CN1740327A - 一种动植物和微生物细胞壁溶解酶反应液及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种动植物和微生物细胞壁溶解酶反应液，属于细胞工程中酶解技术领域。其特征在于该反应液包括细胞壁溶解酶、原生质液、酶促进剂、无机盐、矿泉水和辅料。该细胞壁溶解酶反应液无毒，生物降解性好，可将原料中的有效成分和化学成分进行有效的提取，由于对动植物和微生物原料的酶解发酵，产物的分子结构起了根本性的变化，使细胞内的小分子蛋白、游离氨基酸、亚麻酸和多肽等生物活性物质质量大大提高，更容易被人体吸收。该细胞壁溶解酶反应液对动植物特别是动物、绿色植物、藻类植物以及微生物均具有较高的破壁率和优异的破壁效果，可以广泛的应用于医药、保健、食品和饮料等领域中对动植物以及微生物原料中的有效成分和化学成分的有效提取。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程中酶解技术领域，特别涉及一种对动植物和微生物细胞壁有强烈破壁作用的溶解酶反应液组合物。
背景技术
多数动植物特别是绿色植物、海洋动物、藻类植物和微生物细胞内含有多种细胞活性成分，并具有多方面的保健、医疗作用。如灵芝孢子、蜂花粉、小球藻、人参、黄芪、长春花、鲨鱼软骨素等。由于上述物质的细胞壁结构致密，在人体内消化困难，使有效成分难以被机体吸收利用，必须通过细胞破壁技术使细胞内的活性成分得到有效应用。目前比较先进的细胞破壁技术为选用酶制剂进行酶解的方法。
植物细胞壁主要是由纤维素、半纤维素、果胶质等所构成，溶解植物细胞壁的酶通常称为植物组织崩解酶，主要是由纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶组成。而微生物的细胞壁不同于植物细胞壁，微生物和动物的细胞壁构造复杂的多，而且不同动物或微生物的细胞壁结构也不同，须用不同类型的酶方能溶解，常用的可分为细菌细胞壁溶解酶、酵母和霉菌细胞壁溶解酶等三种。在美国虽然也有研制细胞壁溶解酶用于微生物破壁，但重金属含量与安全性均存在问题。因此，这类产品仅仅使用在分子生物学分析、研究上，且价格昂贵，折合人民币约每公斤42万元，没有任何推广和使用价值。国内曾有用于特定某种植物细胞壁破壁用酶技术的记载，如2004年6月2日公开的中国专利申请02148743.X提供了一种获取灵芝孢子活性成分的方法，针对灵芝孢子细胞壁结构组成选用内-β-1，3-葡聚糖酶、蛋白酶或/和壳多糖酶进行破壁的技术；2004年9月1日公告的中国专利ZL02112655.0涉及小球藻生长因子提取方法，它通过小球藻温浴后先用果胶酶使小球藻细胞壁发生水解反应，然后再加入核酸酶和蛋白酶使其水解为小球藻精的混合物。上述破壁技术都只能对单一一种植物的细胞壁进行破壁，不能通用，而且破壁前需要对植物体进行加工处理，破壁时间较长，破壁酶的活性低，破壁率低。目前还没有同时可以对动植物、藻类和微生物原料进行破壁的酶反应物质。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时用于动植物特别是绿色植物和藻类植物、动物以及微生物细胞破壁的细胞壁溶解酶反应液，能够把动植物和微生物细胞内的有效药物成分和营养成分释放出来，达到高度的提取率。
本发明采用的技术方案如下：
一种动植物和微生物细胞壁溶解酶反应液，其特征在于该反应液包括细胞壁溶解酶、原生质液、酶促进剂、无机盐、矿泉水和辅料。
