110.5g/L，残糖浓度3.8g/L，产酸速率57.4g/(L·h)。

实施例8用鼠李糖乳杆菌发酵，稀释率为1.0h^-1的实验

本实验使用的鼠李糖乳杆菌购自中科院微生物所。将实施例1制备的发酵培养液加入到生物膜柱式反应器中，温度42℃。将培养24h的种子按1∶10接入，流加5mol/L的氨水，使pH保持在5.0～6.0，培养20～30h后，在组合式多孔环填料上出现白色斑点，说明鼠李糖乳杆菌已经吸附在在填料上，随后斑点不断扩大直至覆盖填料表面。等鼠李糖乳杆菌覆盖填料表面后，按稀释率1.0h^-1开始流加储罐中的发酵培养液。发酵液从生物膜柱式反应器流出，进入到储罐，同时发酵液经尼可尼涡流泵进入超滤膜组件，膜操作压力5bar，膜通量30L/(m²·h)，截留的菌体和截留液返回生物膜柱式反应器进行发酵。调节1，2，3泵，使稀释率D＝1.0h^-1。在阴、阳极室内注入稀H₂SO₄，淡水室内注入超滤透过液，浓水室内注入蒸馏水。通直流电后，操作电压9伏，进行电渗析分离乳酸，发酵持续进行10天。乳酸浓度91.5g/L，残糖浓度10.8g/L，产酸速率65.4g/(L·h)。

比较例1：用干酪乳酸杆菌，发酵罐发酵生产乳酸

将实施例1制备的发酵培养液加入到15L B.braun发酵罐，温度42℃。将培养24h的种子按1∶10接入，流加5mol/L的氨水，使pH保持在6.5～7.0，发酵72h。乳酸浓度138.7g/L，残糖浓度1.81g/L，产酸速率1.93g/(L·h)。

本发明实施例中采用的分析方法如下：

葡萄糖，L-乳酸浓度采用SBA-40C型生物传感分析仪测定；

L-乳酸的定性测定：由于乳酸具有旋光性，因此采用HPLC仪(Waters公司)，手性柱，检测器：折光检测器。

Claims

1.一种生物膜-电渗析耦合连续生产L-乳酸工艺，包括：制备用于培养产乳酸菌株的发酵培养液，将发酵培养液加入到生物膜柱式反应器内，所述的反应器内装填有填料，将产乳酸菌株种子接入反应器内的填料上，并流加氨水使pH值保持在5.0～7.0，温度保持40～44℃，培养一段时间，待产乳酸菌株覆盖填料表面后，开始由反应器底部流加发酵培养液进行厌氧发酵以合成L-乳酸；采用超滤膜对发酵液进行过滤，截留液中的菌体循环回生物膜柱式反应器，而渗出液则进行电渗析分离得到L-乳酸；

其中所述的产乳酸菌株选自干酪乳酸杆菌、德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌或乳酸乳杆菌。

2.按照权利要求1所述的工艺方法，其特征在于，所述生物膜柱式反应器中装填的填料为组合填料、弹性组合填料或组合式多孔环填料，所述填料的形状为圆环形，材质为聚丙烯。

3.按照权利要求1所述的工艺方法，其特征在于，所述产乳酸菌株的种子接入量为10％～20％。

4.按照权利要求1所述的工艺方法，其特征在于，所述填料在柱式反应器中的装填量小于60％。

5.按照权利要求1所述的工艺方法，其特征在于，所述的由反应器底部流加发酵培养液的稀释率为0.1～2.8h^-1。

6.按照权利要求1所述的工艺方法，其特征在于，所述的由反应器底部流加发酵培养液的稀释率为0.1～2.0h^-1。

7.按照权利要求1所述的工艺方法，其特征在于，所述流加氨水的浓度为2～10mol/L。

8.按照权利要求1所述的工艺方法，其特征在于，所述超滤膜的截留分子量为3000～10000，膜操作压力2～6bar。