CN104131042B

CN104131042B - 一种控制米根霉生长形态产l‑乳酸的方法

Info

Publication number: CN104131042B
Application number: CN201410377353.3A
Authority: CN
Inventors: 付永前; 蒋茹; 朱华跃; 尹龙飞; 孙小龙; 李鑫
Original assignee: Taizhou University
Current assignee: Taizhou University
Priority date: 2014-08-01
Filing date: 2014-08-01
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2034-08-01
Also published as: CN104131042A

Abstract

本发明提供了一种控制米根霉生长形态产L‑乳酸的方法。利用本方法生产L‑乳酸，通过精确调控米根霉在发酵体系中的生长形态，控制菌体深层发酵中菌体的直径，降低发酵过程中的粘度，增强发酵过程中质量传递过程，以此提高米根霉生产L‑乳酸的转化率，终浓度以及生产强度。

Description

一种控制米根霉生长形态产L-乳酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种控制米根霉生长形态生产L-乳酸的方法，具体涉及一种将米根霉进行预培养，控制发酵过程中的形态，以此高产L-乳酸的方法。

背景技术

L-乳酸是一种重要的有机酸，在食品行业、材料行业有广泛的应用。其作为一种绿色化学品，可以合成聚乳酸、乳酸乙酯等可降解材料，因而在材料领域备受关注。目前，L-乳酸一般采用生物法合成，生产的菌种多为根霉属微生物，如少根根霉Rhizopus arrizhus、米根霉Rhizopus oryzae等。其中，米根霉作为美国FDA认证的安全生产菌株，具有生长迅速、环境适应能力强、分泌有机酸及蛋白质能力强等优势，为有机酸的优秀生产菌种。

米根霉Rhizopus oryzae在液体深层发酵过程中表现出复杂的生长形态，常见的生长形态包括丝状、絮状以及球状，在发酵失败的时候，还呈现出团块状等。大规模的液体深层发酵生产中，菌体的生长形态会对目标产物的代谢合成带来直接的影响。在酶制剂以及蛋白的合成过程中，由于其高耗氧以及次级代谢产物特性，丝状形态被认为是高效合成的生长形态，并有利于蛋白产物的分泌；球状则被认为是有机酸合成的首选形态，如黑曲霉液体深层发酵合成柠檬酸，其生长形态为球状，而米根霉产富马酸过程中，球状形态的菌体也展现出比其他形态更优秀的生产能力。另外，在青霉菌的合成过程中，产黄青霉在发酵过程中展现出球状形态，并且青霉素的产生与菌体形态的分化直接相关。

研究人员发现，米根霉产乳酸液体深层发酵过程中呈球状形态或者絮状形态，其高产的形态倾向于球状形态。然而，如何找准米根霉产L-乳酸的高产形态，并使用相应的工艺来调整控制其生长形态，达到高产L-乳酸的目的，成为需要解决的技术问题之一。

发明内容

为了解决该技术问题，本发明的技术目的为提供一种控制米根霉生长形态产L乳酸的方法，满足米根霉高产L-乳酸对菌体生长形态的要求，从而达到高产的目的。

为了达到本发明的技术目的，本发明的技术方案为，一种控制米根霉生长形态产L-乳酸的方法，发酵步骤依次如下：(a)孢子固体培养基培养(b)一级种子罐培养(c)二级种子罐培养(d)发酵罐培养，其特征在于：一级种子罐中菌体形态当量直径为0.5-0.8mm；二级种子罐菌体形态当量直径为0.5-1.2mm；发酵罐菌体形态当量直径为0.4-2.2mm。

对于本发明所述的方法，应理解为米根霉生产L-乳酸需要有碳源与一定的氮源，如在所述一级种子罐培养的培养基中含有葡萄糖、玉米淀粉、木薯淀粉、玉米糖化醪、纤维素酶解液中的一种或者几种；尿素、硝酸铵、碳酸铵、黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉或酵母膏中的一种或几种；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种；在所述二级种子罐培养的培养基中包括葡萄糖、玉米淀粉、木薯淀粉、玉米糖化醪、纤维素酶解液中的一种或者几种；尿素、硝酸铵、碳酸铵、黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉或酵母膏中的一种或几种；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种；在所述发酵罐培养的培养基配方中包含葡萄糖、玉米淀粉、木薯淀粉、玉米糖化醪、纤维素酶解液中的一种或者几种；

