CN1185336C - 里氏木霉菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种里氏木霉菌株及其用途。该菌株在PDA固体培养基上生长，形成的菌落特征为菌落呈棉絮状，菌落呈淡绿色，菌落边缘白色，整齐；生长速度快，菌丝白色，有隔膜，菌丝壁光滑，直径在2.0～5.0μm。分生孢子梗从菌丝的短侧枝发生，侧枝上对生。分生孢子梗呈瓶状，直立，无色，孢子呈球形，绿色，直径20～100μm。本发明的优点：1)培养方便，生长速度快，能在廉价的原料上生长；2)能同时产两种饲用酶制剂，β-葡聚糖酶和木聚糖酶；3)所产的β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性高；4)所产的β-葡聚糖酶和木聚糖酶为胞外酶，易于提取；5)该菌不产生有害物质，以它制备的β-葡聚糖酶和木聚糖酶是动物饲料的绿色添加剂。

Description

里氏木霉菌株及其用途

                           技术领域

本发明涉及一种里氏木霉菌株(Trichoderma reesei)及其用途。

                           背景技术

随着人们生活水平的提高，畜牧业也迅速发展。饲料成本是畜牧业生产的主要投入，占总成本的60-80％。目前，市场上销售饲料的能量原料主要是玉米。在众多的谷物类中，饲料厂家选用玉米的理由是玉米的能值和消化率较高，而相比之下，其它谷物如大麦、小麦、稻谷等及它们的副产品由于含有较高的抗营养物质，这就降低了他们的饲用价值。当然，这些谷物类饲料和它们的副产品也有自身的优点，首先粗蛋白含量较高，通常比玉米要高出1-6％，其次价格相对较低，再有，在制粒中适当添加小麦、次粉等可增加饲料粘结力，有利于颗粒成型等。此外，近年来，能量资源日益紧缺，预计到2020年将达到0.83亿吨左右，且玉米的生产受到地理条件的影响，因此这种单一的能量饲料势必影响畜牧业的可持续发展。

由于大麦、小麦、稻谷等及它们的副产品富含β-葡聚糖和木聚糖等抗营养因子，从而限制了其在饲料中的广泛应用。为此，国外在50年代末期就开始努力，研究酶制剂消除或抑制大麦、小麦、稻谷等抗营养因子的效果。许多国家已开发出了针对这些饲粮的NSP酶制剂，这类酶主要包括β-葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶。

β-葡聚糖酶特指β-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC.3.2.1.73)，其底物为β-1，3和β-1，4混合键连接的β-D-葡聚糖，主要分解大麦中的β-葡聚糖和细菌地衣多糖，所以又叫地衣多糖酶。其分解产物主要为3-O-β-纤维二糖-D-葡萄糖和3-O-β-纤维三糖-D-葡萄糖。

β-1，3-1，4-葡聚糖酶主要由植物(大麦、燕麦、小麦、稻谷)和微生物(木霉、芽孢杆菌和瘤胃中的一些微生物)产生。在籽实发芽过程中，糊粉层和盾片分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶以分解胚乳细胞壁中的β葡聚糖，使胚乳中的营养物质能被其他水解酶分解，从而保证种子正常发芽。

木聚糖酶可水解木糖苷键，分为β-1，4木聚糖酶与β-1，3木聚糖酶二类，陆上植物均属β-1，4木聚糖酶，而β-1，3木聚糖酶存在于海藻及海洋微生物中。木聚糖酶(1，4-β-xylanase，Ec.3，2，1，8)以内切方式水解木聚糖分子中β-1，4-木糖苷键，其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖。能产生木聚糖酶的微生物有细菌、黑曲霉、海枣曲霉、棒曲霉和木霉等，大多数木聚糖酶的最适pH和最适温度分别为4.0-7.0和50-60℃。

纤维素酶是一个多组分的酶系，至少包括三类不同性质的酶：(1)C₁酶：在天然纤维素的降解过程中起主导作用；(2)C_x酶：是作用于经C₁酶消化的纤维素，分解其β-1，4链，又称β-1，4-葡聚糖酶；(3)β-葡萄糖苷酶：可将纤维二糖，纤维三糖等短链低聚糖类分解生成葡萄糖。这些酶协调作用可将纤维降解为可被畜禽机体消化吸收的还原糖，从而提高饲料利用率。通常，木霉、镰刀霉产生的酶有很高的C₁活性，黑曲霉纤维素酶主要是C_x酶和β-葡萄糖苷酶，C₁的活性较低。纤维素酶的最适pH和最适温度为3.5-6.0和40-50℃(杨生武，1997)。

