CN101497901A - 米根霉半连续高密度发酵产高光学纯度l-乳酸新工艺方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了米根霉半连续高密度发酵产高光学纯度L－乳酸新工艺，涉及如下步骤：(1)制备米根霉孢子悬液，(2)制备种子培养液，(3)高密度菌体的扩增，(4)500L发酵罐首批发酵，(5)500L罐半连续高密度发酵－前5次增殖菌体重复发酵，(6)500L罐半连续后20次高密度高强度重复发酵。本发酵工艺中通过重复利用米根霉菌体，成功实现了半连续发酵，提高了原料利用率；通过菌体高密度的构建，使发酵周期缩短至18h，发酵强度提高到5.0g/(h·L)，工业生产具有很好的前景；发酵产物L－乳酸光学纯度在99.5％以上，满足食品医药的要求，工业化生产后能够很大程度上缓解当前对高光学纯度 L－乳酸的需求。

Description

米根霉半连续高密度发酵产高光学纯度L-乳酸新工艺方法

技术领域

本发明属于微生物与发酵工程领域，具体地说涉及米根霉半连续发酵产高光学纯度L-乳酸工艺。

背景技术

乳酸是一种常见的结构简单的羟基羧酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物体内。乳酸按构象分为D型和L型，人体只能代谢L-乳酸，因此世界卫生组织提倡在食品及医药行业使用L-乳酸取代目前广泛使用的DL-乳酸。L-乳酸、L-乳酸盐及其衍生物广泛应用于食品、医药、饲料、化工等领域。尤其是近年来，人们利用乳酸聚合生产出的可生物降解塑料、绿色包装材料及农用薄膜，可以有效的解决日益严重的环境污染问题。随着聚乳酸的发展和应用，生产聚乳酸的原料—L-乳酸的需求量越来越大；由于乳酸相对于其他酸有无可比拟的安全性，已经在多方面替代了柠檬酸等在啤酒等生产中的应用，随着乳酸应用范围的不断拓宽及其需求量的不断增大，乳酸的生产研究就显得越来越重要。

乳酸的生产主要有化学合成法、酶转化法和发酵法。其中无毒无害的发酵生产法被广泛推广。根据发酵菌种的不同又分为细菌发酵和霉菌(主要为根霉)发酵，由于根霉发酵生产乳酸具有光学纯度高，菌体易与发酵液分离等特点，因此利用米根霉发酵生产L-乳酸成为该领域大规模生产L-乳酸的趋势。但是目前L-乳酸的生产普遍采用分批发酵工艺，一方面米根霉菌体处于游离或者固定化状态，发酵结束时大量健壮的菌体得不到有效的重复利用，菌体利用时间低，一般仅利用60～72小时；另一方面发酵罐中菌体浓度不高，一般为5g/L～7g/L；由此使得分批发酵时间延长，发酵强度很低，在2.5g/(h·L)以下；同时由于米根霉的菌丝发达，在罐内易缠绕在搅拌轴上，使搅拌阻力增大，甚至形成结团，包埋碳酸钙和碳源，使得原料转化率不能提高，一般在75％左右。因此对米根霉进行半连续高密度发酵具有重要理论和现实意义。

目前，国内外对米根霉发酵生产L-乳酸的研究开展广泛。Yu RC等对米根霉直接转化农产品原料生产L(+)-乳酸进行了研究，以碳酸钙为中和剂，每千克粗淀粉原料(玉米)可生成350g以上的L(+)-乳酸。蒋明珠采用自行选育的米根霉R-47菌株，35℃摇瓶培养48h，初始葡萄糖质量分数15％时产乳酸118.4g/L，糖转化率达78.9％。Yu等研究了用米根霉直接发酵农产品生产L(+)-乳酸的动力学，发现玉米和大米的产酸性能高于大麦、燕麦和木薯等，探讨了适宜的底物浓度、发酵温度、碳酸钙加入量对乳酸生产过程的影响。姜绍通、郑志等在对米根酶菌株诱变的基础上，确定发酵控制参数，深入分析和讨论了代谢途径。潘利军等研究了米根霉发酵代谢关键酶——乳酸脱氢酶的催化特性，通过金属离子调控其活性，取得了很好的实际效果。李兴江等研究了米根霉As3.819发酵甘薯淀粉生产L-乳酸的最适条件。罗水忠、肖小发等利用同步辐射软X射线对米根霉As3.819进行诱变，并研究了诱变菌株的发酵特性。