该细胞壁溶解酶反应液的重量百分比组成为：
细胞壁溶解酶 2-5％ 原生质液 5-50％ 酶促进剂 5-10％
无机盐 1-16％ 矿泉水 10-70％ 辅料 5-25％
所述的细胞壁溶解酶是用枯草杆菌Bacillus Subtilis K-77或枯草杆菌Bacillus Subtilis YT-25为菌种，以灵芝孢子粉、松花粉或油菜花粉做培养基，采用常规酶生产工艺制备的溶解酶。
所述的细胞壁溶解酶是用蜡状芽孢杆菌BM Cirlulans AL.1.为菌种，以灵芝孢子粉、松花粉或油菜花粉做培养基，采用常规酶生产工艺制备的溶解酶。
所述的原生质液为从水果、蔬菜、蛋类、豆类和奶类中榨取或提取的汁液中的一种、任两种或两种以上混合物，包括玉米浆、胡萝卜汁、蛋清、苹果汁、梨汁、青菜汁、苦瓜汁、豆油、白菜汁、莲子汁、豆芽汁、大豆汁、冬瓜汁、海带汁、牛乳中的一种、任两种或两种以上混合物。
所述的酶促进剂为酵母膏或/和吐温80或/和红曲粉。
所述的无机盐为KH2PO4、K2HPO4中的一种或两种与(NH4)2HPO4、KNO3、MgSO4·7H2O、Na2SO4、ZnSO4、CaCl2、CaSO4、(NH4)2SO4、NH4NO3、KCl、FeSO4、NaCl、MnSO4、CaCO3、NaNO3中的任一种、两种或两种以上的混合物。
所述的辅料为蛋白胨、蛋白粉、甘油、葡萄糖、蜂王浆、琼脂、乳酸、白糖、红糖、柠檬酸中的一种、任两种或两种以上的混合物。
所述的矿泉水为市售饮用矿泉水。
本发明还涉及该动植物和微生物细胞壁溶解酶反应液在动物细胞破壁、植物细胞破壁、藻类植物细胞破壁和微生物细胞破壁中的应用。。
所述的植物和微生物细胞壁溶解酶反应液在动物细胞破壁、植物细胞破壁、藻类植物细胞破壁和微生物细胞破壁中的应用方法，其特征在于将动物、植物、藻类植物或微生物原料放入发酵罐中，与细胞壁溶解酶反应液混合后发酵至PH值为3.5-6.2，其中原料干物质与细胞壁溶解酶反应液的质量比为1∶0.05～0.15。
该细胞壁溶解酶是以枯草杆菌(Bacillus Subtilis)、蜡状芽孢杆菌(BMCirlulans)为菌种培育的，枯草杆菌为芽孢杆菌属(Lactobacillus)的一种，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故此得名。蜡状芽孢杆菌为肠杆菌属(Enter Dolacter)。本发明选用的菌种为枯草杆菌Bacillus SubtilisK-77、枯草杆菌Bacillus Subtilis YT-25、蜡状芽孢杆菌BM Cirlulans AL.1.。上述酶的生产方法可以按常规方法生产，生产方法见《酶制剂工业》(张树政主编，科学出版社1989年出版)。
该细胞壁溶解酶可使细胞壁崩解，使动植物和微生物细胞自溶，从而把动植物药物、藻类植物和微生物药物的有效药物成分和营养成分从细胞液中释放出来，达到高度的提取率。
原生质液是从水果、蔬菜、蛋类、豆类和奶类中榨取或提取出来的汁液，在反应液中主要作为生长素，生长素对酶是必需的。这些与酵母酵解活性有关的生长素中的成分成为辅酶，它本身不是酶，也不是蛋白质，通常为菸酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和菸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，NAD、NADP以及其它与氧化还原酶有关的辅酶起着氢供体或氧受体的作用。它是一种中间体，没有这些中间体，酶解无法进行下去，这就是为什么有些酶活性很高但酶解效果不好的原因。