特别的，在所述一级种子罐和二级种子罐还添加了形态控制剂，所述形态控制剂为，麦麸纤维酸解脱毒水解液，大豆纤维酸解脱毒水解液中，纤维素酸解脱毒水解液，的一种或者多种。

根据本发明所述的方法，所述一级种子罐培养的培养基配方为：葡萄糖、玉米淀粉、木薯淀粉、玉米糖化醪、纤维素酶解液中的一种或者几种折合葡萄糖含量为1-20％，尿素、硝酸铵、碳酸铵、黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉或酵母膏中的一种或几种含量为1-5g/L，磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种含量为1-5g/l，其中形态控制剂的添加量为发酵培养基质量的0.5-10％；所述二级种子罐培养的培养基配方为：葡萄糖、玉米淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉糖化醪、纤维素酶解液中的一种或者几种折合葡萄糖含量为1-10％，尿素、硝酸铵、碳酸铵、黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉或酵母膏中的一种或几种含量为1-2g/L，磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种含量为1-3g/l，其中形态控制剂的添加量为发酵培养基质量的0.5-10％；所述发酵培养的培养基配方为：葡萄糖、玉米淀粉、木薯淀粉、玉米糖化醪、纤维素酶解液中的一种或者几种折合葡萄糖含量为1‐20％；所述形态控制剂的添加量为发酵培养基质量的0.1‐5％。

根据本发明所述的方法，在一个优选方案中，所述一级种子培养基的配方为，葡萄糖或者玉米淀粉糖化醪折合葡萄糖含量为4‐8％，玉米浆含量为1‐2g/L，形态控制剂的添加量为2％。所述二级种子培养基的配方为玉米淀粉糖化醪葡萄糖含量为4‐8％，形态控制剂添加量为1％；所述发酵培养基培养为：玉米淀粉糖化醪，形态控制剂添加量为0.1％。

根据本发明所述的方法，其特征在于，所述以及种子培养基的培养条件为37℃，自然pH；所述一级种子罐的培养条件为，通风0.1‐1vvm，搅拌50‐200转/min；所述二级种子罐的培养条件为，通风0.1‐0.5vvm，搅拌50‐100转/min；所述发酵罐培养的培养条件为，通风0.1‐0.3vvm，搅拌50‐100转/min；其中，一级种子罐培养用于接种二级种子罐培养，接种量为体积比5‐20％v/v，二级种子罐培养用于接种发酵种子罐，接种量为体积比5‐20％v/v。

根据本发明所述的方法，制作所述形态控制剂的工艺为取木质纤维素、秸秆、麸皮、大豆纤维中的一种，经过粉碎、酸解、脱毒、过滤、灭菌得到，其特征在于：脱毒剂为重质碳酸钙、轻质碳酸钙、氢氧化钙、氧化钙中的一种或者多种。

根据本发明所述的方法，制作所述形态控制剂的原料为大豆纤维和麸皮的混合物，其质量比例为大豆纤维：麸皮为1:1‐3。

根据本发明所述的方法，制作所述形态控制剂的工艺为，粉碎、酸解、中和、过滤、灭菌。

根据本发明所述的方法，形态控制剂的制作工艺具体为：物料粉碎为60‐80目，按质量比为物料:水分为1：1‐2v/w进行混合，按照物料干重的2‐10％加入稀硫酸，温度为80‐10℃，酸解0.5‐2h；酸解后取滤液，加入脱毒剂，调整到pH值大于11，过滤取滤液。