建立在无载体固定化技术基础上的半连续发酵，是在每批罐发酵终点时，分离取出发酵液，保留成熟、代谢旺盛的无载体固定化菌体细胞，添加新鲜的培养基，使菌体连续发酵。D.Hekmat等指出细胞循环使用的主要优点是在生物反应器的时间和空间上增加活性生物量，实现更高效率的转化率。Ja′n Marta′k等利用少根根霉在机械搅拌式发酵罐中实现了半连续发酵生产L—乳酸，使发酵时间延长至240h，平均乳酸生产率为2.31kg/(m³h)，总收率为67.3％，平均pH值为5.30。

高密度培养技术(High-cell-density cultivation，HCDC)，也就是高密度发酵技术，提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)。D.Riesenberg等提出高密度发酵不仅可以减少培养体积、强化下游分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高产品在市场上的竞争力。ChoiJH等用重组大肠杆菌HBIOI和KS272生产碱性磷酸酶时，采取了pH-stat的补料策略，设定pH为6.8，当由于葡萄糖的消耗导致pH升高一定值时，就会自动流加补料液以增加培养液中的葡萄糖浓度，实验中两种菌株所达到的最大细胞量分别约为55gDCW/L和45gDCW/L。

在米根霉的半连续发酵产L-乳酸工艺中，菌体密度是影响发酵效率的关键因素，通过控制菌体密度和菌体形态达到高强度发酵，有利于提高乳酸的产量，为缓和当前严峻的乳酸需求有非常重要的意义。产物和菌体的分离常常是发酵成败的关键和难点，米根霉深层发酵生产L-乳酸过程中，菌体形态复杂，多以丝状、片状、球体、团状、絮状、结块等形态生长，通过控制菌体组成，使菌体大部分由菌丝球组成，调控粒径大小，减轻菌液分离负担，有利于成功实现半连续高密度发酵。因此米根霉半连续高密度发酵对L-乳酸产业意义重大。

发明内容

为了解决提高乳酸的产量中产物和菌体的分离的关键和难点问题，本发明提供一种运行成本低、发酵强度高、适于工业化生产的米根霉半连续高密度发酵产高光学纯度L-乳酸新工艺。

具体的工艺步骤如下：

米根霉半连续高密度发酵产高光学纯度L-乳酸新工艺方法包括下列操作步骤：

A、制备米根霉孢子悬液：

用接种环挑取保藏的米根霉3.819菌丝一环，接种至装在100ml三角瓶里由50mlPDA培养基制成的固体斜面上，在32℃恒温培养箱中培养72h，得到含有成熟米根霉孢子的菌丝一瓶，加入40ml无菌蒸馏水，用玻璃棒打成熟米根霉孢子，得到成熟米根霉孢子浓度在5×10¹⁰～10¹¹个/L的孢子悬液；

上述PDA培养基由下列重量配比的物质组成：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L；

B、制备高密度种子培养液：

将孢子悬液40ml接种至装有4L种子培养基的7L磁力搅拌发酵罐，控制通气流量1.75L/(L·min)，搅拌转速300r/min，温度32℃培养24h，得到4L种子培养液；

上述种子培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖120g/L、硫酸铵4g/L、磷酸二氢钾0.45g/L、硫酸锌0.44g/L、硫酸镁0.25g/L、碳酸钙20g/L；