酶促进剂属于酶的诱导物或表面活性剂，能增加产酶速度提高酶解反应速度。所述的无机盐为含微量元素的无机盐，无机盐中的金属离子对于酶解的影响是多方面的，磷是构成核酸、磷脂的成分，并参与腺三磷(ATP)和鸟三磷(GTP)在内的所有能量转移反应，同时也是许多酶的活性基团成分，因为有机发酵原料中的磷量往往不能满足酶解需要，必须补充添加，磷在本发明使用的无机盐中是不可缺少的元素；硫是菌体蛋白中含硫氨基酸加胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等的组成部分。也是辅酶的组成部分；钾以离子状态存在于菌种中，其作用是控制细胞内原生质的胶体状态和细胞膜得透性作用；酶以离子状态存在菌种中，对细胞壁溶解酶的活性有促进作用；钙可以起到控制细胞透性调酸等作用，对细胞壁溶解酶的活性起到稳定和活化作用；金属钠可促进酶的产量。硝酸铵和其他硝酸盐和铵盐还能够增加氮，实现碳氮比平衡。
辅料的主要作用是调节碳和氮的比例，促进发酵，稳定pH值。
该细胞壁溶解酶反应液的制备方法是：将细胞壁溶解酶、原生质液、酶促进剂、无机盐、辅料和矿泉水按比例混合即可。
该细胞壁溶解酶反应液在应用时，可将动植物、藻类植物和微生物原料进行常规的卫生加工和粉碎，其粉碎细度达到60目即可，需要消毒的原料可以置于紫外灯下照射3小时，必要时可以在乳酸溶液中浸制24小时。将细胞壁溶解酶反应液和待处理原料放入发酵罐中，充分搅拌后发酵，一般保持发酵的温度不能超过37℃，发酵全过程为72-96小时，当PH值在3.5-6.2之间时即为发酵破壁后的合格成品。其中原料干物质与细胞壁溶解酶反应液的质量比最好为1∶0.05～0.15。
本发明的有益效果在于，该细胞壁溶解酶反应液无毒，生物降解性好，通过对动植物和微生物原料酶解和发酵，可将原料中的有效成分和化学成分进行有效的提取，由于对动植物和微生物原料的酶解发酵，产物的分子结构起了根本性的变化，使细胞内的小分子蛋白、游离氨基酸、亚麻酸和多肽等生物活性物质质量大大提高，更容易被人体吸收。该细胞壁溶解酶反应液对动植物特别是动物、绿色植物、藻类植物以及微生物均具有较高的破壁率和优异的破壁效果，可以广泛的应用于医药、保健、食品和饮料等领域中对动植物以及微生物原料中的有效成分和化学成份的有效提取。
具体实施方式
实施例1 一、细胞壁溶解酶的制备：
以枯草杆菌Bacillus Subtilis K-77为选育菌种，以蜂花粉为培养基，培养基配方：松花粉75％，米糠或麸皮23％，蔗糖1％，石膏粉1％，水料比1.5∶1。
培育条件和培育方法：(1)将培养基拌匀，培养料的含水量达65％左右；(2)培养料拌均匀后装入发酵罐，发酵罐温度控制在30℃～37℃之间，加入栽培菌种，发酵时间72小时，PH值3.0～4.0；(3)通气、搅拌、每8个小时搅拌1次；(4)发酵后过滤，去渣、取上清液；(5)上清液加硫酸铵沉淀，取沉淀物；(6)在60℃以下的烘干箱中烘干，即得酶粗粉。
按下列重量百分比和组成取细胞壁溶解酶、原生质液、酶促进剂、无机盐、矿泉水和辅料并混合制得细胞壁溶解酶反应液：
1.原生质液5％，其中菠菜汁2％，苦瓜汁1％，鸡蛋清2％；
2.酶促进剂6.5％，其中酵母膏3％，吐温80 1.5％，红曲粉2％；