根据本发明所述的方法，制作所述形态控制剂的工艺为粉碎、添加轻质碳酸钙，分解，过滤所述轻质碳酸钙的添加量为原料总重的5‐10％。

本发明所带来的有益效果为：

一、通过接种物以及发酵过程中菌体形态的控制，使得菌体能够在高产的状态下进行L-乳酸的生长合成，使得生产的效率提高。

二、形态控制剂的使用，有利于发酵环境中酸度的控制，在利用碱性物质进行脱毒过滤以后，形态控制剂呈碱性，灭菌后其形态控制剂中会出现微球一样的微粒子，微粒子可溶于酸性溶液中，在乳酸发酵的酸性环境中利于发酵体系酸度的控制，进而减少对菌株的发酵抑制，从而增产。

三、由于乳酸目前普遍采用钙盐法生产提纯，其形态控制剂中钙离子的提前引入并不会对后提造成影响，但是钙离子在菌株早期生长中会对其菌体的生长起到良好的促进作用，利于米根霉孢子的萌发以及分支的产生。

四、发明人发现了形态控制剂对于菌体形态控制的现象，观察到形态控制剂对菌体形态的影响，并通过有益的探索找到控制菌体形态的方案，但是由于菌体形态为微生物活动综合的体现，仍然为非常复杂的微生物活动的表现，其机理还待进一步研究。

附图说明

图1为未添加形态控制剂的菌体形态图。

其中，图1A是种子培养阶段菌体形态图；

图1B是发酵阶段菌体形态图；

图1C是絮状形态电镜图。

图2为添加形态控制剂菌体的形态电镜图。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明所述工艺以及材料进行详细说明。

实施例1

本实施例说明利用玉米秸秆制作形态控制剂的工艺

取全玉米秸秆，用粉碎机将秸秆粉碎至60-80目，过筛，取粉末；按照固体比按质量比为1物料(体积):1-2(质量)水分进行混合，按照物料干重的2-10％加入稀硫酸，温度为80-10℃，时间为0.5-2h；酸解后取滤液，加入碳酸钙，调整到pH值大于11，过滤取滤液酸解，待用。

实施例2

本实施例说明利用麸皮制作形态控制剂的工艺

取麸皮进行粉碎，过60-80目筛，按体积：质量比1物料:1-2水分进行混合，按照物料干重的2-10％加入稀硫酸，温度为80-10℃，时间为0.5-2h；酸解后取滤液，加入碳酸钙，调整到pH值大于11，过滤取滤液酸解，待用。

实施例3

本实施例说明利用大豆纤维及其复配物制作形态控制剂的工艺

取大豆纤维，粉碎，按体积：质量比1物料:1-2水分进行混合，按照物料干重的2-10％加入稀硫酸，温度为80-10℃，时间为0.5-2h；酸解后取滤液，加入碳酸钙，调整到pH值大于11，过滤取滤液酸解，待用。

豆纤维和麸皮的混合物，其质量比例为大豆纤维：麸皮为1:1-3，粉碎、添加添加量为原料总重的5-10％轻质碳酸钙，分解，过滤取滤液待用。

实施例4

本实施例说明利用米根霉生产L-乳酸的生产工艺

本实施例所采用的菌株为米根霉R.oryzae LA-UN-1，由菌株R.oryzae NRRL 395诱变得到。

在不添加菌体形态控制剂的工艺中，采用多级扩大培养的方式进行乳酸的生产，首先经过固体培养获得用于生产乳酸的孢子，在一级培养中，培养基经灭菌接入孢子，在培养8-12h后接入二级培养罐，二级培养罐经12-24h后接入发酵罐。一级接二级以及二级接发酵培养的接种量为10％。

其中，一级培养培养基，葡萄糖含量为10％，玉米浆含量为1g/L，磷酸二氢钾含量为1g/l，培养条件为37℃，自然pH；通风1vvm，搅拌200转/min；一级种子培养基中孢子接种浓度为10⁹个/L。