                           发明内容

本发明的目的是提供一种里氏木霉菌株(Trichoderma reesei)及其用途。

该菌株在PDA固体培养基上生长，形成的菌落特征为菌落呈棉絮状，菌落呈淡绿色，菌落扁平，高0.1～0.75mm，菌落边缘白色，整齐；生长速度快，48h菌落直径达1.0～8.5mm，72h达30～50mm；菌丝白色，有隔膜，菌丝壁光滑，直径在2.0～5.0μm。分生孢子梗从菌丝的短侧枝发生，侧枝上对生。分生孢子梗呈瓶状，直立，无色，孢子呈球形，绿色，直径20～100μm。

该菌株可在麦麸上生长，其主要代谢产物为β-葡聚糖酶和木聚糖酶，因此，它可用于生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶。

本发明的优点：

1)培养方便，生长速度快，能在廉价的原料上生长；

2)能同时产两种饲用酶制剂，β-葡聚糖酶和木聚糖酶；

3)所产的β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性高；

4)所产的β-葡聚糖酶和木聚糖酶为胞外酶，易于提取；

5)该菌不产生有害物质，以它制备的β-葡聚糖酶和木聚糖酶是动物饲料的绿色添加剂。

                           具体实施方式

1 菌种筛选和诱变

从土壤腐殖质中筛选到能在麦麸上生长的菌株41株，分别测定β-葡聚糖酶和木聚糖酶酶活性，同时具有这两种酶活性的菌株有12株，将纯化菌株点种在刚果红地衣多糖平板上，得到5株透明圈较大的菌株。

将这5株菌培养并制成单孢子悬浮液，分别进行紫外(30W紫外灯下30cm处照射60s)和辐射(Co⁶⁰辐照10s)和化学试剂(亚硝基胍终浓度1mg/ml，28静置60min)诱变，经诱变后将孢子涂布于初筛平皿，挑取形成清晰透明圈的菌株。然后再分别测定β-葡聚糖酶和木聚糖酶酶活性，发现有一株酶活性特别高，是原菌株的50倍。本发明的里氏木霉GXC已于2002年4月17日保藏在中国典型培养物保藏中心，登记入册编号为：CCTCC No M202017。

2 菌种鉴定

(1)形态特征

产生菌该菌株在PDA固体培养基上生长。形成的菌落特征为菌落呈棉絮状，菌落呈淡绿色，菌落扁平，高0.1～0.75mm，菌落边缘白色，整齐；生长速度快，48h菌落直径达1.0～8.5mm，72h达30～50mm；菌丝白色，有隔膜，菌丝壁光滑，直径在2.0～5.0μm。分生孢子梗从菌丝的短侧枝发生，侧枝上对生。分生孢子梗呈瓶状，直立，无色，孢子呈球形，绿色，直径20～100μm。该菌株可在麦麸上生长，主要代谢产物为β-葡聚糖酶和木聚糖酶。根据《AnIntroduction industrial mycology》(George Smith 1954)、《真菌鉴定手册》(魏景超1982)、《常见与常用真菌》(中科院微生物研究所1973)，鉴定该菌株为：里氏木霉(Trichoderma reesei)。

(2)培养特征

该菌株产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的最适pH分别为3.5～6.0和3.0～6.0；最适温度均为15～35℃。