3.无机盐7.4％，其中KH2PO4 0.1％，K2HPO4 0.1％，MgSO4·7H2O 1.5％，Na2SO4 4.5％，(NH4)2SO4 0.7％，KCl 0.5％；
4.细胞壁溶解酶2％；
5.辅料9.1％，其中蛋白胨2％，葡萄糖6％，蛋白粉1.1％；
6.矿泉水70％。
二、细胞壁溶解酶反应液对蜂花粉的细胞破壁
使用上述制备的细胞壁溶解酶反应液对蜂花粉(福建农林大学产)进行破壁处理，将经过卫生加工、烘干和紫外线消毒的蜂花粉放入发酵罐中，与细胞壁溶解酶反应液混合后常温常压发酵至PH值为3.5-6.2，控制发酵温度不高于37℃，其中原料干物质与细胞壁溶解酶反应液的质量比为1∶0.05。
对破壁后的蜂花粉进行细胞破壁率以及多糖、活性蛋白含量进行分析，并同时对天然蜂花粉进行上述分析，分析项目和数据结果见表一。
表一 天然蜂花粉经细胞壁溶解酶反应液破壁前后的各项数据分析
| 项目 | 天然蜂花粉 | 破壁后蜂花粉 |
| 多糖 | 0.9％ | 2.4％ |
| 蛋白质 | 17％ | 32％ |
| 破壁率 | 0 | 97％ |
由表一可以看出，细胞壁溶解酶反应液利用细胞壁溶解酶的破壁作用对花粉细胞壁起崩解作用，能充分提取细胞质内的各种有效成分，利用酶的活性还能加强花粉多糖蛋白的生物代谢，使天然蜂花粉活性蛋白提高30％，细胞破壁率达97％。
实施例2 以实施例1的方法制备细胞壁溶解酶，只是其中的培养基原料松花粉用灵芝孢子粉代替，并按下列重量百分比和组成取细胞壁溶解酶、原生质液、酶促进剂、无机盐、矿泉水和辅料并混合制得细胞壁溶解酶反应液：
1.原生质液10％，为苹果汁；
2.酶促进剂10％，其中吐温80 5％，红曲粉5％；
3.无机盐3％，其中KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.2％，NH4NO3 1.4％，CuSO4 0.2％，KCl 0.5％，ZnSO4 0.2％，FeSO4 0.2％，MnSO4 0.2％；
4.细胞壁溶解酶2％；
5.辅料9％，其中红糖3.6％，琼脂2％，柠檬酸3.4％；
6.矿泉水66％。
使用上述制备的细胞壁溶解酶反应液对灵芝孢子粉进行破壁处理，将经过卫生加工、烘干和紫外线消毒的原料放入发酵罐中，与细胞壁溶解酶反应液混合后常温常压发酵至PH值为3.5-6.2，控制发酵温度不高于37℃，其中原料干物质与细胞壁溶解酶反应液的质量比为1∶0.15。
辅料是米糖或麸皮、蔗糖、石膏粉。
对破壁后的粉剂进行进行细胞破壁率以及多糖、活性蛋白含量进行分析，并同时对天然的原料进行上述分析，分析项目和数据结果见表二。
表二 灵芝孢子粉经细胞壁溶解酶反应液破壁前后的各项数据分析
| 项目 | 灵芝孢子粉(原料) | 灵芝孢子粉(酶解物) |
| 破壁率 | 0 | 61％ |
| 多糖 | 2.13％ | 8.6％ |
| 活性蛋白 | 7.8％ | 28.4％ |
实施例3 以实施例1的方法制备细胞壁溶解酶，但选用的菌种为枯草杆菌Bacillus Subtilis YT-25，培养基原料松花粉用油菜花粉代替，按下列重量百分比和组成取细胞壁溶解酶、原生质液、酶促进剂、无机盐、矿泉水和辅料并混合制得细胞壁溶解酶反应液：
1.原生质液32.6％，其中大豆汁5％，玉米浆5％，梨汁10％，苹果汁10％，蛋清2.6％；
2.酶促进剂10％，为吐温80；