二级培养的培养基为，玉米糖化醪，折合葡萄糖含量为4％，黄豆并饼粉含量为2g/l，培养条件为37℃，自然pH；通风0.5vvm，搅拌100转/min；

发酵培养基为，玉米糖化醪，折合葡萄糖含量为12％，培养条件为37℃，自然pH；通风0.1vvm，搅拌50转/min；

其中，各阶段的培养基在接入之前，将其在121℃灭菌30min并冷却至37℃。

在生产的过程中，取样检测各培养阶段的菌体形态。发现，一级培养基中的形态特征为絮状，二级培养基中形态呈现絮状，发酵培养中的形态也呈现絮状。

当糖浓度不再减小时，发酵结束，检测发酵液中L-乳酸的浓度为38g/L。

实施例5

本实施例说明利用米根霉生产L-乳酸的生产工艺

(a)孢子固体培养基培养

取米根霉孢子液或者菌体接种于PDA固体培养平板或者茄子瓶中，置于培养箱，37℃培养5-7天，待平板或者茄子瓶表面变为黑色，用无菌生理盐水洗涤孢子，洗涤完成后采用八层纱布过滤，过滤后的孢子液用玻璃珠打散并用血球板计数法计数。

(b)一级种子罐培养

配置一级种子罐培养基，其包括葡萄糖8％，尿素2g/L，磷酸二氢钾含量为2g/L，并在一级种子培养基中添加实施例1所制备的形态控制剂，其添加的浓度为发酵培养基质量的5％。一级种子培养基中孢子接种浓度为10⁹个/L。

培养条件为自然pH；通风0.5vvm，搅拌100转/min；培养时间为12h。

(c)二级种子罐培养

配置二级种子罐培养基，其包括葡萄糖10％，玉米饼粉2g/L，磷酸二氢钾含量为2g/L，并在一级种子培养基中添加实施例1所制备的形态控制剂，其添加的浓度为发酵培养基质量的4％。

培养条件为自然pH；通风0.8vvm，搅拌50转/min；培养时间为18h。

(d)发酵罐培养

配置发酵罐培养基，其包括玉米糖化醪折合葡萄糖含量为20％，玉米浆1g/L，发酵培养基中添加实施例1所制备的形态控制剂，其添加的浓度为发酵培养基质量的0.1％。

检测一级种子罐、二级种子罐、发酵罐中的菌体形态直径，其检测结果显示：一级种子罐中菌体形态为球状，当量直径为0.52mm；二级种子罐菌体形态为球状，当量直径为0.8mm；发酵罐菌体形态为球状，当量直径为1.03mm；

培养条件为自然pH；通风0.1vvm，搅拌50转/min。

当糖浓度不再减小时，发酵结束，检测发酵液中L-乳酸的浓度为65g/L。

实施例6

本实施例说明利用米根霉生产L-乳酸的生产工艺

(a)孢子固体培养基培养

(b)一级种子罐培养

配置一级种子罐培养基，其包括玉米糖化醪，折合葡萄糖含量为6％，黄豆饼粉1g/L，磷酸二氢钾含量为2g/L，并在一级种子培养基中添加实施例2所制备的形态控制剂，其添加的浓度为发酵培养基质量的3％。

(c)二级种子罐培养

配置二级种子罐培养基，其包括葡萄糖10％，玉米饼粉2g/L，磷酸氢二钠含量为2g/L，并在一级种子培养基中添加实施例2所制备的形态控制剂，其添加的浓度为发酵培养基质量的2％。

(d)发酵罐培养

配置发酵罐培养基，其包括玉米糖化醪，葡萄糖含量为15％，玉米浆1g/L发酵培养基中添加实施例2所制备的形态控制剂，其添加的浓度为发酵培养基质量的0.2％。

检测一级种子罐、二级种子罐、发酵罐中的菌体形态直径，其检测结果显示：一级种子罐中菌体形态为球状，当量直径为0.7mm；二级种子罐菌体形态为球状，当量直径为0.9mm；发酵罐菌体形态为球状，当量直径为1.83mm；