C、高密度菌体的扩增：

将4L种子培养液，在无菌操作的条件下转接至装有35L菌体扩增培养基的50L磁力搅拌发酵罐，控制通气流量1.0L/(L·min)，搅拌转速400r/min，温度32℃，发酵培养36h，得到35L高密度菌体培养液；

上述菌体扩增培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖120g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、磷酸二氢钠0.2g/L、硫酸锌0.22g/L、硫酸镁0.25g/L、碳酸钙40g/L；

D、500L发酵罐首批发酵：

将35L高密度菌体培养液，在无菌操作的条件下转接至装有375L发酵培养基的500L机械搅拌罐，控制通气流量至2.0L/(L·min)，搅拌速度300r/min，温度32℃，发酵培养36h，实现菌体细胞的更新与扩增，得到的发酵液中菌体干重达到10g/L；再控制通气2.5L/(L·min)继续培养发酵，温度32℃，发酵培养60h，得到首批发酵液，首批发酵液L-乳酸浓度为102g/L，葡萄糖转化率为85％，发酵液中菌体干重为15g/L；

首批发酵结束进行取料，取料步骤为：将首批发酵液静置20min，保持发酵罐压力0.1个大气压，发酵液中的菌体由于自重沉降至发酵罐底部，通过发酵罐内的压力压出发酵上清液360L，菌体保留在发酵罐底部；得到保留在发酵罐底部的菌体，该菌体大部分为菌丝球，直径在0.5mm～4.0mm；

上述发酵培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖120g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、磷酸二氢钠0.2g/L、硫酸锌0.22g/L、硫酸镁0.25g/L、碳酸钙60g/L；

E、500L罐半连续高密度发酵-前5次增殖菌体重复发酵：

补料：将360L补料培养基，在无菌操作的条件下补入步骤D取料结束后含有菌体的发酵罐中；

重复发酵：补料步骤之后的发酵罐，控制通气3.0L/(L·min)，控制搅拌速度350r/min，温度32℃，发酵24h，得到发酵液及菌体；

重复取料：重复上述步骤D中的取料步骤：将重复发酵24h得到的发酵液及菌体静置20min，保持发酵罐压力0.1个大气压，发酵液中的菌体由于自重沉降至发酵罐底部，通过发酵罐内的压力压出发酵上清液360L，菌体保留在发酵罐底部；得到保留在发酵罐底部的菌体，该菌体大部分为菌丝球，直径在0.5mm～4.0mm；

如此反复补料、重复发酵、重复取料共五次，每次得到发酵液，该发酵液L-乳酸浓度为85g/L～90g/L，葡萄糖转化率为85％以上，得到保留在发酵罐底部的菌体，该菌体大部分为菌丝球，直径在0.5mm～4.0mm，其中第一次重复发酵结束时发酵液中L-乳酸浓度为90g/L，葡萄糖转化率为85％，菌体干重为17g/L，第5次重复发酵得到的发酵液中菌体干重为25g/L；

上述补料培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖100g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、硫酸锌0.22g/L、硫酸镁0.25g/L、碳酸钙50g/L；

F、500L罐进行半连续后20次高密度高强度重复发酵：

重复上述步骤E，培养基为高强度发酵培养基，发酵过程中的通气量为2.5L/(L·min)，搅拌速度改为250r/min，温度32℃，每次重复发酵时间为18h，每次重复发酵结束时得到发酵液及菌体，该发酵液L-乳酸浓度为85g/L～90g/L，葡萄糖转化率为85％以上，发酵强度稳定在4.7～5.0g/(h·L)；得到保留在发酵罐底部的菌体，该菌体大部分为菌丝球，直径在0.5mm～4.0mm，其中第25次取料前发酵液中菌体干重为35g/L；

上述高强度发酵培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖100g/L、硫酸铵1g/L、磷酸二氢钾0.05g/L、硫酸锌0.11g/L、硫酸镁0.15g/L、碳酸钙50g/L。