3.无机盐1％，其中KH2PO4 0.2％，NaCl 0.3％，(NH4)2SO4 0.5％；
4.细胞壁溶解酶2％；
5.辅料10.4％，其中琼脂2％，柠檬酸3.4％，蛋白胨5％；
6.矿泉水49％。
使用上述制备的细胞壁溶解酶反应液对银杏叶进行破壁处理，将经过卫生加工、烘干和紫外线消毒的原料放入发酵罐中，与细胞壁溶解酶反应液混合后常温常压发酵至PH值为3.5-6.2，控制发酵温度不高于37℃，其中原料干物质与细胞壁溶解酶反应液的质量比为1∶0.1。
对破壁后的粉剂进行进行细胞破壁率以及黄酮和内脂含量进行分析，并同时对天然原料粉进行上述分析，分析项目和数据结果见表三。
表三 银杏叶经细胞壁溶解酶反应液破壁前后的各项数据分析
| 项目 | 原料粉 | 酶解粉 |
| 破壁率 | 18％ | 99％ |
| 黄酮 | 4.9％ | 24％ |
| 内脂 | 0.13％ | 6％ |
实施例4 以实施例1的方法制备细胞壁溶解酶，并按下列重量百分比和组成取细胞壁溶解酶、原生质液、酶促进剂、无机盐、矿泉水和辅料并混合制得细胞壁溶解酶反应液：
1.原生质液10％，为胡萝卜汁；
2.酶促进剂10％，其中吐温80 5％，红曲粉5％；
3.无机盐7％，其中MgSO4·7H2O 1％，KH2PO4 2％，(NH4)2HPO4 2％，KCl 1％，NH4NO3 2％；
4.细胞壁溶解酶4％；
5.辅料24％，其中琼脂2％，柠檬酸20％，蛋白胨2％；
6.矿泉水45％。
使用上述制备的细胞壁溶解酶反应液对长春花进行破壁处理，将经过卫生加工、烘干和紫外线消毒的原料放入发酵罐中，与细胞壁溶解酶反应液混合后常温常压发酵至PH值为3.5-6.2，控制发酵温度不高于37℃，其中原料于物质与细胞壁溶解酶反应液的质量比为1∶0.05。
对破壁后的粉剂进行进行细胞破壁率以及长春花碱含量进行分析，并同时对天然长春花粉进行上述分析，分析项目和数据结果见表四。
表四 长春花粉经细胞壁溶解酶反应液破壁前后的各项数据分析
| 项目 | 原料粉 | 酶解粉 |
| 破壁率 | 8％ | 99％ |
| 长春花碱 | 2.3％ | 18.9％ |
实施例5 以实施例1的方法制备细胞壁溶解酶，但选用的菌种为枯草杆菌Bacillus Subtilis YT-25，培养基原料松花粉用油菜花粉代替，按下列重量百分比和组成取细胞壁溶解酶、原生质液、酶促进剂、无机盐、矿泉水和辅料并混合制得细胞壁溶解酶反应液：
1.原生质液50％，其中冬瓜汁30％，海带汁20％；
2.酶促进剂10％，为吐温80；
3.无机盐5.5％，其中NaNO3 3％，KCl 0.5％，FeSO4 0.2％，KH2PO4 1.5％；
4.细胞壁溶解酶3％；
5.辅料5.5％，为柠檬酸；
6.矿泉水26％。
使用上述制备的细胞壁溶解酶反应液对鲨鱼软骨素进行破壁处理，将经过卫生加工、烘干和紫外线消毒的原料放入发酵罐中，与细胞壁溶解酶反应液混合后常温常压发酵至PH值为3.5-6.2，控制发酵温度不高于37℃，其中原料干物质与细胞壁溶解酶反应液的质量比为1∶0.15。
对破壁后的粉剂进行进行细胞破壁率以及胶原蛋白含量进行分析，并同时对天然鲨鱼软骨素进行上述分析，分析项目和数据结果见表五。
表五 鲨鱼软骨素经细胞壁溶解酶反应液破壁前后的各项数据分析
| 项目 | 天然粉 | 酶解粉剂 |
| 破壁率 | 0 | 45％ |
| 胶原蛋白 | 3.8％ | 30.1％ |