3 液体发酵产酶条件

生产β-葡聚糖酶的液体发酵方法为：

(1)产β-葡聚糖酶的碳源为麸皮和木聚糖，氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和酵母膏；

(2)产酶促进剂：加入0.1～5.0％吐温80、吐温20和甜菜碱使β-葡聚糖酶和木聚糖酶酶活性提高0.5～5.0倍。

(3)产酶时间：发酵20～30h后，微生物开始分泌β-葡聚糖酶，至40～50h酶活性达到高峰，pH维持在2.5～4.5。

生产木聚糖酶的液体发酵方法为：

(1)产木聚糖酶的碳源为乳糖、棉子糖、甘露糖和木糖、麸皮浸出液和木聚糖，氮源为酵母膏和牛肉膏。

(2)产酶促进剂：加入0.1～5.0％吐温80、吐温20和甜菜碱使β-葡聚糖酶和木聚糖酶酶活性提高0.5～5.0倍。

(3)产酶时间：发酵20～30h后，微生物开始分泌木聚糖酶，至40～50h达到高峰，pH维持在2.5～4.5。

4 固体发酵生产工艺

以麸皮为主要原料生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的固体发酵方法为：

(1)一级种子(试管斜面种子)：从原始菌种接种至试管PDA固体培养基，28～32℃培养20～40hr

(2)二级种子(试管液体种子)：从一级种子接种至试管PDA液体培养基，28～32℃培养20～40hr

(3)三级种子(三角瓶液体种子)：从二级种子接种至含50～150ml 5～20％麸皮浸出液培养基的三角瓶中，28～32℃培养20～34hr

(4)培养基配制：麸皮和稻壳混合原料经粉碎后加入等比例水，0.11Mpa灭菌50min，冷却。

(5)发酵：培养基按1～10％的比例接入三级种子，培养基含水量控制在45～55％，发酵室内相对湿度保持在85％以上，pH范围为4.5～5.0，温度维持在28～35℃，通风发酵32～50hr。

(6)培养物在35～45℃干燥，粉碎，加入配料，混合后包装。

5 实施例

(1)液体发酵

斜面培养基：PDA培养基和10％麸皮浸出液，2％琼脂，自然pH，121℃高压灭菌30min。

营养盐组成(％)：KH₂PO₄，0.1；MgSO₄.7H₂O，0.5；CaCl₂，0.01；NaCl，0.01；FeSO₄.7H₂O，0.005；MnSO₄.H₂O，0.0016；ZnSO₄.7H₂O，0.0014；CoCl₂，0.002。

培养基：在营养盐溶液中加入5％麸皮浸出液、1％酵母膏和0.1％P8(吐温80)、0.1％P2(吐温20)和0.1％PB(甜菜碱)，调pH5.0。

培养条件：250ml三角瓶装入培养基100ml，用孢子悬液接种1.0ml，100r/min旋转式振摇，在32℃下培养40h。

酶活性：β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性达500U/ml和400U/ml。

(2)固体发酵

a一级种子(试管斜面种子)：从原菌种接种至PDA固体培养基，30℃培养24hr

b二级种子(试管液体种子)：从一级种子接种至PDA液体培养基，30℃培养24hr

c三级种子(三角瓶液体种子)：从二级种子接种至5％麸皮浸出液培养基，30℃培养24hr

d培养基配制：原料(麸皮∶稻壳＝9∶1)经粉碎后加入等比例水，0.11Mpa灭菌50min，冷却至30℃。

e发酵：培养基按5％的比例接入三级种子，32℃通风发酵32hr。

f酶活测定：β-葡聚糖酶25000u/g，木聚糖酶20000u/g

(3)液体发酵

斜面培养基：PDA培养基和10％麸皮浸出液，2％琼脂，自然pH，121℃高压灭菌30min。

营养盐组成(％)：KH₂PO₄，0.1；MgSO₄.7H₂O，0.5；CaCl₂，0.01；NaCl，0.01；FeSO₄.7H₂O，0.005；MnSO₄.H₂O，0.0016；ZnSO₄.7H₂O，0.0014；CoCl₂，0.002。

培养基：在营养盐溶液中加入1％木聚糖、1％牛肉膏和5％P8(吐温80)、5％P2(吐温20)和5％PB(甜菜碱)，调pH5.0。

培养条件：250ml三角瓶装入培养基100ml，用孢子悬液接种1.0ml，100r/min旋转式振摇，在32℃下培养40h。

酶活性：β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性达610U/ml和480U/ml。

(4)固体发酵

a一级种子(试管斜面种子)：从原菌种接种至PDA固体培养基，32℃培养40hr

b二级种子(试管液体种子)：从一级种子接种至PDA液体培养基，32℃培养40hr

c三级种子(三角瓶液体种子)：从二级种子接种至20％麸皮浸出液培养基，30℃培养40hr

d培养基配制：原料(麸皮∶稻壳＝8∶2)经粉碎后加入等比例水，0.11Mpa灭菌50min，冷却。

e发酵：培养基按5％的比例接入三级种子，32℃通风发酵50hr。

f酶活测定：β-葡聚糖酶35000u/g，木聚糖酶30000u/g

6 木聚糖酶活性测定

(1)定义

活力单位(BU)：每秒钟产生1纳摩尔木糖。酶量定义为1单位木聚糖酶活(1BU＝1nkut)。

(2)原理

木聚糖酶能水解木聚糖，并产生木糖。木糖和3.5-二硝基水杨酸反应显色后可用比色法测定。

(3)试剂和溶液

柠檬酸缓冲液(0.05mol/L，pH5.3)：称取10.5g柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)溶解于约800ml蒸馏水中，用1mol/L的NaOH将pH调至5.3(约需110ml NaOH)，再用蒸馏水定容至1升。