本发明的米根霉半连续高密度发酵与传统固定化及游离发酵相比，具有菌体浓度高、发酵强度高、菌体可反复使用等优点，并可得到高的目标产量和原料转化率，易于实现细胞与产物分离，有利于实现工艺过程的自动化、连续化，降低生产成本，具体表现在：(1)生物反应器内菌体密度高，最高可达35g/L，单批次发酵周期缩短为18～24h，发酵强度可以达到5.0g/(h·L)，有效地提高了生物反应器的使用效率；(2)菌体利用时间可以延长，并在保持高强度发酵的同时菌体不断增殖更新，避免了由于菌体的更新推迟发酵周期，大大缩短了由于菌体增殖使用的时间，在新老菌体交替中使得菌体使用时间延长至120h甚至更长时间；(3)较之游离发酵操作，发酵液中菌体残留量减少80％，减轻后续分离工作，且菌体从发酵液中分离十分容易；(4)菌丝球呈单个分离状态，避免在生物反应器内部的缠绕及包埋碳源等营养物质，有利于菌体对营养物质的吸收利用，提高原料利用率，葡萄糖转化率达到85％左右，稳定保持在80％以上；(5)半连续发酵操作简单，易于实现自动化生产。

附图说明

图1为米根霉半连续发酵从第1次到第25次重复发酵的葡萄糖转化率情况，从图中可以看出在最后几个批次发酵过程中，葡萄糖转化率仍然很高，达到85％。

图2为米根霉半连续发酵前5次重复发酵得到菌体的形态，通过图中可以看出菌体大部分为菌丝球，含有少量的菌丝体、及菌丝碎片。

图3为米根霉半连续发酵第18次重复发酵得到菌体的形态，通过图中可以看出菌体中含有部分菌丝球、部分菌丝碎片和少量新生菌丝。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地描述。

实施例：

米根霉半连续高密度发酵产高光学纯度L-乳酸新工艺方法包括下列操作步骤：

(1)制备米根霉孢子悬液：

用接种环挑取保藏的米根霉3.819菌丝一环，接种至装在100ml三角瓶里由50mlPDA培养基制成的固体斜面上，在32℃恒温培养箱中培养72h，得到含有成熟米根霉孢子的菌丝一瓶，加入40ml无菌蒸馏水，用玻璃棒打成熟米根霉孢子，得到成熟米根霉孢子浓度在5×10¹⁰～10¹¹个/L的孢子悬液。

上述PDA培养基由下列重量配比的物质组成：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L。

(2)制备高密度种子培养液：

将孢子悬液40ml接种至装有4L种子培养基的7L磁力搅拌发酵罐，控制通气流量1.75L/(L·min)，搅拌转速300r/min，温度32℃培养24h，得到4L种子培养液。

上述种子培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖120g/L、硫酸铵4g/L、磷酸二氢钾0.45g/L、硫酸锌0.44g/L、硫酸镁0.25g/L、碳酸钙20g/L。

(3)高密度菌体的扩增：

将4L种子培养液，在无菌操作的条件下转接至装有35L菌体扩增培养基的50L磁力搅拌发酵罐，控制通气流量1.0L/(L·min)，搅拌转速400r/min，温度32℃，发酵培养36h，得到35L高密度菌体培养液。

上述菌体扩增培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖120g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、磷酸二氢钠0.2g/L、硫酸锌0.22g/L、硫酸镁0.25g/L、碳酸钙40g/L。

(4)500L发酵罐首批发酵：

将35L高密度菌体培养液，在无菌操作的条件下转接至装有375L发酵培养基的500L机械搅拌罐，控制通气流量至2.0L/(L·min)，搅拌速度300r/min，温度32℃，发酵培养36h，实现菌体细胞的更新与扩增，得到的发酵液中菌体干重达到10g/L；再控制通气2.5L/(L·min)继续培养发酵，温度32℃，发酵培养60h，得到首批发酵液，首批发酵液L-乳酸浓度为102g/L，葡萄糖转化率为85％，发酵液中菌体干重为15g/L。