实施例6 以实施例1的方法制备细胞壁溶解酶，并按下列重量百分比和组成取细胞壁溶解酶、原生质液、酶促进剂、无机盐、矿泉水和辅料并混合制得细胞壁溶解酶反应液：
1.原生质液50％，其中蛋清10％，牛乳10％，菠萝汁10％，大豆油5％，玉米浆5％；
2.酶促进剂10％，为吐温80；
3.无机盐1％，为KH2PO4；
4.细胞壁溶解酶2％；
5.辅料18％，其中蛋白胨5％，甘油2％，红糖6％，葡萄糖5％；
6.矿泉水19％。
使用上述制备的细胞壁溶解酶反应液对黄芪进行破壁处理，将经过卫生加工、烘干和紫外线消毒的原料放入发酵罐中，与细胞壁溶解酶反应液混合后常温常压发酵至PH值为3.5-6.2，控制发酵温度不高于37℃，其中原料干物质与细胞壁溶解酶反应液的质量比为1∶0.08。
对破壁后的粉剂进行进行细胞破壁率以及多糖、活性蛋白含量进行分析，并同时对天然黄芪粉进行上述分析，分析项目和数据结果见表六。
表六 黄芪经细胞壁溶解酶反应液破壁前后的各项数据分析
| 项目 | 天然粉 | 酶解粉 |
| 破壁率 | 0 | 53％ |
| 多糖 | 4.7％ | 14.5％ |
| 活性蛋白 | 7.8％ | 24.6％ |
实施例7 以实施例1的方法制备细胞壁溶解酶，但选用的菌种为枯草杆菌Bacillus Subtilis YT-25，培养基原料松花粉用灵芝孢子粉代替，并按下列重量百分比和组成取细胞壁溶解酶、原生质液、酶促进剂、无机盐、矿泉水和辅料并混合制得细胞壁溶解酶反应液：
1.原生质液20％，其中牛乳5％，白菜汁10％，莲子汁5％；
2.酶促进剂6％，为吐温80；
3.无机盐10％，其中K2HPO4 1％，NaCl 1％，NaNO3 4％，ZnSO4 2％，NaSO4；
4.细胞壁溶解酶5％；
5.辅料9％，其中琼脂2％，葡萄糖5％，柠檬酸2％；
6.矿泉水50％。
使用上述制备的细胞壁溶解酶反应液对人参进行破壁处理，将经过卫生加工、烘干和紫外线消毒的原料放入发酵罐中，与细胞壁溶解酶反应液混合后常温常压发酵至PH值为3.5-6.2，控制发酵温度不高于37℃，其中原料干物质与细胞壁溶解酶反应液的质量比为1∶0.12。
对破壁后的粉剂进行进行细胞破壁率以及皂甙含量进行分析，并同时对天然人参粉进行上述分析，分析项目和数据结果见表七。
表七 人参粉经细胞壁溶解酶反应液破壁前后的各项数据分析
| 项目 | 天然粉 | 酶解粉 |
| 破壁率 | 0 | 97％ |
| 皂甙 | 13％ | 65％ |
实施例8 以实施例1的方法制备细胞壁溶解酶，并按下列重量百分比和组成取细胞壁溶解酶、原生质液、酶促进剂、无机盐、矿泉水和辅料并混合制得细胞壁溶解酶反应液：
1.原生质液15％，其中苹果汁10％，豆芽汁5％；
2.酶促进剂5％，为酵母膏；
3.无机盐3％，其中KH2PO4 1％，K2HPO4 1％，(NH4)2SO4 0.5％，MnSO4 0.5％，CaCl 1.0％，CaSO4 1.0％；
4.细胞壁溶解酶5％；
5.辅料22％，其中蛋白胨5％，酵母膏5％，葡萄糖5％，白糖5％，乳酸5％；
6.矿泉水50％。
使用上述制备的细胞壁溶解酶反应液对枸杞进行破壁处理，将经过卫生加工、烘干和紫外线消毒的原料放入发酵罐中，与细胞壁溶解酶反应液混合后常温常压发酵至PH值为3.5-6.2，控制发酵温度不高于37℃，其中原料干物质与细胞壁溶解酶反应液的质量比为1∶0.05。
对破壁后的粉剂进行进行细胞破壁率以及多糖、活性蛋白含量进行分析，并同时对天然_枸杞粉进行上述分析，分析项目和数据结果见表八。