底物：称取1.00g木聚糖加入80mL预热至60℃的柠檬酸溶液，再加热至沸点，同时磁力搅拌直至溶解，然后边冷却边搅拌，室温放至过夜，最后用柠檬酸缓冲液定容至100mL。

DNS试剂：称取50.00g 3.5-二硝基水杨酸溶解于4.0L水。一边不断地搅拌一边逐渐加入80.0g NaOH，让其溶解。然后逐渐加入1500g酒石酸钾钠，可加热至45℃，冷却后在5.0L的容量瓶中定容。室温存放在棕色瓶中。

(4)仪器设备：水浴锅，旋锅振荡器，分光光度计，磁力搅拌器

(5)分析步骤

a称样称量为200-600mg，样品用柠檬酸缓冲液溶解。应适当稀释使吸光值在0.10-0.70(540nm)之间为佳。

b酶活测定在试验管和空白中各加入1.8ml底物，50℃水浴中预热5min。在试验管中加200μl已稀释的样品摇匀。精确反应5分钟后，两个管中都加入3.0ml DNS试剂。在空白管中再加入200μl样品。将两个试管同时放入沸水浴。沸水浴5分钟取出试管，冷却至室温。然后以空白为对照在540nm处测定样品的吸光值。从标准曲线上读出酶活，并乘上稀释因子。

c标准曲线配制好10μmol/mL木糖母液(150mg木糖溶解于柠檬酸缓冲液中，定容至100ml)。用柠檬酸缓冲液稀释母液，稀释倍数如下：

稀释倍数     木糖浓度(μmol/ml)     木聚糖酶活力(BU/ml)

1∶1                10.0                  33.30

1∶2                5.00                  16.70

1∶3                3.33                  11.00

1∶5                2.00                  6.70

每个标准液做三个重复，各试管中加入1.8ml底物，再加200μl标准稀释液，后面操作步骤和样品测定相同。空白为加入200μl柠檬酸缓冲液而代替加入200μl标准液。

(6)酶活计算方法

$=\frac{X\×1000\·n}{300\·W}$

U：酶活力(U/g)，X：样品吸光度在标准曲线上所查得的木糖浓度(μmol/ml)1000：μmol转化成nmol，n：稀释倍数，300：反应时间(s)，W：样品重量(g)

7 β-葡聚糖酶活性测定

(1)定义

活力单位(BU)：每秒钟产生1纳摩尔还原糖(葡萄糖)的酶量定义为1单位β-葡聚糖酶活(1BU＝1nkut)。

(2)原理

β-葡聚糖酶(1，3-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶)能水解从大麦中提取的葡聚糖，并产生还原糖。还原糖和3.5-二硝基水杨酸反应显色后可用比色法测定。

(3)试剂和溶液

醋酸缓冲液(0.1mol/L，pH4.8)用0.10mol/L的醋酸将醋酸钠溶液(13.6g/L的CH₃COONa·3H₂O)的pH调至4.8(每L溶液约需700mL醋酸)。

底物称取1.00g β-葡聚糖(大麦β-葡聚糖)溶解于6ml的乙醇中，加90ml醋酸缓冲液。边加热边磁力搅拌直至溶解(约10分钟，冷却后用陶质过滤器G2过滤)。底物在+4℃下可保存一周。

DNS试剂称取50.00g 3.5-二硝基水杨酸溶解于4.0升水。一边不断地搅拌一边逐渐加入80.0g NaOH，让其溶解。然后逐渐加入1500g酒石酸钾钠，可加热至45℃，冷却后在5.0升的容量瓶中定容。室温存放在棕色瓶中。

(4)仪器设备：水浴锅，旋锅振荡器，分光光度计，磁力搅拌器

(5)分析步骤

a取样：样品用醋酸缓冲液溶解。称量为200-600mg。应适当稀释使吸光值在0.10-0.70(540nm)之间为佳。

b酶活测定

在试验管和空白中各加入1.8ml底物，50℃水溶中预热5min。在试验管中加200μl已稀释的样品摇匀。精确反应10分钟后，两个管中都加入3.0ml DNS试制。在空白管中再加入200μl样品。将两个试管同时放入沸水浴。沸水浴5分钟取出试管，冷却至室温，加20mL水混匀，然后以空白为对照在540nm处测定样品的吸光值。从标准曲线上读出酶活，并乘上稀释因子。

c标准曲线：配制好0.078mmol/mL葡萄糖母液(1.405g葡萄糖溶解于醋酸缓冲液中，定容至100ml)。用醋酸缓冲液稀释母液，稀释倍数如下：

稀释倍数           葡葡萄糖浓度        β-葡聚糖酶活力

                   (μmol/ml)             (BU/ml)