首批发酵结束进行取料，取料步骤为：将首批发酵液静置20min，保持发酵罐压力0.1个大气压，发酵液中的菌体由于自重沉降至发酵罐底部，通过发酵罐内的压力压出发酵上清液360L，菌体保留在发酵罐底部；得到保留在发酵罐底部的菌体，该菌体大部分为菌丝球，直径在0.5mm～4.0mm。

上述发酵培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖120g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、磷酸二氢钠0.2g/L、硫酸锌0.22g/L、硫酸镁0.25g/L、碳酸钙60g/L。

(5)500L罐半连续高密度发酵-前5次增殖菌体重复发酵：

补料：将360L补料培养基，在无菌操作的条件下补入步骤D取料结束后含有菌体的发酵罐中。

重复发酵：补料步骤之后的发酵罐，控制通气3.0L/(L·min)，控制搅拌速度350r/min，温度32℃，发酵24h，得到发酵液及菌体，该发酵液L-乳酸浓度为90g/L，葡萄糖转化率为85％，发酵液中菌体干重为17g/L。

重复取料：重复上述步骤D中的取料步骤：将发酵24h得到的发酵液及菌体静置20min，保持发酵罐压力0.1个大气压，发酵液中的菌体由于自重沉降至发酵罐底部，通过发酵罐内的压力压出发酵上清液325L，菌体保留在发酵罐底部；得到保留在发酵罐底部的菌体，该菌体大部分为菌丝球，直径在0.5mm～4.0mm。

如此反复补料、重复发酵、重复取料共五次，每次得到发酵液，该发酵液L-乳酸浓度为85g/L～90g/L，葡萄糖转化率为85％以上，得到保留在发酵罐底部的菌体，该菌体大部分为菌丝球，直径在0.5mm～4.0mm，其中第5次取料前发酵液中菌体干重为25g/L。

上述补料培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖100g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、硫酸锌0.22g/L、硫酸镁0.25g/L、碳酸钙50g/L。

(6)500L罐进行半连续后20次高密度高强度重复发酵：

重复上述步骤E，培养基为高强度发酵培养基，发酵过程中的通气量为2.5L/(L·min)，搅拌速度改为250r/min，温度32℃，每次重复发酵时间为18h，每次重复发酵结束时得到发酵液及菌体，该发酵液L-乳酸浓度为85g/L～90g/L，葡萄糖转化率为85％以上，发酵强度稳定在4.7～5.0g/(h·L)；得到保留在发酵罐底部的菌体，该菌体大部分为菌丝球，直径在0.5mm～4.0mm，其中第25次取料前发酵液中菌体干重为35g/L。

上述高强度发酵培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖100g/L、硫酸铵1g/L、磷酸二氢钾0.05g/L、硫酸锌0.11g/L、硫酸镁0.15g/L、碳酸钙50g/L。

Claims (1)

1、米根霉半连续高密度发酵产高光学纯度L-乳酸新工艺方法，其特征在于包括下列操作步骤：

A、制备米根霉孢子悬液：

用接种环挑取保藏的米根霉3.819菌丝一环，接种至装在100ml三角瓶里由50mlPDA培养基制成的固体斜面上，在32℃恒温培养箱中培养72h，得到含有成熟米根霉孢子的菌丝一瓶，加入40ml无菌蒸馏水，用玻璃棒打成熟米根霉孢子，得到成熟米根霉孢子浓度在5×10¹⁰～10¹¹个/L的孢子悬液；

上述PDA培养基由下列重量配比的物质组成：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L；

B、制备高密度种子培养液：

将孢子悬液40ml接种至装有4L种子培养基的7L磁力搅拌发酵罐，控制通气流量1.75L/(L·min)，搅拌转速300r/min，温度32℃培养24h，得到4L种子培养液；

上述种子培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖120g/L、硫酸铵4g/L、磷酸二氢钾0.45g/L、硫酸锌0.44g/L、硫酸镁0.25g/L、碳酸钙20g/L；