表八 枸杞经细胞壁溶解酶反应液破壁前后的各项数据分析
| 项目 | 天然粉 | 酶解粉 |
| 破壁率 | 45％ | 99％ |
| 多糖 | 28％ | 68％ |
对比例1 按常规煎煮中药方法提取灵芝孢子粉煎煮液，然后取同重量的灵芝孢子采用实施例2提供的方法经过细胞壁溶解酶制备的灵芝孢子发酵酶解产物，用比色法(BECKMAN DU-640紫外/可见分光光度计)分析二者产物中的灵芝多糖含量，可知，采用本发明细胞壁溶解酶反应液酶解的灵芝多糖提取率是常规煎煮中药方法的4倍。
对比例2 将松花粉按常规煎煮的方法提取松花粉煎煮液，然后取同重量的松花粉采用实施例1提供的工艺处理得到灵芝孢子发酵酶解产物，比较两种方法提取产物中花粉蛋白的收取率，结果表明采用本发明提供的细胞壁溶解酶反应液处理的花粉蛋白的提取率是常规煎煮方法的2.2倍。
实施例9 以蜡状芽孢杆菌BM Cirlulans AL.1.为菌种进行选育，培育条件和培育方法：培养基配方：松花粉75％ 米糠或麸皮23％ 蔗糖1％ 石膏粉1％水料比1.5∶1。培育条件和培育方法：(1)将培养基拌，培养料的含水量达65％左右；(2)料拌均匀后装入发酵罐，发酵罐温度控制在30℃～37℃之间，加入栽培种，发酵时间72小时，PH值3.0～4.0；(3)通气、搅拌、每8个小时搅拌1次；(4)发酵后过滤，去渣、取上清液；(5)上清液加硫酸胺沉淀，取沉淀物；(6)在60℃以下的烘干箱中烘干，即得酶粗粉。
制备细胞壁溶解酶后，按下列重量百分比和组成取该细胞壁溶解酶、原生质液、酶促进剂、无机盐、矿泉水和辅料并混合制得细胞壁溶解酶反应液：
1.原生质液15％，其中苹果汁10％，豆芽汁5％；
2.酶促进剂5％，为吐温80；
3.无机盐3％，其中KH2PO4 1％，K2HPO4 1％，(NH4)2SO4 0.5％，MnSO4 0.5％，MgSO4·7H2O 2％，；
4.细胞壁溶解酶5％；
5.辅料22％，其中蛋白胨5％，甘油5％，葡萄糖5％，白糖5％，乳酸5％；
6.矿泉水50％。
使用上述制备的细胞壁溶解酶反应液对灵芝孢子粉进行破壁处理，将经过卫生加工、烘干和紫外线消毒的原料_放入发酵罐中，与细胞壁溶解酶反应液混合后常温常压发酵至PH值为3.5-6.2，控制发酵温度不高于37℃，其中原料干物质与细胞壁溶解酶反应液的质量比为1∶0.05。
对破壁后的粉剂进行进行细胞破壁率以及_多糖进行分析，并同时对天然枸杞粉进行上述分析，分析项目和数据结果见表九。
表九 枸杞粉经破壁前后的各项数据分析
| 项目 | 天然粉 | 酶解粉 |
| 破壁率 | 0 | 97％以上 |
| 多糖 | 6.8％ | 38％以上 |
实施例10 以实施例9的方法制备细胞壁溶解酶，但选用的培养基原料松花粉用油菜花粉代替，制备细胞壁溶解酶后，按下列重量百分比和组成取该细胞壁溶解酶、原生质液、酶促进剂、无机盐、矿泉水和辅料并混合制得细胞壁溶解酶反应液：
1.原生质液28％，其中胡萝卜汁10％，梨汁10％，豆芽汁5％，玉米浆3％；
2.酶促进剂10％，为吐温80；
3.无机盐2％，其中KH2PO4 1％，(NH4)2SO4 0.5％，MnSO4 0.3％，CaCO3 0.2％，；
4.细胞壁溶解酶2％；
5.辅料25％，其中蜂王浆10％，白糖15％；
6.矿泉水33％。