发酵结束，检测发酵液中L-乳酸的浓度为60g/L。

实施例7

本实施例说明利用米根霉生产L-乳酸的生产工艺

(a)孢子固体培养基培养

(b)一级种子罐培养

(c)二级种子罐培养

(d)发酵罐培养

配置发酵罐培养基，其包括玉米糖化醪葡萄糖含量为18％，玉米浆1g/L，发酵培养基中添加实施例2所制备的形态控制剂，其添加的浓度为发酵培养基质量的0.2％。

检测一级种子罐、二级种子罐、发酵罐中的菌体形态直径，其检测结果显示：一级种子罐中菌体形态为球状，当量直径为0.8mm；二级种子罐菌体形态为球状，当量直径为1.1mm；发酵罐菌体形态为球状，当量直径为1.98mm；

发酵结束，检测发酵液中L-乳酸的浓度为68g/L。

实施例8-12说明利用米根霉生产L-乳酸的生产工艺

在实施例8-12中，孢子培养采用与实施例5步骤(a)所得到的孢子培养液。

其中实施例8中，一级培养与二级培养采用与实施例(5)相同的步骤，在发酵培养中采用淀粉质原料进行乳酸发酵，包括玉米淀粉、木薯淀粉，由于本菌株在发酵过程中能够产生糖化酶，其可以利用淀粉代谢生产乳酸。其他的培养基以及培养条件与实施例5相同。

在实施例9中，一级培养基中采用了纤维素酶解液进行种子培养，所述的纤维素酶解液采用现有技术中蒸汽爆破、经酶解得到；其葡萄糖浓度为10％。

在实施例10中，将一级培养基中的氮源换为硝酸铵、碳酸铵，其培养基以及浓度以及培养方法与实施例5相同。

在实施例11中，将二级培养基中的氮源换为鱼粉、酵母膏，其他条件与实施例5相同。

在实施例12中，将发酵培养中的培养基换做纤维素酶解液，其浓度折合葡萄糖为20％，其他条件与实施例5相同。

实施例8-12检测及发酵结果如表1所示

表1实施例8-12检测及发酵结果

实施例	菌体形态	一级培养直径	二级培养直径	发酵培养直径	乳酸浓度
						实施例8	球状	0.61mm	0.89mm	1.28mm	63g/L。
实施例9	球状	0.55mm	0.78mm	0.90mm	61g/L。
						实施例10	球状	0.85mm	1.14mm	1.82mm	65g/L。
实施例11	球状	0.62mm	1.21mm	2.2mm	67g/L。
						实施例12	球状	0.64mm	0.98mm	1.5mm	63g/L。

实施例13

本实施例说明菌体形态、菌体直径的检测统计方法以及葡萄糖、乳酸的检测方法。

菌体形态的检测采用显微镜镜检的方式。孢子培养、一级种子培养、二级种子培养一级发酵培养阶段的检测：分别将孢子液取样；在一级种子培养液、二级种子培养液进行移种之前进行取样；发酵培养液发酵培养结束后，进行后提取处理之前，进行取样。对取样的样品采用5mL破口移液管，移于洁净的玻璃平皿中，吸取洁净的蒸馏水10mL进行稀释，获得稀释后的含菌体培养液。然后用破口移液枪移取1mL稀释液与载玻片上，置于显微镜下进行检测观察。获得菌体的形态。菌体按其呈现的状态，分为将其分为絮状、团块状、球状及其组合。当菌体为球状时候，进行菌体直径的统计检测。在载玻片上朝一个方向，随机选取视野中的50个菌球，并用CCD相机进行拍照记录，选取照片并用image J进行菌球直径的分析统计。其中，image J统计所选取菌球的当量面积，并按照菌球为球形的当量面积这算菌球的当量直径，取所选菌球当量直径的平均值。

葡萄糖以及乳酸浓度采用高效液相色谱法进行检测。分析条件为Aminex HPX-87HIon Exclusion Column 300mm×7.8mm,Bio-Rad，进样量20μL，流动相0.005M H₂SO₄；流速，0.8mL/min，柱温60℃。

对比实施例1-2

对比实施例1对比说明不同的形态对发酵及产酸的情况

对比实施例1采用实施例4所述的培养基以及方法进行米根霉种子的培养与发酵，其不同之处在于，在种子培养基以及发酵培养基中加入如实施例3所述的豆纤维和麸皮的混合物水解液作为形态控制剂进行乳酸的发酵。对比实施例的实施情况见表2。