C、高密度菌体的扩增：

将4L种子培养液，在无菌操作的条件下转接至装有35L菌体扩增培养基的50L磁力搅拌发酵罐，控制通气流量1.0L/(L·min)，搅拌转速400r/min，温度32℃，发酵培养36h，得到35L高密度菌体培养液；

上述菌体扩增培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖120g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、磷酸二氢钠0.2g/L、硫酸锌0.22g/L、硫酸镁0.25g/L、碳酸钙40g/L；

D、500L发酵罐首批发酵：

将35L高密度菌体培养液，在无菌操作的条件下转接至装有375L发酵培养基的500L机械搅拌罐，控制通气流量至2.0L/(L·min)，搅拌速度300r/min，温度32℃，发酵培养36h，实现菌体细胞的更新与扩增，得到的发酵液中菌体干重达到10g/L；再控制通气2.5L/(L·min)继续培养发酵，温度32℃，发酵培养60h，得到首批发酵液，首批发酵液L-乳酸浓度为102g/L，葡萄糖转化率为85％，发酵液中菌体干重为15g/L；

首批发酵结束进行取料，取料步骤为：将首批发酵液静置20min，保持发酵罐压力0.1个大气压，发酵液中的菌体由于自重沉降至发酵罐底部，通过发酵罐内的压力压出发酵上清液360L，菌体保留在发酵罐底部；得到保留在发酵罐底部的菌体，该菌体大部分为菌丝球，直径在0.5mm～4.0mm；

上述发酵培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖120g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、磷酸二氢钠0.2g/L、硫酸锌0.22g/L、硫酸镁0.25g/L、碳酸钙60g/L；

E、500L罐半连续高密度发酵-前5次增殖菌体重复发酵：

补料：将360L补料培养基，在无菌操作的条件下补入步骤D取料结束后含有菌体的发酵罐中；

重复发酵：补料步骤之后的发酵罐，控制通气3.0L/(L·min)，控制搅拌速度350r/min，温度32℃，发酵24h，得到发酵液及菌体；

重复取料：重复上述步骤D中的取料步骤：将重复发酵24h得到的发酵液及菌体静置20min，保持发酵罐压力0.1个大气压，发酵液中的菌体由于自重沉降至发酵罐底部，通过发酵罐内的压力压出发酵上清液360L，菌体保留在发酵罐底部；得到保留在发酵罐底部的菌体，该菌体大部分为菌丝球，直径在0.5mm～4.0mm；

如此反复补料、重复发酵、重复取料共五次，每次得到发酵液，该发酵液L-乳酸浓度为85g/L～90g/L，葡萄糖转化率为85％以上，得到保留在发酵罐底部的菌体，该菌体大部分为菌丝球，直径在0.5mm～4.0mm，其中第一次重复发酵结束时发酵液中L-乳酸浓度为90g/L，葡萄糖转化率为85％，菌体干重为17g/L，第5次重复发酵得到的发酵液中菌体干重为25g/L；

上述补料培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖100g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、硫酸锌0.22g/L、硫酸镁0.25g/L、碳酸钙50g/L；

F、500L罐进行半连续后20次高密度高强度重复发酵：

重复上述步骤E，培养基为高强度发酵培养基，发酵过程中的通气量为2.5L/(L·min)，搅拌速度改为250r/min，温度32℃，每次重复发酵时间为18h，每次重复发酵结束时得到发酵液及菌体，该发酵液L-乳酸浓度为85g/L～90g/L，葡萄糖转化率为85％以上，发酵强度稳定在4.7～5.0g/(h·L)；得到保留在发酵罐底部的菌体，该菌体大部分为菌丝球，直径在0.5mm～4.0mm，其中第25次取料前发酵液中菌体干重为35g/L；

上述高强度发酵培养基由下列重量配比的物质组成：葡萄糖100g/L、硫酸铵1g/L、磷酸二氢钾0.05g/L、硫酸锌0.11g/L、硫酸镁0.15g/L、碳酸钙50g/L。

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