使用上述制备的细胞壁溶解酶反应液对人参进行破壁处理，将经过卫生加工、烘干和紫外线消毒的原料放入发酵罐中，与细胞壁溶解酶反应液混合后常温常压发酵至PH值为3.5-6.2，控制发酵温度不高于37℃，其中原料干物质与细胞壁溶解酶反应液的质量比为1∶0.12。
对破壁后的粉剂进行进行细胞破壁率以及皂甙含量进行分析，并同时对天然人参粉进行上述分析，分析项目和数据结果见表十。
表十 人参粉经破壁前后的各项数据分析
| 项目 | 天然粉 | 酶解粉 |
| 破壁率 | 0 | 97％以上 |
| 皂甙 | 0.97％ | 18％以上 |
通过以上实施例可以看出，本发明提供的溶解酶反应液能够对蜂花粉、灵芝孢子粉、银杏叶、黄芪、鲨鱼软骨素、长春花粉等动植物细胞以及微生物细胞进行破壁作业，普适性强，破壁效率高，能够有效提高破壁后原料中的有效成分的溶出，提高药用性能。
Claims (8)
1.一种动植物和微生物细胞壁溶解酶反应液，其特征在于该反应液包括细胞壁溶解酶、原生质液、酶促进剂、无机盐、矿泉水和辅料。
2.根据权利要求1所述的动植物和微生物细胞壁溶解酶反应液，其特征在于该反应液的重量百分比组成为：
细胞壁溶解酶 2-5％ 原生质液 5-50％ 酶促进剂 5-10％
无机盐 1-16％ 矿泉水 10-70％ 辅料 5-25％。
3.根据权利要求1或2所述的动植物和微生物细胞壁溶解酶反应液，其特征在于所述的细胞壁溶解酶是以枯草杆菌Bacillus Subtilis K-77或枯草杆菌Bacillus Subtilis YT-25为菌种，以灵芝孢子粉、松花粉或油菜花粉做培养基，采用常规酶生产工艺制备的溶解酶。
4.根据权利要求1或2所述的动植物和微生物细胞壁溶解酶反应液，其特征在于所述的细胞壁溶解酶是用蜡状芽孢杆菌BM Cirlulans AL.1.为菌种，采用常规酶生产工艺制备的溶解酶。
5.根据权利要求1或2所述的动植物和微生物细胞壁溶解酶反应液，其特征在于所述的原生质液为从水果、蔬菜、蛋类、豆类和奶类中榨取或提取的汁液中的一种、任两种或两种以上混合物，包括玉米浆、胡萝卜汁、蛋清、苹果汁、梨汁、青菜汁、苦瓜汁、豆油、白菜汁、莲子汁、豆芽汁、大豆汁、冬瓜汁、海带汁、牛乳中的一种、任两种或两种以上混合物；所述的酶促进剂为酵母膏或/和吐温80或/和红曲粉。
6.根据权利要求1或2所述的动植物和微生物细胞壁溶解酶反应液，其特征在于所述的无机盐为KH2PO4、K2HPO4中的一种或两种与(NH4)2HPO4、KNO3、MgSO4·7H2O、Na2SO4、ZnSO4、CaCl2、CaSO4、(NH4)2SO4、NH4NO3、KCl、FeSO4、NaCl、MnSO4、CaCO3、NaNO3中的任一种、两种或两种以上的混合物；所述的辅料为蛋白胨、蛋白粉、甘油、葡萄糖、蜂王浆、琼脂、乳酸、白糖、红糖、柠檬酸中的一种、任两种或两种以上的混合物。所述的矿泉水为市售饮用矿泉水。
7.权利要求1或2所述的动植物和微生物细胞壁溶解酶反应液在动物细胞破壁、植物细胞破壁、藻类植物细胞破壁和微生物细胞破壁中的应用。
8.权利要求7所述的动植物和微生物细胞壁溶解酶反应液在动物细胞破壁、植物细胞破壁、藻类植物细胞破壁和微生物细胞破壁中的应用方法，其特征在于将动物、植物、藻类植物或微生物原料放入发酵罐中，与细胞壁溶解酶反应液混合后发酵至PH值为3.5-6.2，其中原料干物质与细胞壁溶解酶反应液的质量比为1∶0.05～0.15。
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