  1∶2                39                  65.00

  1∶3                26                  43.33

  1∶6                13                  21.67每个标准液做三个重复，各试管中加入1.8ml底物，再加200μl标准稀释液，后面操作步骤和样品测定相同。空白为加入200μl醋酸缓冲液而代替加入200μl标准液。

(6)酶活计算方法：

$=\frac{X\×1000\·n}{600\·W}$

U：酶活力(U/g)，X：样品吸光度在标准曲线上所查得的葡萄糖浓度(μmol/ml)1000：μmol转化成nmol，n：稀释倍数，600：反应时间(s)，W：样品重量(g)

Claims (6)

1.一种里氏木霉菌株GXC(Trichoderma reesei)，其特征在于保藏号为CCTCC NO：M202017的菌株在PDA固体培养基上生长，形成的菌落特征为菌落呈棉絮状，菌落呈淡绿色，菌落扁平，高0.1～0.75毫米，菌落边缘白色，整齐；生长速度快，48小时菌落直径达1.0～8.5毫米，72小时达30～50毫米；菌丝白色，有隔膜，菌丝壁光滑，直径在2.0～5.0微米，分生孢子梗从菌丝的短侧枝发生，侧枝上对生，分生孢子梗呈瓶状，直立，无色，孢子呈球形，绿色，直径20～100微米。

2.一种里氏木霉菌株GXC(Trichoderma reesei)，保藏号为CCTCC NO：M202017菌株的用途，其特征在于该菌株用于生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶。

3.根据权利要求2所述的一种里氏木霉菌株GXC(Trichoderma reesei)，保藏号为CCTCC NO：M202017菌株的用途，其特征在于所说生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的pH分别为3.5～6.0和3.0～6.0，温度均为15～35℃。

4.根据权利要求2所述的一种里氏木霉菌株GXC(Trichoderma reesei)，保藏号为CCTCC NO：M202017菌株的用途，其特征在于所说生产β-葡聚糖酶的液体发酵方法为：

1)产β-葡聚糖酶的碳源为麸皮和木聚糖，氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和酵母膏；

2)产酶促进剂：加入0.1～5.0％吐温80、吐温20和甜菜碱使β-葡聚糖酶和木聚糖酶酶活性提高0.5～5.0倍；

3)产酶时间：发酵20～30小时后，微生物开始分泌β-葡聚糖酶，至40～50小时酶活性达到高峰，pH维持在2.5～4.5。

5.根据权利要求2所述的一种里氏木霉菌株GXC(Trichoderma reesei)，保藏号为CCTCC NO：M202017菌株的用途，其特征在于所说生产木聚糖酶的液体发酵方法为：

1)产木聚糖酶的碳源为乳糖、棉子糖、甘露糖和木糖、麸皮浸出液和木聚糖，氮源为酵母膏和牛肉膏；

2)产酶促进剂：加入0.1～5.0％吐温80、吐温20和甜菜碱使β-葡聚糖酶和木聚糖酶酶活性提高0.5～5.0倍；

3)产酶时间：发酵20～30小时后，微生物开始分泌木聚糖酶，至40～50小时达到高峰，pH维持在2.5～4.5。

6.根据权利要求4所述的一种里氏木霉菌株GXC(Trichoderma reesei)，保藏号为CCTCC NO：M202017菌株的用途，其特征在于以麸皮为主要原料生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的固体发酵方法为：

1)一级种子：从原始菌种接种至试管PDA固体培养基，28～32℃培养20～40小时；

2)二级种子：从一级种子接种至试管PDA液体培养基，28～32℃培养20～40小时；

3)三级种子：从二级种子接种至三角瓶含50～150毫升5～20％麸皮浸出液培养基，28～32℃培养20～40小时；

4)培养基配制：麸皮和稻壳混合原料经粉碎后加入等比例水，0.11Mpa灭菌30～50分钟，冷却；

5)发酵：培养基按1～10％的比例接入三级种子，培养基含水量控制在45～55％，发酵室内相对湿度保持在85％以上，pH范围为4.5～5.0，温度维持在28～35℃，通风发酵32～50小时；

6)培养物在35～45℃干燥，粉碎，加入配料，混合后包装。