对比实施例2对比说明采用不同的形态控制剂对发酵形态及产酸的情况

对比实施例2采用实施例5所述的培养基以及方法进行米根霉种子的培养与发酵，其不同之处在于，在种子培养基以及发酵培养基中加入如实施例3所述的豆纤维和麸皮的混合物水解液作为形态控制剂进行乳酸的发酵。对比实施例的实施情况见表2。

表2对比实施例检测及发酵结果

实施例	菌体形态	一级培养直径	二级培养直径	发酵培养直径	乳酸浓度
						对比实施例1	球状	0.55mm	0.75mm	0.98mm	63g/L。
对比实施例2	球状	0.72mm	0.88mm	1.31mm	68g/L。

Claims

1.一种控制米根霉生长形态产L-乳酸的方法，发酵步骤依次为：

（a）孢子固体培养基培养（b）一级种子罐培养（c）二级种子罐培养（d）发酵罐培养，发酵罐菌体形态当量直径为0.4-2.2 mm;

其中,一级种子罐培养的培养基配方为：葡萄糖、玉米淀粉、木薯淀粉、玉米糖化醪、纤维素酶解液中的一种或者几种折合葡萄糖含量为1-8%，尿素、硝酸铵、碳酸铵、黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉或酵母膏中的一种或几种含量为1-5g/L，磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种含量为1-5 g/l;

二级种子罐培养的培养基配方为：葡萄糖、玉米淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉糖化醪、纤维素酶解液中的一种或者几种折合葡萄糖含量为1-10%，尿素、硝酸铵、碳酸铵、黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉或酵母膏中的一种或几种含量为1-2g/L，磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种含量为1-3 g/l，

发酵培养的培养基配方为：葡萄糖、玉米淀粉、木薯淀粉、玉米糖化醪、纤维素酶解液中的一种或者几种折合葡萄糖含量为1-20%；

其特征在于：一级种子罐中菌体形态当量直径为0.5-0.8 mm；且二级种子罐菌体形态当量直径为0.5-1.2 mm；

还包括，在一级培养、二级培养、发酵培养培养基中都添加了形态控制剂；

其中，在一级培养中，形态控制剂的添加量为发酵培养基质量的0.5-10%;

在二级培养中，形态控制剂的添加量为发酵培养基质量的0.5-10%;

在发酵培养中，形态控制剂的添加量为发酵培养基质量的0.1-5%；

还包括，制作所述形态控制剂的原料为大豆纤维和麸皮的混合物，其质量比例为大豆纤维：麸皮为1:1-3；且该形态控制剂的制作工艺具体为：物料粉碎为60-80目，按质量比为物料:水分为1：1-2v/w进行混合，按照物料干重的2-10%加入稀硫酸，温度为80-10℃，酸解0.5-2h；酸解后取滤液，加入轻质碳酸钙脱毒剂，且所述轻质碳酸钙的添加量为原料总重的5-10%，调整到pH值大于11，过滤取滤液，灭菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一级种子培养基的配方为，葡萄糖或者玉米淀粉糖化醪折合葡萄糖含量为4-8%，玉米浆含量为1-2g/L，形态控制剂的添加量为2%；

所述二级种子培养基的配方为玉米淀粉糖化醪葡萄糖含量为4-8%，形态控制剂添加量为1%；所述发酵培养基培养为：玉米淀粉糖化醪，形态控制剂添加量为0.1%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一级种子培养基的培养条件为37℃，自然pH；所述一级种子罐的培养条件为，通风0.1-1 vvm，搅拌50-200 转/min；所述二级种子罐的培养条件为，通风0.1-0.5 vvm，搅拌50-100 转/min；所述发酵罐培养的培养条件为，通风0.1-0.3 vvm，搅拌50-100 转/min；

其中，一级种子罐培养用于接种二级种子罐培养，接种量为体积比5-20% v/v；

二级种子罐培养用于接种发酵种子罐，接种量为体积比5-20% v/v。